Analyse automatisée Gait chez la souris avec la blessure de Constriction chronique

Summary

L’évaluation précise de la réponse de la douleur chez un modèle animal neuropathique est critique pour étudier la physiopathologie des maladies de douleur et élaborer de nouveaux analgésiques. Nous présentons une méthode sensible et objective pour déterminer la fonction sensorielle du rongeur hind patte par un système d’analyse automatisée de démarche.

Abstract

Le critère de von Frey est une méthode classique qui a été largement utilisée pour examiner la fonction sensorielle des animaux de la douleur neuropathique. Toutefois, il a quelques inconvénients tels que les données subjectives et l’exigence d’un expérimentateur habile et expérimenté. A ce jour, diverses modifications ont amélioré la méthode de von Frey, mais il a encore quelques limitations. Des rapports récents ont suggéré que l’analyse de la démarche produit des données plus précises et objectives des animaux neuropathiques. Ce protocole montre comment effectuer l’analyse automatisée de démarche pour déterminer le degré de la douleur neuropathique chez la souris. Après plusieurs jours d’acclimatation, les souris étaient autorisés à circuler librement sur le plancher de verre pour éclairer les empreintes. Puis, quantification de l’empreinte et la démarche ont été effectuées par le biais de clips vidéo avec analyse automatique des différents paramètres de marche, tels que la zone de temps patte pour l’impression, swing, angle de patte, etc.

L’objectif principal de cette étude est de décrire la méthodologie de l’analyse de la démarche automatisée et brièvement le comparer avec les données de l’essai sensoriel classique à l’aide de filaments de von Frey.

Introduction

Les changements pathologiques du système nerveux induite par un dysfonctionnement métabolique, inflammation, infection, traumatisme, ischémie, ou maladie auto-immune occasionnellement entraîner des douleurs neuropathiques, qui sont définie comme une douleur résultant en conséquence directe d’une lésion ou maladie affectant le système somatosensoriel¹. La douleur neuropathique est souvent insupportable, et malheureusement, analgésiques classiques ne produisent généralement pas suffisamment la douleur soulagement². Une caractéristique importante de la douleur neuropathique contient spontanées et induite par la stimulation des douleurs (c.-à-d., allodynie et hyperalgésie). Allodynie est une réponse nociceptive qui se produit à des stimuli normalement non douloureuse, comme toucher léger ou stimulation chaude. Hyperalgésie indique une réponse de douleur accrue à des stimuli nociceptifs mécaniques et/ou thermiques³. Bien que ces deux symptômes menacerait gravement la qualité de vie des patients, allodynie mécanique évoqué par stimulation tactile légère est le symptôme le plus exaspérant car contact doux est difficile d’éviter dans la vie quotidienne.

Pour étudier le mécanisme sous-jacent et nouveaux analgésiques pour le traitement des douleurs neuropathiques, la mesure précise de la réponse de la douleur est indispensable. Nombreux modèles de douleur neuropathique animaux ont développé des réponses nociceptives sur la postérieur patte zone en raison de sa grande accessibilité^4,5,6,7. Ainsi, la plupart des évaluations réponse de douleur ont été réalisées sur la surface plantaire ou dorsale de la patte arrière en appliquant des stimuli mécaniques à l’aide d’instruments spéciaux, tels que les filaments de von Frey. Une des méthodes plus fréquemment utilisées est le haut et vers le bas de la méthode décrite par Dixon⁸ et les versions ultérieures modifié les versions^9,10. Cependant, très habiles et expérimentés expérimentateurs sont nécessaires pour effectuer le test de von Frey et les résultats peuvent être subjectifs.

