Summary
Qa-1 (인간에서 HLA-E) 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b 분자의 그룹에 속한다. Qa-1-바인딩 epitopes와 면역 조직 특정 면역 규칙을 증강 하 고 여러 자가 면역 질환 개선에 표시 되었습니다. 여기는 Qa-1 단백질에 epitopes의 식별에 겹치는 펩타이드 라이브러리 전략에 설명합니다.
Abstract
Qa-1 (HLA-E 인간) (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 최근 데이터 품질-1 분자 구조 및 기능적 무결성에 대 한 셀과 유도 하는 면역 조절, 제한 하는 바이러스 감염에 면역 반응에 중요 한 역할 놀이 것이 좋습니다. 또한, Qa 1 제한 CD8의 기능 확대 epitope를 통해+ T 세포 면역 여러 자가 면역 질환 동물 모델, 예를 들면 실험적인 알레르기 성 뇌에에서 치료 효과 보이고 있다 콜라겐 유도 관절염, 그리고 비 뚱뚱한 당뇨병. 따라서, 효율적이 고 신속 하 게 단백질의 기능적인 Qa 1 epitopes 식별할 수 있는 방법에 대 한 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리가 Qa 1 제한 CD8 사용 프로토콜 설명+ T 셀 라인 Qa-1 단백질에 epitopes를 결정 하기 위한 중복 펩 티 드 (OLP) 라이브러리에 대 한 특정. 이 OLP 라이브러리 포함 15-메 르 겹치는 펩 티 드, 단백질의 전체 길이 커버 하 고 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복. 이 프로토콜을 사용 하 여, 최근 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG)에서 9-메 르 Qa 1 epitope 파악. 이 새로 매핑된 MOG Qa-1 epitope epitope 관련, Qa 1 제한 CD8 유도 표시 했다+ T 세포는 향상 된 myelin 특정 면역 규칙. 따라서,이 프로토콜은 소설 대상의 미래 조사 및 Qa 1 제한 CD8의 기능을 위한 유용한+ T 세포.
Introduction
Qa-1 쥐에서 (MHC-Ib) 분자 비 고전 중요 한 조직 적합성 복잡 한 1b의 그룹에 속한다. 그것의 인간 상 동 기관이 이다 HLA. 이전 증거 Qa 1 분자는 중요 한 생물 학적 기능을 시연 하고있다. 첫째, Qa-1 분자 셀 구조 및 기능적 무결성에 대 한 조사에서 중요 한 역할을 한다. 이와 관련, Qa-1 분자는 세포의 정상적인 기능을 모니터링 하는 몇 가지 전략을 진화 했다. 이러한 전략 중 하나는 Qa-1 분자를와 처리 지도자 펩 티 드 (epitope), 즉 Qa-1 결정 한정자 (Qdm) 바인딩과 그물1에 고아 한 MHC i a 분자에서 처리 되는 양식 단지를 수 있습니다. Qa-1/Qdm 단지 나중 세포의 표면에 표시 하 고 바인딩합니다 NK 세포에 금지 NKG2A 수용 체를 억제 하는 활동2를 죽이 NK. Ia MHC 분자의 표현을 손실 됩니다, 셀 (예: 악성 셀)2를 죽이 NK에 민감한 됩니다. 다른 전략 Qa 1 분자를 탭 (항 원 처리와 관련 된 전송)의 결핍은 세포의 표면에 새로운 Qa-1/epitope 복합물을 형성 수 있습니다3 또는 ERAAP (바인딩과 그물 aminopeptidase와 관련 된 항 원 처리)4 (둘 다 결핍이 자주 악성 세포에 발생). 표현 하는 이러한 새로운 Qa-1/epitope 단지 셀 수 다음 인식 하 고 피토 프 전용 CD8 Qa 1 제한에 의해 제거+ T 세포. 둘째, Qa-1 분자 면역 규칙5유도. 이와 관련, Qa-1/epitope 단지 표시 되었습니다 CD8 자극+ 자체 조직6,,78 의 면역 중재 손상의 예방에 대 한 중요 한 규제 T (Treg) 셀 ,910. 셋째, Qa 1 제한 CD8+ Treg 세포 바이러스 감염11에 대 한 면역 반응 제한 표시 되었습니다.
