Summary
Мы приводим небольшой шпилька РНК (индуцируемый) и на основе последовательности протокол следующего поколения для идентификации регуляторов инактивации х в мышиных клеток линии с Светлячок Люцифераза и гены сопротивления hygromycin сливается с метил белка 2 (CpG) привязки MeCP2) гена на неактивных Х-хромосоме.
Abstract
Вперед генетических экраны с использованием генов репортер, вставляется в гетерохроматин широко использовались для изучения механизмов эпигеномные контроля в модельных организмов. Технологий, включая шпильки короткие РНК (процессируются) и кластерных регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ) позволили такие экраны в диплоидных клетках млекопитающих. Здесь мы описываем крупномасштабных индуцируемый экран для регуляторов инактивации х (XCI), с помощью мышиных ячейки строки с Светлячок Люцифераза и гены сопротивления hygromycin постучал в C-конечной метилового CpG белок 2 гена (MeCP2) на неактивных х (Xi). Возобновление конструкции в строке ячейки репортер возложенным преимущество выживания под hygromycin B отбора, что позволяет нам экран большой индуцируемый библиотеку и идентифицировать шпильками, которые возобновлены репортер, измеряя их после выбора обогащения с помощью Секвенирование нового поколения. Затем, обогащенного заколки индивидуально проверялись путем тестирования их способность активировать Люцифераза репортер на Xi.
Introduction
Один наиболее распространенных форм наследственной умственного расстройства у женщин, синдром Ретта, вызвано гетерозиготных мутации в MeCP2, одну ген, который кодирует белок, необходимых для нормальной функции нейронов1. Потенциальный подход к лечению этого заболевания будет возобновление аллеля дикого типа MeCP2 на Xi, как было показано, что восстановление MeCP2 выражение вспять неврологического дефицита в мышиной модели этой болезни1, 2 , 4. Однако, плотно эпигеномные глушителей одной из две Х-хромосомы в женских клетках поддерживается на протяжении всей жизни организма3,4, и надежные возобновление Xi гена потребует, вероятно, одним из основных срыв в нескольких эпигеномный нормативные пути.
Для выявления факторов, необходимых для поддержания MeCP2 глушителей, мы сначала разработала модель трансгенные мыши, перевозящих фьюжн генов сопротивления MeCP2- Люцифераза - hygromycin (MeCP2-Люк-HR) на одном из две Х-хромосомы (X MeCP2-LUC-HR/xMeCP2)5. Хотя MeCP2 выразил от сплавливания построить оказался нестабильным и привели к потере функции, фенотипически подражая MeCP2 удаления в hemizygous мужчин (X/yMeCP2-Люк-HR), экспрессии генов репортер было легко обнаружить в шаблон в соответствии с выражением эндогенного MeCP25. Мы затем генерируется увековечен фибробластов клоны с помощью конструкции на активных или неактивных одну и подтвердил, что бывший выразил дикого типа MeCP2 и не репортер конструкции; обратное верно для последнего. При контакте с ДНК demethylating агент, известный отменить сайленсинга генов, 5-azacytidine (5-Аза), клетки с репортером на Xi («репортер-клетки») получила деятельность в assay биолюминесценции, указав, что наша конструкция может быть возобновлена и поэтому используется для генетического скрининга.
Далее мы разработали генетических экран высокой пропускной способностью для регуляторов MeCP2 глушителей. Репортер клеточная линия была впервые инфицированных ретровирусной библиотеки, содержащей > 60000 ориентации различных процессируются > 25000 генов на протяжении мыши генома5,6и затем подвергается hygromycin B выбор. Шпилька частота была по сравнению в предварительной и после отбора проб с использованием следующего поколения последовательности, как репортер реактивации наделяет преимуществами роста под hygromycin B выбор и привели к обогащению ответственного заколки. Используя этот подход, мы определили 30 гены вовлечены в MeCP2 глушителей и впоследствии подтверждена преобразователя репортер клетки с отдельными заколки и измерения их Люцифераза деятельности выводы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все действия с участием животных были проведены с использованием протоколов, одобренных Фред Хатчинсон рак исследований центр институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC). Не реагентов, используемых здесь известны угрозу значительных здоровья человека за исключением 5-azacytidine (5-АЗЫ).