Le système d’analyse automatisé démarche peut enquêter sur les troubles neurologiques et neuromusculaires en mesurant différents paramètres de la marche en se déplaçant librement des rongeurs. Dans une variété de modèles animaux de lésion du nerf, le degré de la nociception et l’effet antinociceptif de plusieurs traitements peuvent être évaluées sans ajouter une douleur stimulation^{11,12,13, 14}. ce système d’analyse peut détecter les paramètres de la démarche statiques et dynamiques, tels que : patte imprimée (la zone de l’empreinte de patte complète que les contacts avec le sol), patte d’intensité (l’intensité moyenne de la zone contact de patte), "Stridez" de longueur (le position de la distance entre les placements successifs du même pied), phase (la durée de contact avec le sol pour une seule patte arrière), séquence (l’ordre dans lequel les quatre pattes sont placés sur le plancher), swing (la durée de la phase pendulaire) et vitesse (calculée d’oscillation de "Stridez" longueur et swing durée et exprimée en pixels par seconde). Cet article illustre l’utilisation d’un système d’analyse et fournit une brève comparaison des données avec le critère de von Frey constriction chronique blessures (CCI) neuropathique chez des souris.

Protocol

toutes les expériences ont été menées conformément à l’éthique professionnelle de l’Association internationale pour l’étude de la douleur et ont été approuvés par le Comité de l’emploi et d’animalier institutionnel à l’Université nationale de Chungnam ( Daejeon, Corée du Sud).

1. induction de la CCI sur le nerf sciatique

1. maison ICR des souris mâles pesant 20-25 g sous un cycle lumière/obscurité de 12 h à température ambiante contrôlée (maintenue à 20-25 ° C) et humidité (40-60 %), avec libre accès à la nourriture et eau. Permettre une période d’acclimatation pour les souris dans la salle de soins aux animaux d’au moins 1 semaine avant la chirurgie.
   1. Au cours de l’habitation, observer l’apparence et le comportement des souris et n’utilisent pas de souris montrant l’activité locomotrice anormale.
      Remarque : Un jour avant la chirurgie de la CCI, mesurer la sensibilité mécanique de la patte arrière en appliquant des filaments de von Frey et effectuer l’analyse automatisée de démarche pour obtenir les valeurs de la ligne de base normale. Ensuite, assigner souris au hasard à contrôle et groupes expérimentaux.
2. Le jour de la chirurgie, anesthésier les souris en injectant 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg, voie intrapéritonéale (IP)).
   NOTE : Porter des équipements de protection individuelle tels que casaque, gants et masque.
   1. Pèse 2,5 g de 2,2,2-tribromoethanol et ajouter le 2-méthyl-2-buthanol au volume final de 5 mL. Conserver la solution loin de la lumière (par exemple, utiliser un récipient sombre ou envelopper dans du papier).
   2. Autoriser les réactifs pour dissoudre complètement en chauffant à 40 ° C et en agitant pendant 10 à 30 min.
   3. Ajouter distillée au volume final de 200 mL et remuer jusqu'à ce que bien mélangés.
   4. Stocker aliquotes à 4 ° C et maintenir dans l’ignorance. Après deux semaines, l’anesthésie devrait être remplacé par la nouvelles aliquotes.
   5. Injecter un volume de 20 µL par 1 g de poids corporel. Par exemple, si le poids du corps de la souris est de 25 g, donner 500 µL de solution. La durée typique de cette anesthésie est de 1 h.
      NOTE : Cette solution va devenir toxique lorsqu’ils sont exposés à la lumière et/ou de chaleur, donc soyez prudent éviter l’exposition à la lumière et de chaleur. Un itinéraire d’injection IP est hautement recommandé.
3. Quand la souris tombe dans une anesthésie profonde, placez-le sur la table d’opération avec la face dorsale vers le haut (c.-à-d., décubitus ventral) et stériliser la partie externe de la mi-cuisse de droite avec un tampon imbibé d’alcool à 70 %.
   NOTE : Confirmer une anesthésie profonde en vérifiant l’absence de réponse de pincer ou de stimulation sur les pattes ou la queue de pression.
4. Induisent la CCI sur le nerf sciatique droit de la souris.
   1. Faire une incision sur la peau autour de la mi-cuisse de 1,0 à 1,5 cm de long avec une lame de bistouri.
   2. Carrément disséquer les muscles de la cuisse avec du Surgicel micro-moustique pour exposer le nerf sciatique.
   3. Ligaturer le nerf sciatique exposé 3 fois avec des intervalles de 1,0 à 1,5 mm à l’aide d’une suture catgut chromique de 4-0.
      Remarque : Assurez-vous des trompes lâches en liant hors du nerf sciatique, jusqu'à ce que doux secouant apparaisse sur la patte arrière ipsilatérale. Le groupe fictif des souris a reçu la même ouverture chirurgicale dans des conditions semblables sauf sans ligature nerf.
5. Fermer l’ouverture chirurgicale avec 3-4 simples sutures interrompus à l’aide de soie de 5-0 et stériliser avec la povidone iodée pour la désinfection de la zone externe de la chirurgie.
6. Après la chirurgie, placez la souris dans une cage propre sur un coussin chauffant. Lorsque les animaux est récupérés de l’anesthésie, les retourner à leur cage maison.
   Remarque : Dans cette étude, les antibiotiques n’étaient pas utilisés. La CCI + GBP groupe reçu IP gabapentine (GBP) à une dose de 50 mg/kg une fois par jour comme témoin positif.