따라서, 특정 확대 epitope 관련 Qa-1-restrictred CD8의+ T 세포는 비정상적인 세포의 제거, 면역 조절의 향상 및의 크기의 제어 잠재적으로 유망한 전략 바이러스-유도 된 면역 응답입니다. 동안 여부 결정 되지 않은 확대 epitope 관련 Qa 1 제한 CD8의+ T 셀 수 면역 감시를 강화 하 고 면역 반응을 유도 하는 바이러스를 제한, 우리의 실험실과 다른 사람 명확 하 게 증명 하는 Qa 1 epitopes와 예방접종 CD8 Qa 1 제한의 기능을 강화할 수 있습니다+ Treg 세포 병원 성 면역 CD4에 대 한 특정+ T 세포, CD4의 효율적인 제어를 선도+ T 세포 중재 면역 질환에는 실험적인 알레르기 성 뇌 (인간 다 발성 경화 증 동물 모델)6,10, 콜라겐 유도 관절염 (인간 류 마티스 관절염 동물 모델)7, 등 다양 한 동물 모델 및 비만 아닌 당뇨병 (인간 타입-1 당뇨병의 동물성 모형)8. 또한, 우리는 면역 조직 관련 Qa 1 epitope와 CD8의 확대를 통해 그 조직에 염증 면역 중재의 특정 컨트롤에 리드 발견+ Treg 세포12. 전 임상 연구의 위의 성공을 나타내는 Qa 1 epitope 접종 및 잠재적으로 수돗물에 결핍과 관련 된 다른 질병의 치료에 대 한 조직의 특정 면역 중재 질병의 치료에 대 한 완전 한 평가 대 한 필요와 ERAAP입니다.
따라서, 안정적이 고 신속 하 게 Qa-1 단백질에 epitopes 분석할 수 있는 기술에 대 한 수요가 있다. 이와 관련, 제한 된 수의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes 설명 하고있다. 대부분 이러한 Qa 1 epitopes의 CD8의 연구 기간 동안 serendipitously 발견 했다+ T 세포 박테리아13, 셀 탭3결핍, 셀 ERAAP4, 결핍 및 EAE6, 발생 하는 셀에 대 한 응답 9. 따라서, 높은 처리량 기술 정의 된 단백질의 생물학으로 중요 한 Qa 1 epitopes의 식별을 위해 바람직합니다. 다음, 우리를 사용 하 여 Qa-1-resrticted CD8 단백질에서 기능 Qa 1 epitopes는 겹치는 펩 티 드 (OLP) 라이브러리 전략 설명+ T 세포 단백질의 OLP 풀 (OLP_pool)에 대 한 특정 라인.
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Protocol
모든 실험 기관 동물 관리 및 사용 프로토콜 동물 관리 및 사용 텍사스 대학교 엘 파소 그리고 Loma Linda 대학에 위원회에 의해 승인에 따라 수행 되었다.
1. 단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 생성
- 설계는 OLP 라이브러리는 모든 펩 티 드, 길이 15-메 르 이며 인접 한 펩 티 드 11 아미노산에 의해 중복.
참고: MOG OLP 연구에 MOG 전조 [생쥐]의 시퀀스 검색 NCBI 단백질 데이터베이스에서이 링크를 수행 하 여: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. 집 고 양이 전조 (247 아미노산), 신호 및 성숙한 펩 티 드를 포함, 보고 된 Qa-1 (HLA-E) epitopes의 대부분은 신호 펩 티 드 (예: Qdm1)에 위치 해 있기 때문에 사용 되었다. 그것의 N-말단에서 시작, 15-메 르 펩 티 드의 시퀀스를 두 개의 인접 한 펩 티 드 11 아미노산 (그림 1)에 의해 중첩 확인 되었다. 따라서, 정확 하 게 59 OLPs 247 아미노산 MOG 전조에서 확인 되었다. 그러나, 마지막 OLP 단백질의 길이 따라 15-메 르 12에서 배열할 수 있다. 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택 하는 또한,+ T14,15 세포 CD8 epitopes 인식으로 처리 . - 상업적으로 각 개별 펩 티 드를 구입. 펩 티 드 당 5 mg 심사에 대 한 충분 해야 합니다. 잘린된 펩 티 드 (단계 6.1) OLPs desalted 펩 티 드 (순도 약 50-70%)를 하실 수 있습니다. 최적의 펩 티 드 (단계 6.2) tetramer의 세대와 미래 생물학 분석 사용 될의 순도 이어야 한다 > 90%. 무 균 조건 하에서 펩 티 드 reconstitute
- 100 %DMSO 50 mg/mL 개별 펩 티 드 주식을 확인 합니다. 각 펩 티 드의 5 mg 추가 각 튜브에 DMSO의 100 μ 혼합, 그리고-20 ° c.에 펩 티 드 저장 이러한 주식 CD8의 세대에 대 한 OLP_pool 재고를 확인 하는 데 사용 됩니다+ T 셀 라인 반응 하는 OLP_pool. 또한, 이러한 주식은 또한 만들기 위하여 이용 될 10 mg/mL OLP_pool 반응 CD8에서 Qa 1 제한 반응을 자극 하는 각 개별 펩 티 드의 능력을 결정 하기 위한 개별 펩 티 드 주식+ T 세포 라인.
- 신선한 관으로 각 펩 티 드의 동일한 볼륨을 추가 하 여 확인 OLP_pool 주식. 이 OLP_pool 주식 100 %DMSO 포함합니다. 집 고 양이 OLP 연구에서 59 OLPs12했다. 따라서, 농도 OLP_pool에서 각 펩 티 드의 847.46 μ g/mL (50 mg/mL ÷ 59) 이었다.