1. образующей репортер клеток с MeCP2- Люк-HR трансген на Xi
-
Подготовка сухожилия фибробласты мыши от самки X/xMeCP2-Люк-HR MeCP2 мышь
- Усыпить 10-12 день-старая самка X/xMeCP2-Люк-HRMeCP2 мышь.
- Используя прямой Рассечение ножницами, сделайте продольных разреза через кожу проксимального хвостовой части.
- Проведение тушу у основания хвоста, потяните кожу от мыши, чтобы разоблачить fibrocartilaginous часть хвоста. Удалить и нарезать терминал 10 мм подвергаются ткани 1 мм длиной фрагментов с помощью хирургического скальпеля.
- Передачи, раздробленной ткани до 15 мл конические пробки содержащие 5 мл из Дульбекко изменение Eagle среднего (DMEM) дополнены 1 ед/мл пенициллин, 1 мкг/мл стрептомицина и коллагеназы 1,5 мг/мл, предварительно фильтруют через 0.45 мкм и затем 0.2 мкм сетки фильтров. Инкубируйте 3-4 ч при 37 ° C с непрерывным вращением.
- Центрифуга образца при комнатной температуре на 500 x g 10 мин Ресуспензируйте гранулы в 10 мл DMEM, дополненная плода бычьим сывороточным 10%, 1 ед/мл пенициллин и 1 мкг/мл стрептомицина (DMEM-10) и пластины на пластину 6-ну тканевые культуры. Проход клетки один раз и расширить до 10 см пластины перед переходом к следующему шагу.
- Увековечить клетки, выполняя трансдукция с вектором выражения, перевозящих ВПЧ-16 вирусный онкогенов (Е6 и Е7), как описано выше7.
-
Выбор отдельной ячейки клонов и характеризующих MeCP2 репортер выражение
- Урожай клетки от 10 см пластины. Во-первых аспирационная СМИ, добавляют 1 мл 0,05% трипсина ЭДТА и инкубировать в течение 2-5 мин при температуре 37 ° C. Утоляйте 9 мл DMEM-10 и собирать ресуспензированы клетки в 15 мл Конические трубки.
- Разбавить клетки с DMEM-10 до конечной концентрации 1 клеток/100 мкл. Переезд в 96-луночных пластины на дозирования 100 мкл суспензии в каждой скважине.
- Инкубируйте при 37 ° C, до тех пор, пока скважин, притока, который может занять до 2-3 недель. Замените СМИ свежие DMEM-10 каждые 3-5 дней. Когда вырожденная, мобилизовать клетки с 20 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА в колодец и разделить их на две повторяющиеся наборы 96-луночных плит.
- Используйте один набор пластин для анализа деятельности Люцифераза. Используйте однородной Светлячок Люцифераза пробирного комплект, который не требует удаления средств массовой информации. Следуйте протокола, включенных в комплект.
- Используйте результаты из шага 1.2.4 для выбора клоны с активностью не обнаружено Люцифераза из оставшихся набора пластин. Разверните эти клоны 24-Ну и затем 6-ну пластины.
- Выполните то же самое для клон с высокими показателями Люцифераза; Это будет использоваться в качестве позитивного элемента управления для целей проверки.
- Урожай Алиготе каждой скважины в пластину 6-хорошо для западной помарки. Мобилизовать клетки с 200 мкл 0,05% трипсина-ЭДТА. Проинкубируйте 2-5 минут при 37 ° C. Утолить с 2 мл DMEM-10 и половина из клеток передавать 1,5 мл пластиковых пробирок. Вымойте клетки один раз с PBS перед лизировать для западной помарки. Кроме того передать половину клеток другой 6-ну пластины. Когда клетки прикрепить к нижней части пластины, промыть с PBS и лизируют для западной помарки.
- Выполните Вестерн блот с анти MeCP2 антитела для подтверждения, что Экспресс Люцифераза отрицательные клетки, в то время как Люцифераза положительных клеток не выражают одичал тип MeCP2 из активных Х-хромосоме; выполните описанные протокол8. Используйте ткани мозга lysate от любого дикого типа мыши как позитивный элемент управления.
- Пластина несколько негативных клонов в 2 x 105 клеток/хорошо в пластине 6-хорошо. После лечения с 10 µM 5-Аза, Проинкубируйте 72 ч без изменения средств массовой информации и анализа деятельности Люцифераза, как описано в шаге 1.2.3.
