Summary
우리는 마이크로 bioreactors에서 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 플랫폼을 설명합니다. 하나의 칩 10 미오 최대 집 수 있습니다. 멸균, 폐쇄 순환 루프에서 유체 흐름, 산소 장력 등에 관한 정확하게 정의된 조건 하에서 재배 세포 수 있습니다.
Abstract
우리는 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 세포 배양 시스템을 개발했습니다. 이 칩은 일반적으로 비 생분해성 고분자, 예를 들어, 폴리 카보 네이트 또는 마이크로 사출 성형에 의해 polymethyl 메타 크릴 레이트, 마이크로 핫 엠보싱 또는 thermoforming 마이크로에서 제조됩니다. 그러나, 그것은 또한 바이오 분해 고분자로부터 제조된 수 있습니다. 그 전체 크기는 0.7 일아르 X 20 X 20 X 0.7 1mm (hxwxl). 사용 칩의 주요 특징 중 하나 1,156 입방 마이크로 용기 (CF - 칩)을 최대 격자 각 120-300의 크기 X 300 X 300 μ (hxwxl) 또는 300 μ의 직경과 원형 recesses와 깊이 300 μ (R - 칩). 발판 10 미오를 집 수 있습니다. 3 차원 구성에 세포. 최적의 영양 및 가스 공급,이 칩은 생물 반응기의 주택에 삽입됩니다. 생물 반응기는 가장 간단한 구성에서, additionaly 롤러 펌프 및 가스 공급 중간 저수지 구성되어 있습니다, 폐쇄 steril 순환 루프의 일부입니다. 생물 반응기는 재관류, superfusion, 또는 혼합 작동 모드에서 실행할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 몇 주간의 기간 동안 세포 라인뿐만 아니라 기본 세포를 재배했습니다. 쥐의 주 간 세포에 대한 우리는 이상의 2 주 동안 organotypic 기능의 보존을 보여줄 수 있어요. 간세포암 세포 라인을 위해하거나 약간 표준 monolayer 문화에서 표현하지 간 특정 유전자의 유도를 보여 수 있습니다. 줄기 세포 라인 첫번째 차별화 실험 이후 줄기 세포 배양 시스템은 유망 것처럼 또한이 시스템은 유용할 수 있습니다.
Protocol
본 논문은 세포 라인뿐만 아니라 기본 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 플랫폼 (그림 1)의 사용을 설명합니다. 많은 세포는 3D - 환경에서 표현 organotypic 기능을 할 때문에, 우리는 세포가 모든 공간 방향으로 준수 수있는 발판을 제공하는 폴리머 칩을 개발, 그것은 유체 흐름의 제어를위한 생물 반응기의 주택에 설치할 수 있습니다 , 실험 설계에 따라 산소 장력 등은 고분자의 표면은 다양한 기법, 예를 들어, UV - 조사, PECVD, γ - 접목 또는 전통적인 서부 유럽 표준시 화학에 의해 수정할 수 있습니다.
그림 01
1. 데 - 폭기와 칩의 hydrophilisation
사용하기 전에 칩은 deaerated 및 hydrophilized 수 있습니다. 이를 위해, 알코올 시리즈는 수행됩니다. DMPC - 처리된 물 이소프로판올 100 %, 70 %, 50 %, 30 %로 구성된 이소프로판올 해결책이 준비되고 칩이 100 % 솔루션으로 시작, 각 농도에 담근이며, 30까지를 위해. 시리즈의 마지막 단계는 순수 디메틸 pyrocarbonate (DMPC) 처리 물로 구성되어 있습니다. 이 시점부터, 그것은 칩 젖어도 유지하는 것이 중요합니다.
2. 콜라겐 I 코팅
알코올 시리즈 후,이 칩은 일반적으로 쥐의 꼬리에서 콜라겐 전 솔루션으로 코팅됩니다. 0.2 % 초산 2 MG / ML의 콜라겐 주식 솔루션에서 30 μg의 콜라겐 단백질에 해당하는 나누어지는 150 μl의 최종 볼륨 DMPC - 처리된 물로 희석합니다. 10 μg의 콜라겐 I 당 cm 2 면적의 밀도 칩 표면의 콜라겐 코팅이 발생합니다.
3. 간세포암 세포의 접종
라인 형 간염 G2의 간세포암 세포는 trypsinized와 계산됩니다. 단기 실험 (1~6일) 5 * 10 6 세포는 각 칩 및 해당 컨트롤 6cm 조직 문화를 배양 접시에 주사를하고 있습니다. inoculte하려면 칩 5 * 10 6 세포를 150 μl 문화 매체 resuspended 및 칩의 microstructured 영역 (그림 2)의 상단에 표시됩니다. 나중에, 그것은 2~3시간위한 인큐베이터에 배치됩니다. 마이크로 용기에이 잠복기 동안 세포가 침전물과 콜라겐 I - 코팅 발판을 준수.
그림 2
4. 생물 반응기의 주택에 칩 삽입
잠복기 후, 칩은 인큐베이터에서 제거되고 생물 반응기의 주택에 탑재. 이를 위해, 클린 벤치 아래 preassembled 생물 반응기는 멸균 포장에서 제거되고 칩의 삽입을 허용 정도 분해. 이 칩은 신중하게 살균 포셉과 처리 및 칩과 어떤이 생물 반응기의 상단과 하단 구역의 세대 결과 물개 개스가 들어있는 홈에 배치됩니다. 그 다음, 생물 반응기를 다시 조립하고는 펌프에 연결되어있는 보육, 가스 공급 및 산소 분석기로 전송됩니다.
5. 시스템의 필링
즉시 생물 반응기는 중간 저수지에 연결되어로, 펌프 및 가스 폐쇄 순환 루프가 매체로 가득 공급. 이것은 칩의 상단을 통해 매체의 흐름으로 정의됩니다 superfusion가, 달성할 수있는 방법으로 3 방향 - 커넥터 위치에 의해 이루어집니다. 이것은 발판에서 세포를 제거하지 않고 생물 반응기 순환에서 동봉된 공기의 배출로 연결됩니다. 시스템이 완전히 매체 가득 후 3 방향 - 커넥터는 조직을 통해 칩 아래의 흐름으로 정의됩니다 재관류가, 달성할 수있는 방법으로 전환됩니다. 재관류 구성의 흐름은 hepatocytes 일반적으로 60-500 μl / 분 범위에서 세포의 요구에 조정됩니다.
6. 샘플링
실험을 진행하는 동안 매체 샘플 그려져 수 있습니다. 이 경우, 주사기는 매체 저수지 위에 멸균 포트에 연결되어 있습니다. 샘플링 후, 포트는 70% 이소프로판올로 소독하고 있습니다.
7. 하류 애플 리케이션을위한 칩에서 손상 세포의 분리
실험의 끝에서, bioreactors는 클린 벤치에 전송 및 이전 설명된대로 분해, 가스 공급 및 롤러 펌프에서 연결됩니다. 무균 포셉와 칩이 생물 반응기 하우징에서 제거, 배치3.5 cm 배양 접시에와 PBS로 씻어서. 그 후,이 칩은 microstructured 영역에서 세포를 분리하는 인큐베이터에서 5-15 분 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 % / 0.53mM)와 incubated입니다. 수집된 세포 현탁액을 600 G.에서 5 분 centrifuged입니다 세포는 다음 종래의 하류 애플 리케이션, 예를 들어, 총 RNA 또는 단백질 분리에 사용할 수 있습니다. 일상적으로 우리는 microarray 분석 및 실시간 RT - PCR을위한 총 RNA를 (파리 키트, 앰비온 주식 회사, 오스틴, 텍사스, 미국) 분리. 단백질 표정은 레이저 스캔 현미경으로 칩 내부의 세포의 immunohistochemical 얼룩 후 분석이다뿐만 아니라 유동세포계측법에 의해, 예를 들어, 그렇지 않으면 분석하실 수 있습니다.
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Discussion
우리는 적극적으로 perfused bioreactors의 마이크로 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반 플랫폼을 개발했습니다. 칩은 마이크로 사출 성형, 핫 엠보싱뿐만 아니라 마이크로 thermoforming 기술 3 생분해성 고분자 비 생분해성에서뿐만 아니라 제작하실 수 있습니다. 실험 설계에 따라 고분자의 표면은 UV - 방사선 사에 의해 수정할 수 있습니다. 표현 몇 가지 간 특정 유전자의 분석뿐만 아니라 간 특정 단백질 5,6의 분석에 의해 표시 수로 Hepatocyte 세포 라인뿐만 아니라 기본 쥐 hepatocytes가 성공적으로 이러한 장치에 재배하실 수 있습니다.
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Acknowledgments
우리는 우수 기술 지원 Mechthild Herschbach 및 Anke Dech 감사하고 싶습니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells | Other | ATCC | HB-8065 | |
| Collagen I from rat tail | Reagent | Roche Group | 11 179 179 001 | |
| PARIS kit | Reagent | Ambion | AM1921 | |
| Syto16 | Reagent | Invitrogen | S7578 | |
| anti cytokeratin 18 | Antibody | Abcam | ab668 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/100 in PBS |
| Anti E-cadherin | Antibody | Abcam | ab1416 | Primary Ab, Mouse monoclonal, used 1/50 in PBS. |
| Goat anti-albumin | Reagent | Bethyl Laboratories | E80-129 | Primary Ab, goat anti-human Albumin, used 1/200 in PBS |
| Rabbit anti-mouse IgG1 | Antibody | Invitrogen | A11059 | Secondary Ab, Alexa Flour 488 conjugated, used 1/100 in PBS + 0.5 % BSA |
| Cy3 anti-goat IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 705-165-003 | Cy3 AffiniPure donkey a-goat IgG Ab, used 1/700 in PBS + 0.5% BSA |
References
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