Summary
Biz, mikro-biyoreaktörler hücrelerin üç boyutlu ekimi için çip tabanlı platform açıklar. Bir çip 10 milyon kadar ev. steril, kapalı bir dolaşım döngü içinde sıvı akışı, oksijen basıncı vb ilişkin kesin olarak tanımlanmış koşullar altında yetiştirilen hücreler.
Abstract
Biz üç boyutlu hücre ekimi için bir çip tabanlı hücre kültürü sistemi geliştirdik. Olmayan biyolojik olarak parçalanabilen polimerler, örneğin, polikarbonat veya mikro enjeksiyon polimetil metakrilat, mikro sıcak kabartma veya termoform mikro çip tipik olarak imal edilmektedir. Ama, aynı zamanda biyo-bozunur polimerler imal edilebilir. Genel boyutları 0.7 1 x 20 x 20 x 0.7 mm 1 (hxwxl). Kullanılan yongaları temel özellikleri ya kadar 1156 metreküp mikro-konteynerler (cf-chip) bir ızgara her 120-300 boyutunu x 300 x 300 μ (hxwxl) veya 300 μ çaplı yuvarlak girinti ve derinlik 300 μ (r çip). Iskele 10 milyon ev. üç boyutlu bir yapılandırma hücreler. Optimal bir besin ve gaz kaynağı için çip biyoreaktör konut eklenir. Biyoreaktör basit yapılandırma, ayrica bir silindir pompa ve gaz kaynağı ile orta rezervuar oluşan, kapalı steril dolaşım döngü parçasıdır. Biyoreaktör perfüzyon, superfusion, hatta karışık bir çalışma modu çalıştırmak olabilir. Biz birkaç hafta süre başarıyla birincil hücre hücre hatlarının yanı sıra ekili var. Sıçan primer karaciğer hücreleri için en fazla 2 hafta süreyle Organotipik fonksiyonlarının korunması gösterilebilir. Hepatosellüler karsinom hücre hatları için, ya da sadece biraz standart tek tabaka kültürü ifade karaciğer belirli genlerin indüksiyon gösterebilirim. Beri bir kök hücre, kök hücre hatları ile ilk farklılaşma deneyler yetiştirme sistemi vaat sistemi de kullanışlı olabilir.
Protocol
Bu kağıt, birincil hücre hücre hatlarının yanı sıra üç boyutlu ekimi için bir çip tabanlı platform (Şekil 1) kullanımını açıklar. Birçok hücre, sadece 3 boyutlu bir ortamda ifade Organotipik fonksiyonları bu yana, biz hücreler tüm uzaysal yönde uymak için bir iskele sağlayan bir polimer çip geliştirdik ve sıvı akışının kontrolü için bir biyoreaktör konut monte edilebilir , deney tasarımı bağlı olarak oksijen basıncı vb, polimer yüzey çeşitli teknikler, örneğin, UV ışınlama, PECVD, γ-aşılama veya konvansiyonel ıslak kimya değiştirilmiş olabilir.
Şekil 01
1. De-havalandırma ve çip, hydrophilisation
Kullanmadan önce, çip deaerated ve hydrophilized. Bunun için, alkol serisi yürütülmektedir. DMPC arıtılmış su içinde izopropanol% 100,% 70,% 50,% 30 oluşan Isopropanol çözümler hazırlanır ve çip% 100 çözüm ile başlayan, her konsantrasyon batırılmış, 30'lu kadar. Serinin son adım saf Dimetil pyrocarbonate (DMPC) arıtılmış su oluşur. Bu noktadan itibaren, bu çip ıslak tutmak için önemlidir.
2. Kollajen I kaplama
Alkol serisinden sonra, çip genellikle bir sıçan kuyruğu kollajen ben çözümü ile kaplı. Kollajen stok solüsyonu% 0.2 asetik asit, 2 mg / ml 30 mg kolajen proteini gelen bir kısım son hacim 150 ul DMPC arıtılmış su ile seyreltilir. Bu sonuç 10 mg kolajen Ben her cm 2 yüzey alanı yoğunluğu ile çip yüzey kollajen bir kaplama.
3. Hepatosellüler karsinom hücrelerinin inokülasyonu
Hepatosellüler karsinom hücreleri hattı Hep G2 tripsinize sayılır. Kısa vadeli deneyler için (1 ila 6 gün) 5 * 10 6 hücre her yonga ve ilgili kontrol 6 cm doku kültürü petri kaplarına inoküle . Inoculte için çip 5 * 10 6 hücre 150 ul kültür ortamı yeniden süspanse ve üst microstructured çip alanı (Şekil 2) üzerine yerleştirilir. Daha sonra, 2-3 saat için bir kuluçka yerleştirilir. Bu kuluçka döneminde mikro-konteyner içine hücreleri tortu ve kollajen I kaplı iskele bağlı.
Şekil 2
4. Biyoreaktör gövde içine çip takılması
Kuluçka döneminden sonra, çip inkübatör kaldırılır ve biyoreaktör konut monte. Bunun için temiz bir tezgah altında steril ambalaj, önceden monte edilmiş biyoreaktör kaldırıldı ve çip yerleştirilmesi için izin veren bir dereceye kadar sökülüp. Çip dikkatle ele alınır ve steril forseps ile biyoreaktör bir alt ve üst bölmesinin nesil yonga ve sonuçları mühürler conta içeren oyuğa yerleştirilir. Sonra, biyoreaktör tekrar toplandı ve pompaya bağlı inkübatör, gaz kaynağı ve oksijen analizörü transfer.
5. Sistemin doldurulması
Biyoreaktör orta rezervuara bağlı olarak, pompa ve gaz kapalı dolaşım döngüsü orta ile doludur kaynağı. Bu çip üstünden orta akım olarak tanımlanır superfusion, elde böyle bir şekilde 3-way-konektörler konumlandırma yapılır. Bu iskele hücreleri çıkarmadan biyoreaktör dolaşımdan kapalı hava deşarj yol açar. Sistemi tamamen orta ile doldurulduktan sonra, 3-way-konektörler perfüzyon, doku yoluyla çip aşağıda akışı olarak tanımlanır, elde böyle bir şekilde devreye girerler. Perfüzyon yapılandırmada akışı hepatositler için genellikle 60-500 ul / dk arasında değişir hücre ihtiyaçlarına göre ayarlanır.
6. Örnekleme
Deney sırasında orta örnekleri çizilebilir. Bunun için, şırınga orta rezervuar üstüne steril portlarına bağlanır. Örnekleme sonra, portların% 70 izopropanol ile sterilize edilir.
7. Downstream uygulamalar için çip sağlam hücrelerinin izolasyonu
Deneyin sonunda, biyoreaktörler temiz tezgah aktarılır ve daha önce açıklandığı gibi demonte, gaz tedarik ve roller pompa kesilir. Steril forseps ile çip biyoreaktör konut kaldırılır yerleştirdi3,5 cm petri içine ve PBS ile durulanır. Daha sonra, çip microstructured alanından hücreleri ayırmak için bir kuluçka 5-15 dakika tripsin / EDTA ile (% 0.25 / 0.53mM) inkübe edilir. Toplanan hücre süspansiyonu 600 g. 5 dakika santrifüj Bu hücreler daha sonra, geleneksel downstream uygulamalar, örneğin, toplam RNA ve protein izolasyonu için kullanılabilir. Rutin, mikroarray analizi ve gerçek zamanlı RT-PCR (PARİS kiti, Ambion Inc, Austin, Teksas, ABD) total RNA izole eder. Bir lazer tarama mikroskobu ile çip içinde hücrelerinin protein ekspresyonu immünohistokimyasal sonra analiz edilir, ancak flow sitometri de, örneğin, aksi analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz aktif perfüze mikro biyoreaktörler hücrelerin üç boyutlu ekimi için bir çip-tabanlı bir platform geliştirmiştir. Cips, biyolojik olarak parçalanabilen polimerler olmayan biyolojik olarak parçalanabilen yanı sıra mikro enjeksiyon kalıplama, sıcak kabartma yanı sıra mikro termoform teknikleri 3 tarafından imal edilebilir . Deneysel tasarım bağlı olarak, polimer yüzey 4 UV ışınlama tarafından değiştirilebilir. Hepatosit hücre hatları gibi birincil rat hepatositlerinde ifade, bazı karaciğer spesifik genlerin analizi gibi bazı karaciğer spesifik proteinlerin 5,6 analizi ile gösterilir olabilir, bu cihazlar başarıyla yetiştirilmektedir olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz Mechthild Herschbach ve Anke Dech mükemmel teknik yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 53, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. 3. Enzymatic requirements for tissue dispersion. Exp. Cell Res. 82, 391-398 (1973).
- Giselbrecht, S., Gietzelt, T., Gottwald, E., Trautmann, C., Truckenmueller, R., Weibezahn, K. F., Welle, A. 3D tissue culture substrates produced by microthermoforming of pre-processed polymer films. Biomed. Microdev. 8, 191-199 (2006).
- Welle, A., Gottwald, E. UV-based patterning of polymeric substrates for cell culture applications. Biomed. Microdev. 4, 33-41 (2002).
- Gottwald, E., Giselbrecht, S., Augspurger, C., Lahni, B., Dambrowsky, N., Truckenmueller, R., Piotter, V., Gietzelt, T., Wendt, O., Pfleging, W., Welle, A., Rolletschek, A., Wobus, A. M., Weibezahn, K. -F. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab Chip. 7, 777-785 (2007).
- Eschbach, E., Chatterjee, S. S., Noldner, M., Gottwald, E., Dertinger, H., Weibezahn, K. -F., Knedlitschek, G., G, Microstructured scaffolds for liver tissue with high density: Morphological and biochemical characterization of tissue aggregates. J. Cell. Biochem. 95, 243-255 (2005).