2. Mesure d’allodynie mécanique (Test de von Frey)

Remarque : évaluer la fréquence de la réponse de retrait aux stimuli mécaniques en utilisant 1 g de filaments de von Frey à la surface plantaire de la patte arrière ipsilatérale.

1. Chaque jour de l’essai, amener la souris à la salle de test comportemental et acclimater les souris dans leur propre maison cage pendant au moins 30 min avant le test.
   NOTE : Porter des équipements de protection individuelle tels que casaque, gants et masque.
2. Placez la souris dans une boîte acrylique transparente sur le sol d’un treillis métallique et s’acclimater à la souris pendant 30 min.
3. Appliquer doucement 1 g de filaments de von Frey à la surface plantaire de la patte arrière jusqu'à ce que le filament se penche.
4. Appliquer une stimulation à incandescence pour la postérieur homolatérale patte 10 fois au moins 10 intervalles s et noter le résultat.
   Remarque : Dans cette étude, le nombre de réponses de retrait patte de 10 essais sont indiqués en pourcentage de la fréquence de retrait de patte (PWF, %). Le test de von Frey a été effectué tous les deux jours après l’intervention de la CCI.

3. Effectuer des analyses de marche automatique

Remarque : le système d’analyse de la démarche visualise chaque impression de patte alors que l’animal se promène et analyse automatiquement différents paramètres de marche, tels que l’empreinte de patte, patte intensité, longueur de foulée, position séquence de pas, balançoire, vitesse d’oscillation, phase, etc. dans cette étude, nous avons montré patte zone d’impression et unique position après avoir converti les données en pourcentage changent entre controlatérale gauche versus patte droite arrière ipsilatéral. Ainsi, un résultat de 50 % indique que la taille de la patte imprimée et la durée du domaine de la patte au contact du sol, entre les côtés gauche et droit sont les mêmes. De plus, les valeurs de données plus faibles près de 0 % indiquent que la taille et la durée de contact sont diminuées dans la patte arrière ipsilatérale contre le côté controlatéral (voir panneau B de la Figure 2 et Figure 3).