- 희석 (5 x) 10 mg/mL 개별 펩 티 드 주식 하 게 살 균 H2O (이 주식 포함 20 %DMSO) V 하단 96 잘 접시에서 50 mg/mL 주식. 각 개별 펩 티 드의 Qa 1 제한 응답의 결정 96 잘 접시 8 또는 12 채널 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다 때문에이 주식 96 잘 접시에 확인 합니다.
참고: 모든 펩 티 드, OLPs 및 잘린된 펩 티 드를 포함 하 여 V-하단 96 잘 접시에 희석 해야 합니다 또는 96-잘 샘플 랙 가득 1 mL 튜브 때문에 펩 티 드 라이브러리 심사 96 잘 접시 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 수행 됩니다. 경우에 희석 한 펩 티 드, 펩 티 드를 분해 수 있도록 현명한 1 N NaOH 방울을 추가 하는 것이 어렵습니다.
2. 못쓰게 K의b-/- Db-/- CD8+ OLP_pool 펄스 k T 세포b-/- Db-/- 모 수석 세포 (DCs).
참고: 두 개의 주요 Qa 1 대립 유전자에 있다: 하나는 Qa-1는, 그리고 다른 Qa-1b. 학술 연구에 대 한 일반적으로 사용 되는 동물, 이후 예 C57BL/6, Balb/c 마우스, Qa-1b,이 프로토콜 매핑 Qa-1b epitopes는 단백질에 대 한 절차를 설명 합니다. CD8+ T이이 프로토콜에 사용 되는 세포에서에서 순화 된다b-/-Db-/- 는 CD8에 마우스 (C57BL/6 배경)+ T 세포 Qa-1 등 아닌 클래식 Ib MHC 분자에 의해 주로 제한 됩니다.
- 앞에서 설명한12골 파생 된 Dc를 생성 합니다.
- 간단히, RPMI-10 매체 (RPMI 1640 10% 태아 둔감 한 혈 청, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 골 수 단일 셀 정지 (1 x 106 셀/mL)를 문화 10 U/mL IL-4를 포함 하는 6-잘 접시 (4 mL/잘) 37 ° C, 5% CO2에서 100 U/mL GM-CSF.
- 2 일 후, 신중 하 게 비 부착 한 세포를 제거 하 고 신선한 미디어와 cytokines를 추가 합니다.
- 또 다른 2 일 동안 세포를 배양 한 후 신선한 미디어와 cytokines 새로운 6 잘 플레이트에 포함 된 비 부착 한 세포를 전송 합니다.
- 또 다른 2 일 셀 문화 및 신선한 미디어와 LPS를 포함 하는 cytokines 보충 (0.1 µ g/mL)는 Dc를 활성화.
- 24 시간 후, 실험에 대 한 Dc를 수집 합니다.
- 3000 래 드와 Dc 비추는
- 또는, 미토마이신 C와 Dc (5 x 107 셀/mL)을 치료 (50 μ g/mL) 20 분에 대 한 37 ° C에서 PBS에 추가할 RPMI-0 (혈 청 없이 RPMI 1640) (~ 12 mL) 튜브를 g. 삭제 supernatants repea x 300에 탁상 원심 분리기에서 10 분에 대 한 셀을 회전 t 세척 절차 두 번 더입니다. 이러한 세 가지 세척은 중요 한 어떤 추적 미토마이신 C 양의 CD8의 응답을 억제 수 있습니다 때문에+ T DC-T 세포 공동 배양 중 세포.
- 5 x 106 셀/ml 혈 청 무료 매체 (목표-V 세럼 무료 매체 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1mm 나트륨 pyruvate, 0.1 m m 불필요 한 아미노산 보충)에 DC 농도 조정 합니다.
- 최종 DMSO 농도 0.5% (200 x) 일 것 이다 그런 Dc에 100 %DMSO 포함 하는 OLP_pool 재고 솔루션을 추가 합니다. 집 고 양이 OLP 연구에는 OLP_pool에서 각 OLP의 농도 847.46 μ g/mL; 따라서 DC 문화에 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL (847.46 μ g/mL ÷ 200) 이었다.
참고: CD8+ T 마우스 비장 및 림프절에서 셀 제조업체에서 제공한 지시를 따라 CD8 긍정적인 격리 키트를 사용 하 여 순화 될 수 있다. CD8+ T 세포 얻은 구슬의 자유롭다.
3. 끝났다 CD8 restimulation+ T 세포와 대 식 세포는 OLP_pool와 펄스
- OLP_pool 액 CD8의 다시 자극 하기 전에 4 일+ T 세포, 2% (v/v) polyacrylamide 비드 솔루션 준비: 20 mL에 두 번 polyacrylamide 구슬의 2 세대를 세척 하 여도 무료 H2O 또는 PBS. 5 분 동안 원심 분리 (400 x g)에 의해 작은 공의 polyacrylamide 구슬 고 100 mL PBS의에서 resuspend. 압력솥에서 15 파운드/m 실 온에서 20 분이 게에 대 한.
- Intraperitoneally 살 균 2 %polyacrylamide 비드 솔루션의 복 막 구멍16에 monocytes/대 식 세포의 마이그레이션 유치 1 mL/마우스와 함께 쥐를 주사.
- 4 일 후, CO2 과다 하 여 동물을 희생.
- 무 균 조건 하에서 잘라는 작은 여 복 부의 중심에는 오프닝은 충분히 5 mL 전송 피 펫을 전달. 전송 피 펫 RPMI-0와 개방을 통해 복 부 캐비티에 피펫으로 삽입.
- Pipetting으로 복 부 구멍을 씻어. (이들은 복 막 대 식 세포) 무 균 튜브에 복 부 구멍에서 가능한 많은 액체 밖으로 플라스틱. 린스 단계 4-5 회 반복 합니다.
- 3000 래 드와 복 막 대 식 세포 비추는
- 또는, 미토마이신 C와 복 막 세포 (2.2 단계에에서 설명 된 절차를 따르십시오.) 취급 합니다.
- 5 x 106 셀/ml 혈 청 자유로운 매체에 복 막 대 식 세포의 농도 조정 합니다. OLP_pool 재고 (최종 DMSO 농도 1% 미만)와 M-CSF를 추가 (최종 농도 = 100 U/mL).
참고:이 집 고 양이 OLP 연구에서 0.5 %DMSO 사용 우리. 따라서, 집 고 양이 OLP_pool 주식 MOG OLP_Pool 재고 복 막 대 식 세포의 199 μ에 추가 되었습니다 (예: 1 μ) x 희석된 200 했다. 따라서, 각 OLP의 최종 농도 4.2 μ g/mL) 했다. - 48-잘 조직 문화 접시에서 200 μ/잘 (1 x 106 셀/잘)을 추가 하 고 37 ° C 4 h에서 접시를 품 어.
- 비 부착 한 세포는과 polyacrylamide 구슬 200 μ/잘 미리 따뜻하게 RPMI-0의 부드러운 세척 하 여 제거 합니다.
- 수집 및 수영장은 OLP_pool 액 CD8 단계 2.10에서+ T 세포. 조정 하는 OLP_pool 액 CD8+ 1 x 106 셀/ml 25 U/mL 일리노이-2와 일리노이-7의 50 U/mL를 포함 하는 혈 청 자유로운 매체에 T 세포 농도. OLP_pool 펄스 복 막 대 식 세포를 포함 하는 48-잘 접시를 1 mL/음을 추가 합니다.
- 4 일 후, 48-잘 접시에 매체를 보충. 제거 하 고 약 400 μ 48-잘 배양 배지에서 배양의 삭제. 각 우물에 신선한 혈 청 무료 중간 포함 100 U/mL의 일리노이-2 500 μ와 일리노이-7의 100 U/mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2셀 문화.
- 3 ~ 4 일 후, 검사 OLP_pool restimulated CD8 효소 연결 된 immunospot 분석 결과 (ELISPOT)에 의해 OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답+ T 세포. 이 시점 후 다시 자극 하는 CD8+ T 세포 모든 7-10 일.
참고: 대 식 세포는 OLP_pool 액 CD8의 다시 자극에 대 한 선호+ T 세포. 우리가 나타났습니다 CD8+ T 세포 대 식 세포에 의해 다시 자극된 Dc 시험관보다 더 성장 했다.
4. OLP_pool-특정의 결정, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8 T 세포 라인+
참고: OLP_pool 전용, Qa 1 제한 응답 OLP_pool restimulated CD8에서+ T 셀 라인 IFNγ 분 비 자극 C1R 또는 C1R 있을 때 OLP_pool에 의해 다음에 의해 결정 됩니다. Qa-1b 세포 IFNγ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. C1R 셀 상업적으로 얻어질 수 있다. C1R입니다. Qa-1 lentiviral 벡터와 C1R 셀 시험으로 Qa-1b 세포를 생성할 수 있습니다.
- 추가 캡처 안티-IFN-γ 항 체의 100 μ/잘 ELISPOT 격판덮개의 우물에 코팅 버퍼 (PBS)에 희석 합니다.
- 또는, C1R와 C1R 취급 합니다. 미토마이신 C 제외 하 고 치료 시간이 30 분 일 것 이다 단계 2.2에 설명 된 대로와 Qa-1b 세포.
5. 결정 개별 펩 티 드의는 OLP_pool에는 OLP_pool 전용 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는+ T 셀 라인
- 결정 개별 펩 티 드 OLP_pool 전용, OLP_pool 전용 CD8에서 Qa-1-restrictred IFN-γ 분 비를 자극 하는+ 위의 사용 하 여 T 세포 선 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 (최종 농도 사용 각 개별 펩 티 드의 설명 ELISOPT에 대 한 분석 결과가 이다 10 μ g/mL). 그림 3에 대표적인 결과 참조 하십시오.
참고: OLP-특정, Qa-1-restircted 응답 C1R 존재 응답의 적어도 세 번은 응답으로 정의 됩니다. Qa-1b 세포는 OLP 없이. 집 고 양이 OLP 연구, OLP68, OLP96, 및 OLP105에서 모두이 기준을 만났다. 따라서, 모든 3 개의 OLPs는 잠재적으로 Qa 1 epitopes12 (그림 3)를 포함합니다. 그러나, OLP105는 일관 되 게 강한 응답; 준 따라서 우리는 OLP105의 상세한 분석을 수행 (그림 4 및 그림 5)12.
6. 신분증 OLP_pool 전용 CD8에 피토 프 전용, Qa 1 제한 응답을 자극 하는 15-메 르 OLP에 최적의 Qa 1 Epitope의+ T 셀 라인
- C-와 N-말기 잘린 그림 4와 같이 15-메 르 OLP의 펩 티 드를 음성 합성.
- OLP 특정 CD8에서 IFN-γ 분 비 검사+ 자극 하는 CD8 T 세포 라인+ T C1R 또는 C1R 있을 때 부모의 15-메 르 OLP 잘린된 펩 티 드의 각 세포. 위의 사용 하 여 Qa-1b 셀 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 설명 합니다. 각 개별 펩 티 드 ELISPOT 분석 결과 대 한 사용의 최종 농도 10 μ g/mL 이다. 펩 티 드 경우 최적의 Qa 1 epitope로 정의 된다 펩 티 드: 1) 일관 되 게 원래 15 메 펩타이드, C1R 존재에 비해 비슷하거나 더 강한 IFN-γ 응답을 제공. Qa-1b 세포; 2)는 8-10 메 르 (9-메 르 펩타이드 선호) 사이 MHC에 바인딩된 펩 티 드 길이-나 분자15,17. 대표 결과 그림5에서를 참조 하십시오.
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Representative Results
단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 디자인
단백질의 N-말단에서 시작, 각 펩 티 드 15 아미노산 (15-메 르)입니다. 따라서, 첫 번째 펩 티 드 15 위치로 1 위치에 걸쳐. 두 번째 펩 티 드의 N-말단 겹치면 11 아미노산에 의해 첫 번째 펩 티 드의 C-터미널. 따라서, 두 번째 펩 티 드에 걸쳐 위치 19에 위치 5. (그림 1) 단백질의 C-말단의 끝에는 펩 티 드의 나머지 부분을 디자인 합니다. 우리는 우리와 다른 것으로 나타났습니다 15-메 르 펩 티 드, 또는 대 식 세포, 모 수석 세포 (DCs)에 추가 될 때 효율적으로 될 수 있기 때문에 15-메 르 라이브러리 선택+ T14,15세포 CD8 epitopes 인식으로 처리. 라이브러리에 있는 OLPs의 수는 단백질의 길이에 따라 달라 집니다. 또한, 마지막 OLP 단백질의 길이 따라 15-메 르 12에서 배열할 수 있다. 예를 들어 myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) 247 아미노산의 길이 있다. 집 고 양이 OLP 라이브러리 포함 59 OLPs12. 이 원고에 제시 하는 대표적인 결과 MOG OLP 라이브러리의 분석에서.
OLP_pool 자극 CD8에서 OLP_pool 관련, Qa 1 제한 응답의+ T 셀 라인
우리는 CD8 생성+ k 액은 T 세포 라인b-/-Db-/- Dc MOG OLP_pool (MOG_pool)와 펄스와 펄스 MOG_pool k restimulatedb-/-Db-/- 에 설명 된 대로 복 막 대 식 세포는 위에서 언급 한 프로토콜 (프로토콜 1, 2, 및 3). 이 CD8에 잠재적인 MOG_pool 전용, Qa 1 제한 응답을 확인 하려면+ T 셀 라인, 우리 시험이 CD8의 응답+ C1R 또는 C1R 존재 MOG_pool에 T 세포 라인. Qa-1b 세포 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 (그림 2) (4 단계 프로토콜)를 사용 하 여. 우리의 데이터 MOG_pool 자극 CD8 보여주었다+ T 세포 선 분 비 C1R 존재 IFN-γ의 낮은 수준. Qa-1b 세포 (세포 또는 SFCs를 형성 하는 32 자리) 하지만 하지 C1R 셀 (SFCs 2),+ T 세포는 Qa 1 바인딩 epitopes C1R 셀 (C1R 셀은 인간의 B lymphoblastoid 세포)에서 파생 된 응답 CD8의 존재를 제안. SFCs는 MOG_pool C1R 셀 (78 SFCs), 포함 된 우물에 추가 될 때 증가 했다+ T 세포는 비-Qa-1 epitopes 응답 CD8의 존재를 제안. SFCs는 MOG_pool C1R 포함 된 우물에 추가 될 때에 극적으로 증가 했다. Qa-1b 세포 (320 SFCs), CD8의 존재를 제안+ T 세포는 Qa 1 바인딩 펩 티 드에 응답. 데이터는 또한 Qa 1 바인딩 epitope(s)는 MOG_pool에 포함 되어 있음을 보여 줍니다.
결정 개별 펩 티 드의는 OLP_pool에서 OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비에 공헌 하는+ T 셀 라인
MOG_pool-반응성 CD8에 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는 OLP_pool에서 펩 티 드를 확인 하려면+ T 셀 라인, 우리 MOG_pool 반응 CD8 자극 중 C1R 존재 개별 59 OLPs와+ T 세포 또는 C1R입니다. Qa-1b 세포 (그림 3) (프로토콜 단계 5). 우리의 데이터는 몇 SFCs C1R 전지와 OLPs를 포함 하는 우물에서 관찰 되었다 보여주었다. 대조적으로, SFCs C1R 포함 모든 우물에서 증가 했다. Qa-1b 세포와는 OLPs. 그림 2에서 우리가 배운 CD8 C1R 존재+ T 세포. Qa-1b 혼자는 또한 SFCs를 형성 했다. 따라서, 대부분 스에서 증가 SFCs는 Qa-1 분자에 의해 C1R 세포에서 세포내 단백질에서 파생 된 Qa 1 epitopes의 프레 젠 테이 션으로 인해 일반적인 자극 때문일 수 있었다. 그러나, 그림 3C (B8, D12, 그리고 E9), 3 일치 3 프레임된 우물에 OLPs 그림 3A (OLP68, OLP96, 및 OLP105)에 OLPs을 강조, OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 응답으로 정의 하기 위한 기준 충족 프로토콜 단계 5.112에서 설명합니다. 데이터 품질-1 epitope(s) 3 OLPs 포함 하는 것이 좋습니다. 이후는 OLP105는 일관 되 게 가장 높은 응답을 생산, 우리는 OLP10512의 상세한 분석을 수행.
15-메 르 OLP에 대 한 잘린된 펩타이드 라이브러리의 디자인
OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하 결정 되었습니다 15-메 르 OLP+ T 셀 라인, 잘린된 펩타이드 라이브러리를 사용 하 여 최적의 epitope에 대 한 분석 필요. 이러한 잘림된 펩타이드 라이브러리는 점차적으로 1 아미노산에는 N-와 C-테르미니 (그림 4)에 의해 15-메 르 OLP를 잘라내기에 의해 설계 되었습니다. 다른 비슷한 MHC 종류 I 분자, Qa-1 분자는 주로 8-10 메 르 펩 티 드를 바인딩할. 따라서, 짧은 잘린된 펩타이드는 길이 6-메 르 하는 것이 좋습니다.
OLP_pool-반응성 CD8에서 Qa 1 제한 IFN-γ 분 비를 자극 하는 15-메 르 OLP에 최적의 Qa 1 epitope의+ T 셀 라인
펩 티 드 위의 N-와 C-말기 잘리지는 CD8에서 IFN-γ 분 비를 자극의 강도 대 한 테스트는+ 는 OLP_pool 또는 위에서 설명한 IFN-γ ELISPOT를 사용 하 여 15-메 르 OLP에 대 한 특정 T 세포 라인. 집 고 양이12Qa 1 epitopes의 연구에서 우리는 CD8 생성+ MOG OLP105에 대 한 특정 T 셀 라인 (그림 5A). 추가 분석 하는 N-말기 잘린된 9 메 르 펩 티 드로 최적의 epitope에 대 한 두 가지 조건 프로토콜 단계 6.2 (그림 5B)에 설명 된 시연 했다. 따라서, 우리는 N-말기 9 메 잘린 결론 펩 티 드 최적의 Qa 1 epitope를 했다.
그림 1: 단백질의 전체 길이 덮고 OLP 라이브러리의 디자인. N-말단에서 시작, 펩 티 드 아미노산 (15-메 르) 길이 15의 확인 되었다.11 아미노산 이전 펩 티 드의 C terminus와 겹쳐지는 경우 첫 번째 펩 티 드를 제외한 각 펩 티 드의 N terminus.
그림 2: MOG_pool 자극 CD8+ T 세포 했다 부분적으로 MOG_pool 특정 및 Qa 1 제한12. 생체 외에서 CD8+ T 세포 MOG OLP_pool (MOG_pool)에 의해 자극된 응답 C1R 또는 C1R 있을 때 MOG_pool 조사 했다. Qa-1b 세포 항 원 제시 하는 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여 셀으로. 대표 ELISPOT 이미지 표시 됩니다. 숫자의 자리를 형성 세포 (SFCs) 각의 왼쪽된 상단 모서리에 표시 됩니다. CD8+ T 세포: 50, 000 셀/잘. C1R 또는 C1R입니다. Qa-1b 세포: 200, 000 셀/잘.
그림 3: Qa-1에 대 한 책임은 MOG_pool에서 OLPs의 분석 응답 제한. (A) 사이트 10 mg/mL를 포함 하는 V-하단 96 잘 접시의 개별 MOG OLPs. 우물에 숫자 표현 OLP Id. 강조 표시 된 3 웰 스 포함 프로토콜 단계 5.112의 설명 대로 OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 대응에 대 한 조건을 충족 하는 OLPs. (B) 대표 SFCs는 OLP에 포함 된 각 잘에서 (최종 농도 = 4.2 μ g/mL, OLP ID 일치 하는 "A"), MOG_pool-반응성 CD8+ T 세포 (50, 000 셀/잘), 그리고 C1R 셀 (200, 000 셀/잘). (C) 대표 SFCs는 OLP에 포함 된 각 잘에서 (최종 농도 = 4.2 μ g/mL, OLP ID 일치 하는 "A"), MOG_pool-반응성 CD8+ T 세포 (50, 000 셀/잘), 그리고 C1R. Qa-1b 세포 (200, 000 셀/잘). 3 프레임된 웰 스는 OLP 관련, Qa 1 제한 IFN-γ 응답12에 대 한 조건을 충족 하는 OLPs 포함 되어 있습니다. 그림 참조12에서 적응 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 15-메 르 펩 티 드의 잘린된 펩 티 드의 디자인. 15-메 르 펩 티 드 6-메 르를 1 아미노산에 의해에서 그것의 N-와 C-테르미니 잘렸습니다 점차적으로. 15-메 르와 그 잘린된 펩 티 드 합성 후 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5:는 OLP105에서 최적의 Qa 1 epitope의 분석. (A) OLP105 자극 CD8+ T 셀 라인 OLP68, OLP96, 및 OLP105 C1R 또는 C1R 존재에 대 한 응답에 대 한 조사 되었다. Qa-1b 세포는 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. 대표 IFN-γ SFCs (왼쪽된 상단 모서리에 번호) 표시 됩니다. (B) OLP105 전용 CD8+ T 셀 라인, (A)와 같이 조사 되었다 응답 개별 N-와 C-말기 잘립니다 펩을 그림 4, C1R 존재. Qa-1b 세포 IFN-γ ELISPOT 분석 결과 사용 하 여. OLP105: 15-메 르 OLP입니다. N6-14: N 말기 OLP105 펩 티 드를 잘립니다. C 6-14: C 말기 OLP105 펩 티 드를 잘립니다. CD8+ T 세포: 50, 000 셀/잘. C1R입니다. Qa-1b 세포: 200, 000 셀/잘. 숫자 50000 CD8 당 SFCs+ 은 모서리를 왼쪽 상단에 T 세포. 빨간색 사각형 표시 6.2 프로토콜 단계에 설명 된 대로 OLP에 최적의 Qa 1 epitope를 정의 하기 위한 조건에 잘. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기, 우리는 Qa-1 단백질에 epitopes를 분석 하기 위한 프로토콜을 설명 했습니다. 이 프로토콜에 관하여 여러 가지 다른 전략 또한 이전 보고 했다. 첫째, 수용자 CD8+ T 세포와 클론 Qdm1의 식별을 위해 사용 되었다. 둘째, Qdm의 분석에서 상 상속 Qa 1 바인딩 모티브 HSP60p216-224와 TCRBV8.1 epitope9,18의 식별을 위해 사용 되었다. 단백질에서 셋째, 개별 겹치는 펩 티 드 면역 동물을 사용 했다. 그 후, CD8+ T 세포 면역된 동물에서 분리 된 TCRBV8.2 펩 티 드 p42-50 Qa-16,,1019바인딩 확인 이후에 식별 하기 위해 사용 되었다. 넷째, 기능 CD8+ T 세포 cDNA 디스플레이 라이브러리와 함께에서 라인 FL9 Qa-1 epitope4의 식별을 위해 사용 되었다.
이전 기술, 수용자 CD8의 사용에 관하여+ T 세포 선 및 5 월 클론 생리 적 면역 반응 동안 제시 Qa 1 epitopes를 분석 하는 데 적합 하지 않을. 또한, 축적 데이터는 앞에서 설명한 바인딩 모티브 Qa-1 분자의 펩 티 드-바인딩 용량을 표시 부분적 으로만 수 있습니다 것이 좋습니다. 따라서, 정확한 Qa 1 바인딩 모티브는 여전히 알 수 없습니다4. 또한, 예방 접종 Qa 1 epitopes의 식별에 대 한 개별 펩타이드와 힘 드는입니다. 마지막으로, cDNA 디스플레이 라이브러리 전략 수행 세포 transfection에 대 한 다른 펩 티 드 길이 많은 벡터의 건축을 포함 한다. 여기에 설명 된 OLP 라이브러리 전략 간단 하 고 매핑된 펩 티 드 Qa 1 제한 CD8 자극으로 알려져 있습니다 반대로,+ T 세포. 따라서, 우리의 전략 독특한 장점이 있습니다.
설명 하는 전략은 여기 OLP_pool 전용 CD8 사용 하 여+ T 세포는 체 외에서 못쓰게 하 고 restimulation에 의해 생성 됩니다. CD8의 대안 소스+ T 세포 림프 노드 k의 배수에서 수b-/-Db-/- 소스 단백질20접종은 마우스. 이러한 면역 CD8+ T 세포 다음 IFN-γ 응답 OLPs 및 Qa 1 epitopes의 식별을 위해 잘린된 펩 티 드에 대 한 시험 될 수 있다. 이론적으로는 비보에 면역 CD8+ T 세포는 가까이 생리 조건 보다는 생체 외에서 생성 된 CD8+ T 세포. 그러나, 우리는 면역 CD8 응답 발견+ T 세포 면역된 생쥐에서 직접 정화는 약하고 자주 필요한 생체 외에서 restimulations 심사 결과 만족 스러운 펩 티 드에 대 한. 또한,이 프로토콜은 HLA-E epitopes 점에서 vivo에서 예방 접종은 실용적의 인간 연구에 미래 번역을 위해 설계 되었습니다.
기술적으로,이 프로토콜의 중요 한 부분 이다 CD8 세대 라인+ T 세포는 OLP_pool 또는 개별 OLP에 대 한 특정. 때문에 Qa 1/펩 티 드 복합물은 후 항 원 제시 세포는 OLPs 또는 펩 티 드 펄스는 고아 한 MHC-나/펩 티 드 복합물21에 비해 불안정, 펄스 셀 광범위 하 게 세척 하지 해야 합니다. 우리는 펩 티 드 펄스 셀, 광범위 하 게, 세척 하는 경우 손실 또는 CD8 자극 하는 능력을 크게 줄일 발견+ T 세포. 따라서, 즉시 전에 그들은 CD8와 공동 경작 한 번 세포 항 원 펩 티 드 펄스 제시 세척이 좋습니다+ T 세포.
또한, Qa 1/펩 티 드 복합물의 불안정성이 좋습니다 펩 티 드 펄스에 대 한 혈 청 자유로운 매체의 사용과 CD8 자극+ T 세포. 또한, 정기적으로 CD8 동안 50 U/mL 일리노이-7의 추가+ T 세포 배양으로 동안 IFN-γ ELISPOT 분석 결과. 일리노이-7의 목적은 생존 CD8의 기능을 유지 하기 위해+ T 세포. 일리노이-7 자체적으로 CD8를 자극 하지 않습니다+ T 세포가 IFN-γ를 생산.
마찬가지로 모든 전략, Qa 1 epitopes이이 전략에 또한 필요 추가 조사 생물학 의미 합니다. 예를 들어 하나의 중요 한 질문은 매핑된 epitope를 생리학적으로 제공 될 수 있는 여부. 이 문제를 해결 하려면 DCs lentiviral 벡터를 표현 하는 epitope 소스 단백질 (예: MOG OLP에 MOG 연구)으로 불리고 있습니다. Epitope 특정 CD8의 응답 후,+ T 세포 transduced Dc로 검사 됩니다. 긍정적인 응답 제안 하는 epitope 수 순수 처리 하 고 Dc에 의해 제시 합니다. 또한, CD8에 의해 epitope 인식 결과로 기능 결과+ T 세포를 더 조사 해야 합니다. 이와 관련, Qdm과 FL9 Qa-1 epitopes의 분석은 Qa 1 분자는 면역 감시1,4에 대 한 중요 한 결론에 이르렀다. 또한, HSP60p216, TCRBV8.1 펩 티 드의 연구와 p42-50 그 Qa 1 제한 CD8 결론에 지도+ T 세포 병원 성 CD4 타겟팅을 통해 면역 반응 조절+ T 세포 6,7 ,,919. 또한, MOG196 의 연구는 처음으로 공개 하는 Qa 1 제한 CD8+ T 세포 직접 잠재적으로 병원 성 면역 세포12에 의해 손상에서 그것을 방지 하기 위해 조직을 대상으로 면역 반응 조절 수 . 마지막으로, 피토 프 전용, Qa 1 제한 CD8의 기능 분석+ T 셀 tetramer에 의해 지원 될 수 있습니다. 이러한 tetramer NIH tetramer 핵심 시설 (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) 또는 회사에서 생산 수 있습니다. tetramer의 생성을 요청 하나 Qa 1 tetramer의 세대에 대 한 그들의 승인을 위해 새로 매핑된 최적의 Qa 1 epitope Qa-1 단백질의 바인딩을 지원 기능 데이터를 보낼 수 있습니다.
끝으로, 이전 학문은 설명 했다 그 Qa 1 제한 CD8+ T 세포12현지 면역 반응 규칙에서 중요 한 역할. 이와 관련, 조직 손상 면역 반응을 직접 대상 조직에 의해 발생할 수 있습니다. 또한, 부수적인 손해는 침입 병원 체는 면역 반응에 의해 발생할 수 있습니다. 따라서,+ T이 두에서 세포 CD8 Qa 1 제한의 역할을 이해 다른 조직 손상의 임상 응용 프로그램에 대 한 중요 하다.이 위해 Qa-1 자기 조직 또는 침입 병원 체에서 epitopes의 철저 한 분석 필요 하다. 이 프로토콜은 이러한 분석에 대 한 적절 한 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
우리는 그녀의 기술 지원 및이 원고 준비에 대 한 페넬로페 가르시아를 감사합니다. 이 작품은 Loma Linda 대학 (681205-2967)에서 약 학과에서 연구 혁신 그랜트 (RIG)와 XT에 국가 다 발성 경화 증 사회 (PP1685)에서 파일럿 그랜트에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
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