Summary
Beschrijven we een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in micro-bioreactoren. Een chip kan maximaal huis tot 10 miljoen. cellen die kunnen worden geteeld onder nauwkeurig omschreven voorwaarden met betrekking tot stroming, zuurstofspanning enz. in een steriele, gesloten circulatie lus.
Abstract
We hebben een chip-gebaseerde celcultuur systeem voor de drie-dimensionale kweken van cellen. De chip is meestal vervaardigd uit niet-biologisch afbreekbare polymeren, zoals polycarbonaat of polymethylmethacrylaat door micro-spuitgieten, micro hot embossing of micro thermovormen. Maar, het kan ook zijn vervaardigd uit biologisch afbreekbare polymeren. Heeft de volgende afmetingen zijn 0,7 x 1 20 x 20 x 0,7 1 mm (hxbxl). De belangrijkste kenmerken van de gebruikte chips zijn ofwel een raster van maximaal 1156 kubieke micro-containers (cf-chip) elk ter grootte van 120 tot 300 x 300 x 300 μ (hxbxl) of ronde uitsparingen met een diameter van 300 μ en een diepte van 300 μ (r-chip). De steiger kan huis 10 miljoen. cellen in een drie-dimensionale configuratie. Voor een optimale voedingsstoffen-en gasvoorziening, wordt de chip ingebracht in een bioreactor behuizing. De bioreactor is een onderdeel van een gesloten steriele oplage lus die, in de eenvoudigste configuratie, Additionaly bestaat uit een roller pomp en een medium reservoir met een gastoevoer. De bioreactor kan worden uitgevoerd in perfusie, superfusie, of zelfs een gemengde modus. We hebben met succes gecultiveerd cellijnen en primaire cellen over periodes van enkele weken. Voor de rat primaire levercellen konden we zien een behoud van de organotypische functies voor meer dan 2 weken. Voor hepatocellulair carcinoma cellijnen konden we geven de inductie van lever specifieke genen niet of nauwelijks geformuleerd in norm monolaag cultuur. Het systeem kan ook nuttig zijn als een stamcel teeltsysteem sinds de eerste experimenten met differentiatie stamcellijnen waren veelbelovend.
Protocol
Dit document beschrijft het gebruik van een chip-gebaseerde platform (fig. 1) voor de drie-dimensionale teelt van cellijnen en primaire cellen. Aangezien veel cellen te uiten organotypische werkt alleen in een 3D-omgeving, hebben we een polymeer chip die een steiger waarop de cellen kunnen zich in alle ruimtelijke richtingen biedt, en dat kan worden gemonteerd in een bioreactor behuizing voor de controle van de vloeistofstroom , zuurstofspanning etc. Afhankelijk van de proefopzet, kan het oppervlak van het polymeer gemodificeerd door verschillende technieken, bijvoorbeeld UV-bestraling, PECVD, γ-enten of conventionele natte chemie.
Figuur 01
1. Ontluchting en hydrophilisation van de chip
Voor het gebruik, de chip moet worden ontlucht en hydrophilized. Hiervoor is een alcohol-serie uitgevoerd. Isopropanol oplossingen bestaande uit 100%, 70%, 50%, 30% isopropanol in DMPC-behandelde water worden voorbereid en de chip is gedoopt in iedere concentratie, te beginnen met de 100%-oplossing, voor maximaal de jaren '30. De laatste stap van de serie bestaat uit pure Dimethyl pyrocarbonate (DMPC)-behandeld water. Vanaf dit punt, is het belangrijk om de chip nat.
2. Collageen I coating
Na de alcohol-serie, is de chip meestal bedekt met een collageen I oplossing van rattenstaart. Van het collageen voorraad oplossing van 2 mg / ml in 0,2% azijnzuur een hoeveelheid die overeenkomt met 30 ug eiwit collageen is verdund met DMPC-behandeld water tot een eindvolume van 150 ul. Dit resulteert in een collageen coating van de chip oppervlak met een dichtheid van 10 ug collageen I per cm 2 oppervlakte.
3. Inoculatie van hepatocellulair carcinoom cellen
Hepatocellulair carcinoom cellen van lijn Hep G2 zijn getrypsiniseerd en geteld. Voor de korte termijn experimenten (1 tot 6 dagen) 5 * 10 6 cellen worden geënt in elke chip en de bijbehorende controle 6 cm weefselkweek petrischaaltjes. Om inoculte, zijn de chip 5 * 10 6 cellen geresuspendeerd in 150 ul kweekmedium en geplaatst op de top van de microstructured oppervlakte van de chip (fig. 2). Daarna wordt het geplaatst in een incubator voor 2-3 uur. Tijdens deze incubatieperiode van de cellen sediment in de micro-containers en zich houden aan de collageen I-gecoate schavot.
Figuur 2
4. Het inbrengen van de chip in de bioreactor behuizing
Na de incubatieperiode wordt de chip verwijderd uit de incubator en gemonteerd in de bioreactor behuizing. Voor deze, onder de schone bank, is de voorgemonteerd bioreactor verwijderd uit de steriele verpakking en gedemonteerd in een mate die het mogelijk maakt voor het inbrengen van de chip. De chip wordt zorgvuldig omgegaan met een steriele pincet en geplaatst in de groef, dat de pakking, die sluit de chip en die resulteert in het genereren van een bovenste en onderste compartiment in de bioreactor bevat. Daarna wordt de bioreactor weer gemonteerd en overgebracht naar de incubator, waar deze is aangesloten op de pomp, de gastoevoer en de zuurstof analyzer.
5. Het vullen van het systeem
Zodra de bioreactor is verbonden met het medium reservoir, pomp-en gasvoorziening van de gesloten circulatie lus is gevuld met medium. Dit wordt gedaan door het plaatsen van de 3-weg-connectors op een zodanige wijze dat superfusie, die wordt gedefinieerd als de stroom van medium over de bovenkant van de chip, is bereikt. Dit leidt tot een ontlading van de ingesloten lucht uit de bioreactor circulatie, zonder het verwijderen van de cellen uit het schavot. Nadat het systeem volledig is gevuld met medium, zijn de 3-weg-connectors overgestapt op een zodanige wijze dat de perfusie, wat wordt gedefinieerd als de doorstroming van onderaf de chip door het weefsel, is bereikt. In de perfusie configuratie de stroom wordt aangepast aan de behoeften van de cel die doorgaans voor de hepatocyten varieert 60 tot 500 pl / min.
6. Monsterneming
Tijdens het experiment medium monsters kunnen worden getrokken. Hiervoor zijn spuiten verbonden met de steriele-poorten op de top van het medium reservoir. Na de bemonstering, worden de poorten gesteriliseerd met 70% isopropanol.
7. Isolatie van intacte cellen van de chip voor downstream toepassingen
Aan het einde van het experiment worden de bioreactoren losgekoppeld van de gasvoorziening en de rol pomp, overgebracht naar de schone bank en gedemonteerd zoals eerder beschreven. Met een steriel pincet de chip wordt verwijderd uit de bioreactor behuizing, geplaatstin een 3,5 cm petrischaal en gespoeld met PBS. Daarna is de chip geïncubeerd met trypsine / EDTA (0,25% / 0.53mM) voor 5-15 min in een couveuse op de cellen van de microstructured gebied los te maken. De verzamelde celsuspensie wordt gecentrifugeerd voor 5 minuten bij 600 g. De cellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor conventionele downstream toepassingen, bijv., totaal RNA of eiwit geïsoleerd. Routinematig, we isoleren totaal RNA (PARIS kit, Ambion Inc, Austin, Texas, USA) voor de microarray analyse en real-time RT-PCR. Eiwitexpressie wordt geanalyseerd na immunohistochemische kleuring van de cellen in de chip met een laser scanning microscoop, maar kan ook op andere wijze worden geanalyseerd, bijvoorbeeld door flowcytometrie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben een chip-gebaseerde platform voor de drie-dimensionale kweken van cellen in actief doorbloed micro-bioreactoren. De chips kunnen worden vervaardigd uit niet-biologisch afbreekbare en biologisch afbreekbare polymeren door micro-spuitgieten, hot embossing en micro thermoforming technieken 3. Afhankelijk van het experimenteel ontwerp, kan het oppervlak van het polymeer gemodificeerd door UV-bestraling 4. Hepatocyt cellijnen en primaire rattenhepatocyten met succes kunnen worden geteeld in deze apparaten als kan worden aangetoond door expressie analyse van een aantal lever-specifieke genen en de analyse van een aantal lever-specifieke eiwitten 5,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Mechthild Herschbach en Anke Dech bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
