Summary
Descrevemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em micro-biorreatores. Um chip pode abrigar até 10 milhões. células que podem ser cultivadas sob condições estritamente definidas em relação ao fluxo de fluidos, etc tensão de oxigênio em um circuito de circulação estéril, fechado.
Abstract
Nós desenvolvemos um chip baseado em sistema de cultura de células para o cultivo tridimensional de células. O chip é normalmente fabricados a partir de polímeros não-biodegradáveis, por exemplo, policarbonato ou polimetilmetacrilato por moldagem por injeção micro, estampagem a quente micro ou micro termoformagem. Mas, ele também pode ser fabricado a partir de polímeros bio-degradáveis. Suas dimensões são 0,7 1 x 20 x 20 x 0,7 1 mm (AxLxP). As principais características dos chips usados são ou uma grade de até 1.156 cúbicos micro-recipientes (cf-chip) cada um do tamanho de 120-300 x 300 x 300 μ (AxLxP) ou recessos redonda com diâmetro de 300 μ e uma profundidade de 300 μ (r-chip). O andaime pode abrigar 10 milhões. células em uma configuração tridimensional. Para um nutriente ideal e fornecimento de gás, o chip é inserido em uma carcaça biorreator. O biorreator é parte de um circuito fechado de circulação estéril que, na configuração mais simples, é adicionalmente constituído por uma bomba de roletes e um reservatório com uma média de fornecimento de gás. O biorreator pode ser executado em perfusão, superfusão, ou mesmo um modo de operação mista. Temos cultivou com sucesso linhagens de células, bem como células primárias ao longo de períodos de várias semanas. Para as células do fígado de ratos primária que poderia mostrar uma preservação das funções organotípicas por mais de duas semanas. Para as linhas de células de carcinoma hepatocelular pudéssemos mostrar a indução de genes específica do fígado ou não apenas um pouco expressa em cultura em monocamada padrão. O sistema também pode ser útil como um sistema de cultivo de células-tronco desde experimentos primeira diferenciação com linhas de células-tronco foram promissores.
Protocol
Este artigo descreve a utilização de uma plataforma baseada em chip (fig. 1) para o cultivo tridimensional de linhagens celulares, bem como células primárias. Uma vez que muitas células não expressam funções organotípicas somente em um ambiente 3D, temos desenvolvido um chip de polímero que fornece uma plataforma para que as células podem aderir em todas as direções espaciais, e que pode ser montado em uma carcaça de biorreatores para o controle de fluxo de fluido , etc tensão de oxigênio Dependendo do projeto experimental, a superfície do polímero pode ser modificado por várias técnicas, por exemplo, radiação UV, PECVD, γ-enxertia ou química úmida convencional.
Figura 01
1. Desaeração e hydrophilisation do chip
Antes do uso, o chip tem de ser purgada e hydrophilized. Para isso, uma série de álcool é realizada. Soluções de isopropanol composto de 100%, 70%, 50%, 30% isopropanol em DMPC-água tratada estão preparados eo chip é mergulhado em cada concentração, começando com a solução de 100%, para até 30 anos. A etapa final da série é composta por pyrocarbonate Dimetil puro (DMPC) tratados com água. A partir deste ponto, é importante manter o chip molhado.
2. Colágeno I revestimento
Após a série de álcool, o chip é geralmente revestido com uma solução de colágeno I, a partir da cauda de rato. A partir da solução estoque de colágeno de 2 mg / ml em 0,2% de ácido acético uma alíquota correspondente a 30 mg de proteína de colágeno é diluída com água tratada DMPC-a um volume final de 150 mL. Isso resulta em uma camada de colágeno da superfície do chip com uma densidade de 10 de colágeno I mg por cm 2 de superfície.