1. D’acclimatation, garder les souris au sein de l’appareil d’analyse de marche pendant 10 min une fois par jour depuis 5 jours avant la chirurgie de la CCI.
   NOTE : Essai d’analyse de démarche incluant acclimatation doit être effectuée dans l’obscurité.
2. Amener les souris à la salle de test pour l’analyse de la démarche et de s’acclimater dans leur cage maison pendant au moins 30 min avant le test.
   1. Dans l’onglet de configuration du menu programme, définissez le " longueur de la passerelle " 30 cm, et la " exécution durée maximale " à 5 s et le " exécution variation maximale " à 50 %.
   2. Sélectionnez une caméra enregistrée de le ' configuration ' onglet de la ' programme ' menu.
   3. Sélectionnez " ouvrir acquisition " de la ' acquérir ' onglet de la ' programme ' menu.
   4. En suivant le message d’État, cliquez sur le ' snap fond ' bouton pour prendre une image de fond de l’allée vide (c'est-à-dire, blank).
3. Cliquez le ' commencer l’acquisition ' bouton et placez la souris sur la passerelle ; l’enregistrement démarre automatiquement selon le mouvement de la souris.
   Remarque : Lorsque la souris est clairement promenades à travers la passerelle, le programme automatiquement classifie ce mouvement comme " Compliant exécuter " avec une icône verte. Si le logiciel n’a pas détecté l’empreinte, l’expérimentateur verra une icône rouge et doit répéter l’enregistrement. Au moins cinq pistes compatibles avec succès sont nécessaires pour l’analyse.
4. Après l’essai, sélectionnez ' classer les pistes ' dans l’onglet de l’acquisition de la ' programme ' menu.
5. Sélectionner les séries pour analyse, puis cliquez sur le ' auto classer ' bouton.
   Remarque : Après classement, tous les paramètres de statistique sont automatiquement enregistrées et l’expérimentateur peut trouver les résultats en cliquant sur " vue exécutée statistiques " dans le menu analyser.

Representative Results

Nous avons effectué le test de von Frey et automatisée d’analyse de la démarche chez les souris de la CCI jusqu'à 10 jours après l’intervention de la CCI. Pour l’analyse statistique, les mesures répétées des deux voies analyse de variance (ANOVA) détermine les effets globaux, et analyse post-hoc de Dunnett a été réalisée pour déterminer la valeur de p parmi les groupes expérimentaux.

Les résultats présentés dans la Figure 1 indiquent l’évolution temporelle des données test von Frey classique. La PWF (%) des souris de la CCI s’est accrue de 2 jours après l’intervention de la CCI et maintenue pendant 10 jours par rapport à du groupe fictif. Dans le groupe témoin positif de CCI, GBP (50 mg/kg, IP, une fois par jour pendant 10 jours commence 1 jour après la chirurgie) atténué significativement améliorée CCI PWF. Dans le groupe fictif du groupe A, PWF (%) a été 8,00 ± 5,83 sur le validant pré-opératoire (GER), 6,00 ± 2,45 le jour 2, 4.00 ± 2,45 le jour 4, ± 2.00 2.00 au jour 6, 4,00 ± ± 22.45 le jour 8 et 6,00 2,45 le jour 10. Dans le groupe CCI, PWF (%) est de 2,86 ± 1,84 sur le GER, 61.43 ± 5.95 au jour 2, 68.57 ± 4,59 au jour 4, ± 72,86 5.22 au jour 6, 75.71 6,49 le jour 8 et 75,71 ± 3,69 au jour 10. Groupe CCI + GBP, PWF (%) est de ± 2,50 1,43 sur le GER, 57.50 ± 5.22 au jour 2, ± 50.00 4.04 le jour 4, ± 45.00 4,81 au jour 6, 46,25 5,65 le jour 8 et 47,50 ± 4,88 au jour 10. Dans le groupe B, l’aire sous la courbe (AUC) était 23.00 ± 6,00 en trompe-l'œil, 317.86 ± 17.04 en CCI et 223.75 ± 17.05 au groupe CCI + GBP.