- Выберите один отрицательный клон (Xi клон), который получил Люцифераза деятельность с 5-аза и приступить к его расширению в несколько 10 см пластины. Заморозить остальные негативные клонов в жидком азоте как резервную копию. Положительные клон (Xa клон) могут быть сохранены в культуре ткани или заморожены до дальнейшего использования.
2. Скрининг библиотека для повторной активации, с помощью выбора hygromycin B
-
Заражение тест клон, применение выбор и заготовки для секвенирования ДНК
- Получения вирусных концентраты ретровирусной конструкций, выражая заколки из библиотеки индуцируемый, или производить концентрированной вирусных супернатанта, используя протокол включен с требуемой библиотекой.
- Прежде чем приступить с экрана, Титруйте библиотека (с помощью GFP маркер, если таковые имеются). Цель для разносторонности инфекции от 0,3 до 0,5.
Примечание: Выполните по крайней мере четыре независимых экранов, чтобы свести к минимуму ложные положительные темпы. Для получения 100-кратного освещение библиотеки для поддержания адекватного представительства заколки и избежать случайных отсева9используйте 20 пластин на экране. Однако учитывая положительный выбор экрана и размер большая библиотека, вполне вероятно, что более низкий охват будет достаточно. - Утром пластина 1 х 106 клеток Xi на 10 см ткани культуры пластин.
- В послеобеденное время заразить пластины, заменив СМИ свежие DMEM-10, содержащий вирусный супернатант и 5-10 мкг/мл Полибрен. Используйте количество вирусных супернатанта, определенный на шаге 2.1.2.
- После 18-24 ч аспирационная средства массовой информации и добавить 10 мл свежего DMEM-10 для каждой пластины. Культура для другой 48 ч.
- Утром мобилизовать ячейки, используя 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА на пластину и утолить с 9 мл DMEM-10 на пластине. Запустите подвеска через сетчатый фильтр 100 мкм. Воедино отфильтрованных суспензий и семя два набора пластин 10 см на 1 х 106 клеток/плита.
- После обеда замените DMEM-10, содержащий 15 мкг/мл hygromycin B (день 0) средств массовой информации в одном наборе пластин. В наборе замените свежим DMEM-10 только средства массовой информации.
- После 48 часов мобилизовать клетки из необработанной набора пластин с использованием 1 мл 0,05% трипсина-ЭДТА. Проинкубируйте 2-5 минут при 37 ° C. Утоляйте 9 мл DMEM-10. Передать клетки 15 мл конические трубы и центрифуги на 500 x g 5 минут при комнатной температуре. Аспирационная supernatants и немедленно приступить с извлечения ДНК из гранул. Кроме того бассейн клетки в больших труб перед шагом центрифугирования.
- Извлечь ДНК, используя смесь фенола и chroroform и осадить ДНК с натрия ацетат и холодной этанол как описано10. Бассейн индивидуального предварительного отбора образцов ДНК и хранить при температуре от-20 ° C до дальнейшего использования.
- Продолжать культивирование hygromycin B набора для 4 дней. Пополнения выбор СМИ с свежими DMEM-10 содержащие hygromycin B после 2 дней.
- На 7 день замените свежим DMEM-10 только выбор средств массовой информации. Разрешить 2-4 дней для восстановления, а затем урожай клетки, как описано в шаге 2.1.8. Продолжите экстракции ДНК, как описано в шаге 2.1.9.
-
Выявление заколки, обогащенный после отбора проб
- 5' контекст использования (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') и 3' обратный цикл грунтовки (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') для того чтобы усилить половину заколки из пред- и после отбора образцов ДНК. Используйте все ДНК в отдельном ПЦР-реакции с 100-200 ng ДНК в реакции.
Примечание: Эти контексте грунтовка 5' и 3' обратный цикл грунтовки соответствуют мир-30 контексте последовательность вверх по течению, индуцируемый вставки и последовательность в индуцируемый цикла, соответственно. Различные библиотеки потребует различных oligos. Настройки очистки шагов для изоляции продукта различных размеров при необходимости. - Бусы Размер Выбор использования для удаления грунтовки и геномной ДНК и восстановить продукты PCR между 100 и 200 bp. следовать протокол включен с бисером.
- Подготовьте библиотеку последовательности для последовательности половину заколки. Создайте по крайней мере 50 миллионов читает на экране. Следуйте протокол для секвенирования kit и оборудования.
Примечание: 50 миллионов читает за экран предоставляет микрокредитование представление каждого индуцируемый в библиотеке и около десятикратного освещение каждой независимой инфекции (осуществляется на 100-кратного представление каждого индуцируемый), которая обеспечивает адекватное представительство Каждое событие инфекции. - Перечисление каждого индуцируемый с помощью Perl-скрипт, который подсчитывает последовательности с совершенной спички. Выбрал процессируются, по крайней мере 10 гласит в бассейне предварительного отбора для дальнейшего анализа. Вычислить обогащения, как коэффициенты после предварительного подсчитывает и определить коэффициент ложных обнаружения (ФДР) на основе 1000 комбинаций. Выбрал генов, мишенью процессируются с < 5% Рузвельт, как «хиты» для дальнейшего тестирования.
- 5' контекст использования (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') и 3' обратный цикл грунтовки (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') для того чтобы усилить половину заколки из пред- и после отбора образцов ДНК. Используйте все ДНК в отдельном ПЦР-реакции с 100-200 ng ДНК в реакции.
3. Проверка выявленных шпильками («хитов»)
-
Lentiviruses упаковки, содержащие процессируются в на экране
- Семян 8 x 106 клеток 293 FT на пластину на 10 см пластины.
- Следующий день, замените СМИ 9 мл антибиотик бесплатно DMEM-10 за тарелку; Сделайте это за 30 минут до transfection.
- В течение 30-минутного интервала Подготовьте две смеси для transfection:
- Подготовьте смесь 1 (на табличке/индуцируемый; масштабирование согласно общее количество процессируются): 10 мкл polyethylenimine (PEI) 2 мг/мл в 0,5 мл оптимальный минимум основных средств массовой информации. Смешать, закупорить и инкубации при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Подготовьте смесь 2 (за индуцируемый): 4 мкг индуцируемый вектора быть упакованы, 1,5 мкг вектора конверт VSV-G (pMD2.G) и 2,5 мкг вектора упаковки (psPAX2), смешанные в 0,5 мл оптимальный минимум основных средств массовой информации.
Примечание: Включить пустой лентивирусные вектор в упаковку для использования в более поздних инфекции как отрицательный контроль.
- Добавить 0,5 мл смеси 1 в каждом Алиготе смеси 2 и осторожно перемешать, закупорить. Инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Нанесите смесь на каждой пластине из шага 3.1.2 в прикапывают моды; вихрем пластину осторожно, чтобы перемешать.
- Следующий день, замените СМИ с 5 мл свежего DMEM-10.
- 48 часов после первоначального трансфекции, собирать супернатант и запустить его через фильтр 0,22 мкм. Предварительно мокрый фильтр с DMEM-10 для максимального восстановления.
- Алиготе отфильтрованных супернатант в количествах, идеально подходит для заражения плита 6-Ну хорошо.
- Заморозить аликвоты на-80 ° C для последующего использования, или немедленно приступить к трансдукции.
-
Трансдукция и тестирование отдельных заколки для Люцифераза репортер возобновления и активизации одичал тип MeCP2 гена на Xi.
- Утром пластина 1 х 105 Xi клеток/колодец на 6 хорошо пластин.
- В послеобеденное время заразить пластины, заменив СМИ с 2 мл свежего DMEM-10, содержащий лентивирусные супернатант и 5-10 мкг/мл Полибрен. Заразить элемент управления хорошо с вирусный супернатанта, производится из пустой лентивирусные вектор.
- Следующий день, замените СМИ с 2 мл DMEM-10, содержащий 1 мг/мл puromycin. Культура для четырех дней.
- Заменить 2 мл свежего DMEM-10 СМИ и позволяют 48-72 ч для восстановления.
- Мобилизовать клетки с 150 мкл 0,05% трипсина ЭДТА. Проинкубируйте 2-5 минут при 37 ° C. Утоляйте 1,5 мл DMEM-10. Передать клетки 15 мл конические трубы и центрифуги на 500 x g 10 минут при комнатной температуре.
- Удалите средства массовой информации и Ресуспензируйте клетки в 100 мкл буфера lysis Люцифераза пробирного комплекта. Инкубации при комнатной температуре в течение 5 минут. Передать лизатов белый 96-луночных пластины и пробирного Люцифераза деятельности с использованием протокола, включенных в комплект. Использование Xa клетки как положительный контроль и Xi клетки, инфицированные с пустой вектор лентивирусные как отрицательный контроль.
Примечание: Не подвергайте белые пластины для дневного света до assay; Это уменьшит фон и увеличить чувствительность анализа. Протокол assay комплекта оказалась наиболее эффективной, если в неведении, когда это возможно. - Чтобы определить ли шпилька имел влияние на уровень экспрессии MeCP2 на активных х, изолировать РНК из tranduced Xi клеток и измерения уровня мРНК MeCP2 с помощью количественного PCR с праймерами, призванных усилить только дикого типа MeCP2 (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
- Факультативного: Увеличение чувствительности assay, добавив 5-Аза до конечной концентрации 0,2 мкм, после того, как клетки оправились от puromycin выбор. Культура клетки для 72 h без замены средств массовой информации и затем пробирного Люцифераза деятельности с помощью коммерческого Люцифераза пробирного kit.
- Мера возобновление заглушало одичал типа MeCP2. Заразить клетки Xa, которые питают дикого типа MeCP2 на Xi, с вектором, содержащие отдельные заколки, следующие шаги протокол 3.2.1. -3.2.4. Изолировать РНК из клеток и измерения уровня мРНК MeCP2 с помощью количественного PCR с праймерами, призванных усилить только дикого типа MeCP2 (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Сухожилия фибробласты мыши были собраны из ранее описанных X/xMeCP2-Люк-HRMeCP2 женского мыши, увековечено ретровирусных трансдукции E6 и E7 онкогены ВПЧ-16 virus7, клонировать с помощью ограничения разрежения и тестирование на Люцифераза активности и экспрессии белка MeCP2 одичал типа (рис. 1A и 1B). Люцифераза активность была надежной, если репортер был на Xa и обнаружить, если на Xi; родной MeCP2 выражение выставлены взаимные шаблон. Мы выбрали клон с активностью не Люцифераза (Xi-8) и клон с надежной деятельности (Xa-3) для дальнейших экспериментов. Когда клетки Xi-8 были обработаны с 5-Аза, дозозависимый индукции активности Люцифераза было отмечено (рис. 1 c).
Чувствительность Xi-8 и Xa-3 клетки hygromycin B был протестирован, выполнив выбор день 3 и 6. Как и ожидалось от выражения Люцифераза репортер, Xi-8 клетки были более чувствительны к hygromycin B чем Xa-3 клетки, даже несмотря на то, что последний выставлены чувствительность к более высоких доз (рисунок 2A). После того, как смесь 1: 100 Xa-3 клетки Xi-8 был подвергается воздействию различных концентраций hygromycin B, зависящих от времени, увеличение активности Люцифераза было отмечено, указанием успешной конкуренции Xa-3 клеток Xi-8 клеток (Рисунок 2Б). Доза и продолжительность hygromycin B отбора были выбраны для дальнейших экспериментов на основе преференциальных ингибирование Xi-8 над Xa-3 клетки.
Были проведены четыре независимые экраны для идентификации регуляторов MeCP2 глушителей, используя линии клетки Xi-8 и открытый Биосистемный мир-30-индуцируемый на основе библиотеки, содержащей 64,159 различные заколки клонирован в MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP антиретровирусной вектор. В каждом экране 20 10 см пластины были инфицированы пуле процессируются, ориентация приблизительно 100-кратного освещение библиотеки. Hygromicin B был проведен на 6 дней, до тех пор, пока небольшой бесклеточной патчи были замечены; клетки продолжают умирать за 24-48 часов. При восстановлении, клетки были собраны для экстракции ДНК, используя технику фенол хлороформ. Общий удой ДНК на экране был около 20 мкг/пластина, которая была объединяются и разделены между 100 реакций ПЦР, используя праймеры, призванных усилить половину заколки. Продукты PCR были затем шарик очищенный и подвергается высокой производительности виртуализации.
До и после отбора пробы были по сравнению с определить шпилька обогащения, как мы ожидали, что любой настоящий шпильки на повышенных уровнях в период после отбора образца целевых генов, которые возобновленные Xi и таким образом предоставленного hygromycin сопротивления. Для проверки рассматривались только заколки, обогащенный по крайней мере 2 из четырех экранов. Наиболее обогащенного заколки в всех реплицирует нашего экрана были четыре заколки, ориентация XIST, в соответствии с его решающую роль в XCI11.
Проверка части экрана была проведена индивидуально тестирования шпильками, которые зарегистрированы как хиты для активации Люцифераза репортер в Xi-8 клеток. Хотя экран осуществлялась с использованием библиотеки антиретровирусного лечения на основе MSCV, проверки была проведена с использованием лентивирусные вектор (отдельные pGIPZ клоны с индуцируемый) чтобы избежать возможного обнаружения ретровируса индуцированной артефактов.
Каждый из генов кандидат был мишенью по крайней мере двух различных шпилька последовательностей, и нокдаун гена целевой была подтверждена Количественная ПЦР в реальном времени (RT-ПЦР). Опробование до 1 x 106 клеток в формате 6-Ну и уменьшения фон свечения (рис. 2 c), мы смогли обнаружить очень низкой частоты реактивации события, которые мы, согласно оценкам, в диапазоне топографической.
Дальнейший анализ с использованием индивидуальных заколки привели к выявлению 30 генов, чьи нокдаун привело к активизации репортер на Xi. Средний масштаб свечения для этих 30 генов был 2.8-fold выше базовой линии, который был далее усиливается сетями следующих 5-Аза обращение. Были протестированы же заколки для волос, в сочетании с 5-Аза, с Xa-3 клетки для подтверждения повторно выражение дикого типа MeCP2 от Xi. Это было достигнуто путем выполнения RT-ПЦР с праймерами, призванных усилить только Стенограмма дикого типа MeCP2.
Рисунок 1. Изоляция клонов с MeCP2-Люк-HR Репортер ген на Xi.
A) представитель Светлячок Люцифераза пробирного на фибробласты увековечен сухожилия клоны (1-9). Основная фибробласты из не трансгенных (NT) и трансгенных гетерозиготных девушки (F) были использованы в качестве отрицательных и положительных элементов, соответственно. B) представитель западной помарке показаны MeCP2 белков из клетки в (A). Обратите внимание, что Люцифераза активности (Рисунок 1A) и MeCP2 выражение exhibit взаимного выражения. C) индукции активности Люцифераза светлячков в Xi-8 клеток с 5-Аза. XA-3 клетки, с Репортер ген на Xa, служить в качестве позитивного элемента управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Характеристика hygromycin сопротивления в Xi-8 и Xa-3 клетки.
A) относительный рост клеток Xi-8 и Xa-3 лечение с различными hygromycin B схемы (3D = 3 дней; 6 d = 6 дней), по сравнению с необработанными клеток. B) Люцифераза обогащения деятельности после разоблачения в общей сложности 10000 Xa-3 и Xi-8 клеток (смешанные в соотношении 1: 100) hygromicin B (25 мкг/мл) указывается количество дней. Постконтактная Люцифераза деятельность была разделена уровень предварительного облучения для вычисления обогащения. C) Светлячок Люцифераза активность в Xi-8 клеток, assayed в формате 96 - и 6-а, с и без 5-Аза (10 мкм). Не трансгенных фибробластов (NT) были использованы в качестве отрицательного контроля. 5-Аза возросла активность Люцифераза 7.2 - и 86 раз базовый формат 96 - и 6-Ну, соответственно. (N = 3, * p < 0,001, ** p < 0,0001, студента t тест сравнения 5-Аза лечить и лечить Xi-8 клеток.) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В наши последние исследования6, мы создали линию мышиных ячейки с Люцифераза и гены сопротивления hygromycin сливается с MeCP2 на Xi и преобразованы с библиотекой > 60000 процессируются таргетинг > 25000 генов. Мы нашли 30 гены преимущество которого присвоен выживания НОК Даун под hygromycin B выбор, предлагая их роль в борьбе с MeCP2 и одну глушителей. Эти результаты были подтверждены преобразователя сообщил клеток линии с отдельными заколки и оценки возобновление немого Люцифераза репортер.
Вывод, что топ четыре шпильки в всех реплицирует нашего экрана целевой XIST условии сильной внутренней проверки для нашего метода, учитывая ключевую роль XIST в XCI11. Помимо надсемейства TGFβ, чья регулирующей роли в XCI не было были описаны ранее, других выявленных генов, все принадлежали семьям функциональной связи с эпигенетическими регулирования, таким образом служить дополнительной проверки для нашего метода12 , 13 , 14. Кроме того, мы также обнаружили 4 из 13 генов, ранее определенных в другой экран, используя ЦМВ промоутер driven GFP, случайно вставлены на Xi15.
Создание подходящего доза и длительность hygromycin B отбор был решающую роль в оптимизации условий отбора. Чувствительность нашей клеточной линии был сильно зависит от плотности посева и пострадала от ретровирусной инфекции. Увеличение дозы или продолжительности отбора также ингибирует рост клеток с репортером на Xa, тогда как мягкий выбор понижена чувствительность для обогащения шпильки. Несколько схем дозирования hygromycin B и репортер клеток плотности посева таким образом были протестированы до окончательного отбора. Кроме того хотя MSCV ретровирусной вектор в нашей библиотеке индуцируемый дает возможность использовать puromycin выбор и обогатить для успешно transduced клеток, puromycin не использовался в наших экспериментах, как последовательное использование puromycin и hygromyin B привело к чрезмерной токсичности, даже после соответствующей дозы деэскалации обоих антибиотиков.
Все шпильки, выявленных в нашем исследовании также возобновлено немого Люцифераза репортер, хотя и в более скромных степени. Обнаружение этих редких событий было включено по высокая чувствительность нашего экрана, который мы, по оценкам, на основе тестирования примесей Xi и Xa клеток, быть одним событием возобновление в 2 х 104 клетки. Такой низкий уровень реактивации, увеличилось с совместного применения 5-Аза, подтверждают ранее описанные трудности в нарушая строгий контроль transcriptional XCI12,13,16,17, и подразумевает, что нарушение нескольких механизмов регулирования потребуется для достижения значительного оживления.
Следует отметить все 30 заколки, выявленных в нашем экране также повторная активация ЦМВ driven Репортер ген расположен в разных х Локус, указав их более широкого воздействия на Xi де репрессий. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы проверить ли специфичные для MeCP2 «reactivators» существует, как их Фармакологическое или генетических манипуляций может оказаться чрезвычайно полезным в лечении синдром Ретта.
Наша система скрининга предлагает несколько преимуществ по сравнению с ранее описанных репортеров, используемые для х возобновление экраны12,17. Вместо гонят ЦМВ промоутер, наш корреспондент кассеты стучится в C-конечной MeCP2 и таким образом управляется родной Х-хромосомой промоутер. Этот дизайн может помочь идентифицировать MeCP2 Локус конкретные регуляторы, более актуальным в контексте исследований синдром Ретта, с оговоркой, изъятый выводы увековечен фибробластов в нейронах, желаемый сайт MeCP2 реактивации. Использование гена hygromycin сопротивление позволяет положительный выбор событий реактивации и энергично увеличивает чувствительность экрана. Кроме того кассеты, содержащих hygromycin сопротивление и Светлячок Люцифераза генов позволяет оба крупномасштабных скрининг позитивного выбора с помощью hygromycin B и отдельные заколки скрининга и тестирования с использованием Люцифераза репортер.
В целом мы сообщают надежные и чувствительной генетический скрининг метод для идентификации регуляторов MeCP2 и одну глушителей в mammalian клетках. Эта методология может быть адаптирован для скрининга малые интерферирующие РНК (малые интерферирующие РНК), ТРИФОСФАТЫ, или малых молекул. Такие анализы могут оказаться полезными в создании терапевтические подходы, которые полагаются на возобновление функциональные аллель гена молчание, такие, как в случае синдром Ретта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Д-р Леко способствовали этой статьи как сотрудник онкологического исследовательского центра Фреда Хатчинсона. Мнения, выраженные его собственные и не обязательно отражают взгляды национальных институтов здоровья или правительства Соединенных Штатов
Acknowledgments
Мы благодарим Диккенс Росс из университета Мельбурна за любезное предоставление индуцируемый Библиотека, используемая на экране. Эта работа финансировалась по Ретта синдром исследований доверяют (а.б.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