3. Inoculação de células de carcinoma hepatocelular
Células de carcinoma hepatocelular linha Hep G2 são tripsinizados e contadas. Para experimentos de curta duração (1-6 dias) 5 * 10 6 células são inoculadas em cada chip eo correspondente controle de seis centímetros de tecido placas de cultura de petri. Para inoculte, o chip de 5 * 10 6 células são ressuspendidas em 150 mL meio de cultura e colocado em cima da área do micro-chip (fig. 2). Depois, ele é colocado em uma incubadora por 2-3 horas. Durante este período de incubação do sedimento das células para o micro-recipientes e aderir ao colágeno I-revestido andaime.
Figura 2
4. Inserção do chip dentro do alojamento biorreator
Após o período de incubação, o chip é retirado da incubadora e montado no alojamento biorreator. Para isso, sob a bancada limpa, o biorreator preassembled é removido da embalagem estéril e desmontada em um grau que permite a inserção do chip. O chip é cuidadosamente tratada com pinças esterilizadas e colocado na ranhura que contém a gaxeta que veda o chip e que resulta na geração de um compartimento superior e inferior no biorreator. Então, o biorreator é montado novamente e transferido para a incubadora, onde ele está conectado à bomba, o fornecimento de gás eo analisador de oxigênio.
5. Enchimento do sistema
Assim que o biorreator é conectada ao reservatório de meio, bomba e de fornecimento de gás do loop circulação fechada é preenchida com o meio. Isto é feito posicionando o 3-way-conectores de tal forma que superfusão, que é definido como o fluxo de meio por cima do chip, é alcançado. Isto leva a uma descarga de ar fechado da circulação biorreator sem remover as células do andaime. Depois que o sistema é completamente preenchida com o meio, o 3-way-conectores estão ligados de tal forma que a perfusão, que é definido como o fluxo de baixo para o chip através do tecido, seja alcançado. Na configuração do fluxo de perfusão é ajustado às necessidades da célula, que geralmente varia de hepatócitos 6-50 mL / min.
6. Amostragem
Durante o experimento amostras médio pode ser desenhado. Para isso, seringas são ligados às portas estéril em cima do reservatório de médio porte. Após a amostragem, as portas são esterilizados com isopropanol 70%.
7. Isolamento de células intactas do chip para aplicações downstream
No final do experimento, os biorreatores estão desconectados da fonte de gás ea bomba de rolete, transferido para a bancada limpa e desmontado conforme descrito anteriormente. Com uma pinça estéril, o chip é removido da habitação biorreator, colocadoem um prato de 3,5 centímetros de Petri e lavados com PBS. Depois, o chip é incubada com tripsina / EDTA (0,25% / 0.53mM) por 5-15 min em uma incubadora para separar as células da área microestruturada. A suspensão de células coletadas é centrifugada por 5 min a 600 g. As células podem então ser utilizados para aplicações convencionais de downstream, por exemplo, RNA total ou isolamento de proteínas. Rotineiramente, isolamos RNA total (kit PARIS, Ambion Inc., Austin, Texas, EUA) para análise de microarray e em tempo real de RT-PCR. Expressão da proteína é analisado após a coloração imuno-histoquímica das células dentro do chip com um microscópio de varredura a laser, mas também pode ser analisado de outra forma, por exemplo, por citometria de fluxo.
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Discussion
Nós desenvolvemos uma plataforma baseada em chip para o cultivo tridimensional de células em biorreatores ativamente perfundidos micro. Os chips podem ser fabricados a partir de não-biodegradáveis, bem como polímeros biodegradáveis por moldagem por injeção micro, estampagem a quente e micro técnicas de termoformagem 3. Dependendo do projeto experimental, a superfície do polímero pode ser modificado por irradiação UV-4. Linhagens de células de hepatócitos, bem como hepatócitos primários de rato pode ser cultivada com sucesso nestes dispositivos como poderia ser demonstrado pela análise de expressão de alguns genes específica do fígado bem como a análise de algumas proteínas hepáticas específicas 5,6.
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Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer Mechthild Herschbach e Anke Dech de assistência técnica excelente.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