Les résultats présentés à la Figure 2 indiquent un changement de Cap du temps de la zone d’impression patte après chirurgie de la CCI. Les données apparaissent comme la variation en pourcentage de la zone d’impression patte entre les pattes postérieurs droit et gauche. Si la zone d’impression patte est identique à gauche et à droite dans un état normal, les données seront à 50 %. CCI a significativement réduit patte zone d’impression de la patte arrière ipsilatérale 2 jours après la chirurgie et a été maintenu pendant 10 jours. GBP récupéré remarquablement patte réduit la zone d’impression. Dans le groupe fictif du groupe B, la zone d’impression patte (%) est de ± 50.13 2.13 sur le GER, 50.30 ± 1,45 au jour 2, 53.24 ± 0,80 au jour 4, 50.30 ± 1,68 au jour 6, 52.08 ± ± 1,79 le jour 8 et 49.66 2.24 jour 10. Dans le groupe de la CCI, la zone d’impression patte (%) est de ± 50.71 3.17 sur le GER, 0 ± 0 au jour 2, ± 0 0 au jour 4, ± 8.86 3.27 au jour 6, 6.6 ± 3.20 le jour 8 et 10 h 30 ± 5,60 au jour 10. Dans le groupe CCI + GBP, la zone d’impression patte (%) est de ± 55.59 2.01 sur le GER, 4.65±4.17 au jour 2, 15.18±5.57 au jour 4, 20.20 ± 4.00 le jour du mois 6, 26,01 5.53 le jour 8 et 28,40 ± 6.04 au jour 10.

Les résultats présentés à la Figure 3 indiquent le changement de Cap de temps d’une position unique après l’intervention de la CCI. Données ont été calculées et montrées que la variation en pourcentage (comme les données de zone d’impression de patte). CCI réduit la position unique du côté ipsilatéral et GBP récupéré significativement il. Dans le groupe fictif du groupe B, la position unique (%) a été 49.31 ± 2.15 sur le GER, 50.71 ± 0,67 au jour 2, 50,76 ± 0,44 au jour 4, 50.60 ± 1,11 au jour 6, 51,50 ± 0,96 le jour 8 et 49,00 ± 2,35 au jour 10. Dans le groupe de la CCI, la position unique (%) est de ± 50,36 3.17 sur le GER, 0 ± 0 au jour 2, ± 0 0 au jour 4, 11,5 ± 3,25 au jour 6, 13.61 5.04 le jour 8 et 12.94 ± 6,40 au jour 10. Dans le groupe CCI + GBP, la position unique (%) a été 52.35 ± 0,91 sur le GER, 5,44 ± 4,87 au jour 2, ± 18,66 4,33 au jour 4, 25,48 ± 4,10 au jour 6, 30.26 2.17 le jour 8 et 32,24 ± 4,95 au jour 10.

Figure 1 : allodynie mécanique évaluée par test de von Frey chez les souris CCI. Fréquence (A), le retrait de la patte (PWF, %) dans the Frey von test s’est accrue de 2 jours après l’intervention de la CCI et maintenue pendant 10 jours par rapport à du groupe fictif. Gabapentine (GBP, 50 mg/kg, IP) inversé significativement l’allodynie mécanique induite par le CCI. (B) les données accumulée de PWF apparaissent comme aire sous la courbe. ** p < 0,01 et *** p < 0,001 versus groupe CCI. Barres d’erreur indiquent la moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : zone d’impression de patte par une analyse automatisée démarche chez les souris de la CCI. (A) capté des images de pattes des groupes de Sham, ICC et ICC + GBP (gabapentine, 50 mg/kg, IP) par le logiciel d’analyse. Rectangles blancs sont des indicateurs de la patte arrière détectés par le système d’analyse. Notez que la plus petite taille de la patte du CCI et cette réduction a été en partie récupérée par traitement de GBP. (B) évolution temporelle de la zone d’impression patte (%). Données sont calculées comme la variation en pourcentage de la zone d’impression entre la patte arrière droite et gauche (par exemple, 50 % indique les zones d’impression même patte côtés droit et gauche). * p < 0,05 et ** p < 0.01 versus groupe CCI. Barres d’erreur indiquent la moyenne ± SD

Figure 3 : position unique par une analyse automatisée démarche chez les souris de la CCI. (A) capturées et convertir des images de position unique mis en évidence par des couleurs différentes pour chaque patte. Notez que la trace de rose pour la patte arrière ipsilatérale est raccourcie dans le groupe CCI et gabapentine (GBP, 50 mg/kg, IP) significativement récupéré il de même pour le niveau de Sham. (B) évolution temporelle de la position unique (%). Données sont résumées sous forme de graphique ligne après avoir calculé le pourcentage de changement de position unique entre la patte arrière droite et gauche (par exemple, 50 % indique la même attitude unique dans les côtés gauche et droit). * p < 0,05, ** p < 0,01 et *** p < 0,001 versus groupe CCI. Barres d’erreur indiquent la moyenne ± écart-type. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Discussion

Actuellement, mesure d’allodynie mécanique à l’aide de filaments de von Frey est le plus couramment méthode dans des modèles animaux de douleur pour démontrer une hypersensibilité tactile. Des modèles animaux pour les douleurs neuropathiques ont continué à être développé, la méthodologie d’évaluation de la fonction sensorielle a été également améliorée^8,9,10,15. Dans ces rapports, il a été suggéré que ces modifications peuvent fournir un remplacement plus précis, rapide et facile à utiliser pour les méthodes plus anciennes. Toutefois, les données de ces méthodes encore peuvent être limitées par sa subjectivité et de l’exigence de compétences ou d’expérience pour exécuter la méthode. En outre, la contention des animaux ne peut être évitée lorsque vous effectuez le test de von Frey, et donc le stress lié au dispositif de retenue des animaux susceptibles d’affecter les résultats de réponse de douleur.

Le système d’analyse automatisé démarche automatiquement mesure différents paramètres d’animal marchant (p. ex., une superficie totale de contact de la patte à l’étage, angle de patte imprimée, le temps de posture, etc.), et par conséquent l’expérimentateur peut utiliser des données plus objectives pour analyse^{12,13,14,16,17,18}. En outre, cette méthode peut être effectuée sans aucune stimulation ; ainsi, il est moins invasive et données de rongeur librement mobile peuvent être obtenues. Comme indiqué dans les résultats de cette étude, l’empreinte taille et temps de la position de la patte arrière ipsilatérale sont réduits par la chirurgie de la CCI et récupéré par traitement GBP ; des résultats similaires se trouvent également dans le von test Frey. Compatible avec les précédentes observations¹⁴, résultats de l’analyse de la démarche chez les modèles animaux de la douleur neuropathique ont un haut degré de corrélation positive avec celle de l’essai de von Frey, indiquant que les paramètres modifiés axés sur les CCI peuvent refléter le degré d’allodynie mécanique, un des symptômes plus irritants de la douleur neuropathique.

Ici, nous fournissons une méthode comment faire fonctionner le système d’analyse automatisé gait en détail et une brève comparaison des données avec le classique test de von Frey chez les souris neuropathiques CCI. En conclusion, l’analyse de la démarche automatisé peut être que l’outil plu accessible pour l’étude de la douleur neuropathique à cause de cela est facile à utiliser, objective et sensible.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Saline	JW Pharmaceutical	N/A	Vehicle for drugs
1ml syringe	BD Plastipak	300013	Injecting device
2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity)	Sigma	T48402	Anesthetic
2-methyl-2-buthanol (99% purity)	Sigma	152463	Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol
Catwalk Automated gait analysis system	Noldus	N/A	Automatic analysis software of aniaml gait
Chromic catgut (4-0 thickness)	AILEE	C442	Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve
Gabapentin	Sigma	Y0001280	Analgeisc, Used as a positive control drug in this study
Graefe Forceps	F.S.T	11051-10	Surgical instrument
Heating Pad	DAESHIN ELECTRONICS	M-303AT	Regulation of body temperature
ICR Mouse	Samtaco	N/A	Experimental animal
Mersilk (3-0 thickness)	ETHICON	W598H	Suture material for surgical closure of skin
Micro-Mosquito	F.S.T	13010-12	Surgical instrument
Micro-scissors	F.S.T	14090-09	Surgical instrument
Needle holder	F.S.T	12002-12	Surgical instrument
Povidone Iodine	Firson	N/A	Disinfectant to prevent infection after surgery
Scalpel blade	F.S.T	10010-00 (#10)	Surgical instrument to make an incision
Scalpel handle	F.S.T	10003-12 (#3)	Surgical instrument to make an incision
Von-Frey filaments	North Coast	NC12775-99	Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation