Summary
Descriviamo un metodo per laminotomia in maiali che fornisce l'accesso ai gangli della radice dorsale lombare (DRG) per iniezione intraganglionic. Progresso di iniezione è monitorato intraoperatively e istologicamente confermato fino a 21 giorni dopo la chirurgia. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per futuri studi preclinici su iniezione di DRG.
Abstract
Gangli delle radici dorsali (DRG) sono anatomicamente ben definite strutture che contengono tutti i neuroni sensoriali primari sotto la testa. Questo fatto rende gli obiettivi attraenti DRG per iniezione di approcci terapeutici volti a trattare il dolore cronico. In modelli animali di piccole dimensioni, il laminectomy è stato utilizzato per facilitare l'iniezione di DRG perché coinvolge la rimozione chirurgica dell'osso vertebrale che circondano ciascun DRG. Dimostriamo una tecnica per iniezione intragangliari di DRG lombare in una grande specie animale, vale a dire, suina. Laminotomia viene eseguita per consentire l'accesso diretto al DRG utilizzando materiali, strumenti e tecniche neurochirurgiche standard. Rispetto al più vasta rimozione dell'osso tramite laminectomy, implementiamo laminotomia per conservare l'anatomia spinale ottenendo accesso sufficiente di DRG. Intraoperative progresso dell'iniezione di DRG è controllata mediante un colorante non tossico. A seguito di eutanasia il giorno post-operatorio 21, il successo di iniezione è determinato dall'istologia per distribuzione intragangliari di 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Iniettiamo una soluzione biologicamente inattiva per illustrare il protocollo. Questo metodo potrebbe essere applicato in futuro preclinica per soluzioni terapeutiche di destinazione per DRG. La nostra metodologia dovrebbe facilitare il test la traducibilità dei paradigmi animale piccoli intragangliari in una specie animale. Inoltre, questo protocollo può servire come una risorsa fondamentale per chi ha intenzione di studi preclinici di iniezione di DRG in maiali.
Introduction
Gangli delle radici dorsali (DRG) sono raccolte anatomicamente discreti, un neurone situati lungo la colonna vertebrale. Ciascun DRG contiene i neuroni sensoriali primari che codificano e trasmettere stimoli periferici al sistema nervoso centrale (SNC) da regioni specifiche del corpo. Per esempio, il dolore dell'osteoartrite inizia quando recettori del dolore che si trova a circa un giunto percepiscono stimoli nocivi. Questo processo è definito nocicezione. A lungo termine consapevolezza di stimoli nocivi conduce a dolore cronico 1.
Il dolore cronico è un frequente soggetto di studio preclinico 2 dove uno degli obiettivi è di sviluppare metodi utili per la somministrazione mirata di analgesici di DRG, quali intragangliari iniezione 3. Tuttavia, DRG sono difficilmente accessibili perché risiedono all'interno dei confini boney di forami intervertebrali 4. Diversi gruppi sono riusciti a superare questo ostacolo attraverso l'uso di chirurgia della colonna vertebrale in roditori 5,6,7,8,9,10.
Nella clinica, il laminectomy è un'operazione comune della colonna vertebrale e si riferisce alla rimozione chirurgica della lamina vertebrale, quindi unroofing il canale vertebrale 11. Incorporazione di tecniche chirurgiche per permettere accesso diretto di DRG ha avuto successo in roditori 5,12, tuttavia, la traduzione potrebbe essere irrealistiche considerando le differenze di dimensione delle strutture competenti e come che influenza La farmacocinetica o fattibilità tecnica 13,14. Ad esempio, uno studio ha determinato il diametro trasversale del midollo spinale a T10 essere 3.0, 7.0 e 8,2 mm per ratto, maiale e umani, rispettivamente 15. Così, grande animale modelli meglio approssimative dimensioni umane delle strutture nervose.
In maiali, Raore et al. usato laminectomia multi-livello per poter accedere al midollo spinale cervicale per multiple iniezioni intraspinal 16. La procedura è stata ben tollerata e portato una fase I trial clinici dove paragonabili risultati chirurgici sono stati documentati 17. Questi risultati incoraggiano l'uso continuato di modelli preclinici di animali grandi come preannunciatori della fattibilità tecnica e della sicurezza negli esseri umani.
Fin qui, nessuna metodologia dettagliata esiste per accesso chirurgico e l'iniezione di DRG in una specie animale. Per ridurre questo divario traslazionale, segnaliamo un protocollo per l'esposizione DRG e iniezione tramite laminotomia in maiali. Materiali, strumenti e tecniche neurochirurgiche standard sono stati utilizzati e il metodo è stato progettato per imitare la pratica chirurgica moderna. Dimostriamo intragangliari iniezione utilizzando una soluzione acquosa per DRG lombare e confermare la riuscita consegna tramite istologia dopo giorno post-operatorio 21.
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Protocol
tutti i metodi descritti qui sono stati approvati da istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) della Mayo Clinic.
1. prerequisiti di rigore e riproducibilità
- per garantire il rigore del design, seguono gli standard nazionali di laboratorio di buona pratiche sono in ogni momento e ottenere l'approvazione interna di IACUC (o comitato simile) prima di qualsiasi animale coinvolgimento in esperimenti.
Nota: Questo protocollo è stato progettato per mantenere un approccio clinicamente fedele. Così, i materiali, strumenti e tecniche coinvolte sono descritte in modo identico ai più alti standard clinici in esseri umani. Per esempio, rigorosa tecnica sterile è seguita e materiali scaduti non dovrebbero mai essere usati. - Per sostenere la riproducibilità di questa metodologia in un quadro sperimentale, sviluppare interne procedure operative e di controllo per variabilità nella razza suina, peso, sesso ed età tra coorti separate.
Nota: Il design di questo protocollo è stato basato sull'uso del suino pesante 38-53 kg
2. Pre-operatoria Animal Care
- amministrare profilattico intramuscolare (IM) ceftiofur, dato a 5 mg/kg, 1 giorno prima della procedura.
- Veloce animali di cibo solido e limitare gli animali da trattamenti cosmetici, bagni di olio cioè, 12 h prima della procedura.
- Indurre l'anestesia generale entro 1 h della procedura, utilizzando IM tiletamina e zolazepam, dato come Telazol a 5 mg/kg e IM xilazina, dato a 2 mg/kg.
- Una volta indotta, amministrare rilascio di buprenorfina sostenuta sottocutanea (SC) (SR), dato a 0,18 mg/kg.
- Posizionare un catetere di orecchio-vena ed eseguire l'intubazione rapida sequenza per posizionare un tubo endotracheale.
- Allegare un pulsossimetro con funzione alla linguetta per monitorare la frequenza cardiaca e l'ossigenazione di monitoraggio della frequenza cardiaca.
- Metti l'animale in posizione prona e clip la pelle sopra il dorsum utilizzare un tagliacapelli elettrico. Clip di capelli sopra una grande zona bilaterale che si estende dal piano sagittale del midline al piano coronale del midline e longitudinalmente dall'apice sacra per le spine scapolare. Utilizzare nastro adesivo per rimuovere i capelli e pelle digalleggiante.
- Strofinare l'area ritagliata fino a 3 volte con acqua tiepida e sapone e asciugare la pelle con un panno privo di lanugine.
- Bilaterali reperi anatomici Mark, utilizzando una penna di marcatura chirurgica. Contrassegnare l'ultima costole, creste iliache, processi spinous e apofisi.
Nota: Contrassegnando l'ultimi nervature, creste iliache e processi trasversali, la colonna lombare è delimitata lungo i suoi confini superiori, inferiori e laterali, rispettivamente. Questo protocollo è stato progettato per guidare l'accesso e l'iniezione di qualsiasi DRG lombare di interesse. Per riferimento, le creste iliache superiori allineare con livello vertebrale L3 o L4. - Coprire l'animale con una coperta calda per il trasporto verso la suite operativa.
3. Posizionamento nella Suite operativa
- delicatamente ascensore e posizione l'animale incline in un grande animale umano modificato fionda con apertura addominale imbottita.
Nota: L'apertura addominale permette per la riduzione della pressione addominale simile al telaio Wilson utilizzato durante la chirurgia della spina dorsale umana. A sua volta, questo diminuisce di spurgo intraoperative dai vasi sanguigni spinali. La fionda è vantaggiosa perché le gambe sono permesso di appendere liberamente attraverso aperture imbottite che proteggono l'animale dall'urto del nervo periferico. Tuttavia, poiché la struttura di fionda è fatta di metallo, deve essere riempito con isolamento per evitare corto circuiti elettrici e accidentale ustione degli animali. Un rotolo di coperta può essere posizionato per posizionare la testa ed il collo in una posizione comoda, a seconda delle dimensioni dell'animale. - Mantenere l'anestesia generale con 1-3% inalato isoflurano (IH), titolato a effetto. Inumidire gli occhi con unguento oftalmico e nastro delicatamente loro chiusa.
- Posizionare le linee per il monitoraggio dei segni vitali al documento temperatura, pressione sanguigna, frequenza cardiaca e l'ossigenazione. Monitorare la ventilazione di capnografia.
- Posizionare un elettrodo dispersivo electrosurgical adesivo, USA e getta sopra la scapola destra o sinistra.
- Amministra riscaldato Ringer lattato ' s come liquidi di manutenzione attraverso il catetere di orecchio-vena. Dare liquidi ad un tasso di 5-10 mL/kg/h.
- Inserire un dispositivo di riscaldamento ad aria forzata sopra la regione cervicale e toracica ed evitare di coprire le costole Ultima.
4. Preparazione sterile del campo operatorio per un'iniezione di sinistra-parteggiato
Nota: da questo punto in avanti, procedere in modo sterile rigoroso.
- Preparare la cute sovrastante l'inizio lombare della colonna vertebrale con l'applicazione larga di 0,7% iodio povacrylex e 74% alcool isopropilico secondo il produttore ' s istruzioni. Per assicurarsi che l'ago guida può essere inserito più tardi in modo sterile, lateralize applicazione al lato di iniezione prevista estendendo antisepsi verso il piano coronale del midline passato le apofisi contrassegnate.
- Posto asciugamani monouso chirurgici in moda rettangolare per delineare il sito di incisione pianificata, che è sopra la linea mediana lungo le apofisi lombare contrassegnate.
- Applica un adesivo antimicrobico incise drappo sopra gli asciugamani operativi e la pelle esposta. Tende al posto di serraggio ed estendere il bordo di panneggio fuori dal campo operatorio.
- Fissare un drappo verticale per pali alla testa della fionda fra il campo operatorio e il monitoraggio tecnico.
- Secure linee per aspirazione ed elettrochirurgia entro il campo operativo di bloccaggio per i teli sterili. Passare le estremità libere dei tubi e fili fuori dal campo sterile.
5. Incisione e dissezione Subperiosteal della pelle
- palpare le apofisi lombare lungo la linea mediana e identificare 3 livelli vertebrali consecutivi.
- Utilizzare un bisturi #15 per aprire un'incisione sagittale mediana di 8-12 cm attraverso il drappo incise direttamente posteriore ai processi spinous. Mantenere l'emostasi utilizzando garza tamponatura ed elettrochirurgia monopolare.
Nota: Prestare attenzione a non deviare dalla linea mediana, come l'incisione è avanzato nel senso anteriore perché questo limita lo spurgo dai muscoli di paraspinal. Palpazione periodica per i processi spinous facilita l'avanzamento. Autoritenuta Weitlaner, Meyerding o Gelpi divaricatori può essere immesse e riposizionato come necessario per facilitare la dissezione. Aspirazione viene utilizzato per mantenere visibilità. - Sezionare il tessuto sottocutaneo e grasso utilizzando elettrochirurgia monopolare fino a raggiunta la fascia toracolombare. Palpare i processi spinous profondi della fascia toracolombare e tagliare la fascia lungo la linea mediana per esporre il legamento sopraspinoso che misurano tra i processi spinous.
Nota: La fascia toracolombare è identificata come una guaina organizzata, aponeurotica con un grano di tessuto connettivo che intreccia in un obliquo, lateralmente al senso mediale. A questo punto, l'incisione può essere allungata in direzione superiore o inferiore per garantire che 3 processi spinous sono completamente visibili con il processo spinous più centrale allineato all'interno del centro del campo di dissezione. - Utilizzare una lama #15 per posizionare un'incisione di 2 mm profonda parasagittal attraverso il legamento sopraspinoso posteriore a ogni processo spinous. Posizionare ogni incisione lungo il terzo sinistro della superficie posteriore del processo spinous.
- Rilasciare delicatamente il legamento sopraspinoso a ogni livello lungo ogni incision utilizzando un ascensore più libero di 5 mm.
- Identificare l'aereo subperiosteal e sezionare all'interno di quell'aereo lungo la superficie laterale di ogni processo spinous.
- Eseguire la dissezione subperiosteal ad ogni processo spinous in un modo parallelo per garantire che un dolce, si ottiene anche dissezione.
- Incise l'allegato del muscolo di paraspinal lungo gli spazi interspinoso utilizzando elettrochirurgia monopolare in concerto con dissezione subperiosteal.
- Identificare la lamina a ogni livello e continuare a dissezione subperiosteal lateralmente per raggiungere il confine laterale dei 2 giunti zygapophyseal che collegano le 3 vertebre esposte e raggiungere il bordo laterale della lamina tra le articolazioni, chiamato pars interarticularis.
Nota: La pars interarticularis è il bordo posteriore del forame intervertebrale in cui risiede il DRG. Occasionalmente, una piccola vena nasce da un orifizio situato sulla superficie posteriore della lamina. Queste vene hanno la tendenza a rompersi durante la dissezione subperiosteal. L'emostasi è facilmente ottenibile utilizzando una combinazione di elettrochirurgia bipolare e cera ossea applicata all'orifizio.
6. Livello singolo laminotomia
- identificare il target di laminotomia come la lamina più centrale situata tra e mediale dei 2 giunti zygapophyseal.
- Traccia la lamina al suo bordo inferiore, a un punto appena mediale al processo articolare inferiore contiguo del giunto zygapophyseal caudale.
- Utilizzare un ascensore Freer 5 mm o curette per palpare la transizione tra il bordo di caudalmost della lamina e canale centrale.
Nota: Attenzione a non forzare lo strumento palpating anteriore come questo si metterà in contatto il sacco durale e del midollo spinale. Si noti che il midollo spinale nei suini si estende oltre il rachide lombare 18. Una Pinza ossivora disco intervertebrale può essere utilizzato per rimuovere ulteriori tessuti molli che ricoprono questa zona per facilitare palpazione. - Uso un fino 2 mm-mordere, 45 gradi Kerrison rongeur per estrarre l'osso in modo disruzione. Rimuovere l'osso lungo la base del processo spinous superiormente ad un livello appena caudale alla superficie caudale del pedicle e fuori lateralmente per tutta la sua estensione.
- Uso angolato Pinze ossivore di osso per assistere con rimozione dell'osso. Lasciare il processo articolare inferiore che è stato collegato alla lamina in luogo fino a quando il laminotomia è in gran parte completato.
- Confermare che al processo articolare inferiore è liberamente mobile e attaccato solo da zygapophyseal capsula articolare. Incise la capsula con una lama #15 o 11 #.
- Rimuovere il processo articolare inferiore in modo disruzione ma lasciare intatto il processo articolare superiore adiacente.
Nota: una volta completata il laminotomia, emostasi viene eseguita con elettrobisturi bipolare. Elettrochirurgia monopolare non viene utilizzato a causa della vicinanza delle strutture neurali. Cera dell'osso possa essere disposti lungo siti di sanguinamento da osso esposto e spugne di gelatina assorbibile possono essere utilizzati per ottenere l'emostasi nei pressi dei tessuti molli. Cottonoid è uno strumento utile per liquido serous stoppino e sangue dalla dissezione.
7. Dissezione del DRG
- evacuare il grasso epidurale in modo disruzione da superficiale a profondo inizio medialmente e procedendo lateralmente. Rimuovere il grasso dalla delicata dissezione utilizzando pinze bipolari e aspirazione con punte di aspirazione Frazier francese 6-10.
Nota: Ingrandimento Loupe o l'uso di un microscopio per dissezione è disponibile nel fornire il livello di dettaglio necessario per evacuare il grasso epidurale e meticolosa emostasi del plesso venoso epidurale utilizzando elettrochirurgia bipolare in sicurezza. - Identificare il sac dural lungo la linea mediana in esecuzione in una direzione superoinferior, parallela all'asse di incisione della pelle. Rimuovere il grasso epidurale lungo il sac dural fino a quando il sacco durale può essere visto per dare origine alla manica di radice di nervo dural.
- Traccia il manicotto dural lateralmente e inferiorly tramite l'evacuamento di grasso epidurale fino a quando non si è visto per ingrandire intorno al DRG.
Nota: Identificare il DRG per la sua forma ovale e giallo al colore arancione. A livello della colonna lombare metà, DRG è in genere 4-6 millimetri nel formato, più lunga nel mediale in direzione laterale e si trova direttamente inferiori o 2-3 mm mediale al relativo pedicle rispettivi. Un gancio nervo smussato, ad angolo retto può essere utilizzato per palpare delicatamente per il pedicle. - Evacuare grasso epidurale lateralmente, passato il DRG, fino a quando è visibile il nervo spinale adiacente.
Nota: In caso di durotomy, ripararlo da chiusura a tenuta stagna utilizzando 6-0 suturare di nylon e liscia micro ago driver in una semplice esecuzione stich.
8. Iniezione del DRG
- usare un ago spinale 22 calibri a guidare la traiettoria di un ago di calibro 32 convezione enhanced delivery (CED). L'ago di calibro 22 guida attraverso i muscoli di paraspinal e pelle di puntura.
Nota: L'ago di CED è progettato per raggiungere convezione fluido nel tessuto, noto anche come flusso di massa, a causa di pressione gradienti 19 , 20. - Puntare l'ago guida lungo una traiettoria che si approssima all'asse longitudinale del DRG e provoca la punta dell'ago emergenti dalla parete laterale di paraspinal del campo dissezione.
- Fine tune il percorso dell'ago fino a quando il lume dell'ago si allinea con il centro del DRG.
Nota: L'ago guida non dovrebbe mai essere permesso di contattare DRG. - Aspirare per iniettato sterile in una siringa sterile e collegare la siringa al tubo di infusione sterile.
- Fissare il tubo all'ago CED e mano la siringa fuori dal campo sterile. Collegare la siringa ad una pompa siringa programmabile.
Nota: Tubazione è preparata ad una lunghezza di 5 piedi per assicurare che siano mantenuti la sterilità e la mobilità. Inoltre, è di fondamentale importanza che bolle d'aria non essere introdotto in soluzione. - Avanzare il injectate fino a quando l'espressione è veduta dalla punta dell'ago di CED.
- Posizionare l'ago di CED all'interno del lume dell'ago guida e far avanzare lentamente l'ago di CED fino a quando emerge dalla punta dell'ago guida. Garantire che il DRG non è perforato durante l'allineamento dell'ago.
- La posizione di guida dell'ago lungo l'asse della sua traiettoria per determinare la posizione finale della punta del CED di sintonia fine.
- Fissare la guida ago e l'ago di CED utilizzando insieme ad incastro dell'ago Hub, una volta ottenuta la profondità e l'allineamento della guida e aghi CED.
- Conferma che tutte le connessioni di apparato di iniezione sono pienamente garantite, tra cui la guida ago, ago CED, e collegato i tubi caricati con injectate.
- Far avanzare l'ago guida lungo il suo asse per approssimare la punta dell'ago CED e DRG.
- Puntura il DRG con la punta dell'ago di CED.
- Immergere la punta dell'ago di CED nel centro tridimensionale del DRG.
- Consegnare 100 μL di injectate CED utilizzando un percentuale progressiva e un volume di 3 gradini.
- Consegnare 4 μl a 2 μL/min per il primo passo. Consegnare 8 μL a 4 μL/min per il secondo passaggio. Consegnare 88 μL a 8 μL/min per il terzo e ultimo passo.
Nota: Consentire una pausa di 3 minuti tra i passaggi e dopo il passaggio finale per consentire equilibrazione pressione. - Ritirare l'apparato di iniezione dopo il passaggio finale iniezione e la pausa di 3 minuti lungo il suo asse con un movimento uniforme e delicato.
Nota: Per soluzioni iniettati che sono incolori, tintura colorata è incluso nella soluzione ad una concentrazione di 0,1% peso/volume per assistere nella valutazione visiva di injectate distribuzione 12. Inoltre, il colorante vitale 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) è incluso nella soluzione ad una concentrazione di 0,25 μg/μL, quando il disegno di studio richiede la valutazione istologica di injectate distribuzione 5.
9. Chiusura
- applicare 3 turni di irrigazione con soluzione fisiologica tiepida al sito chirurgico prima della chiusura per mobilitare e sciacquare il sito di detriti, cioè frammenti di ossa. Usare l'aspirazione per recuperare i detriti e la soluzione salina.
Nota: Meticolosa emostasi è assicurata quando irrigazione resta limpida. Agenti emostatici (spugna di gelatina) e cottonoid vengono rimossi in questo momento. Garantire che tutti i materiali e gli strumenti sono stati cancellati dal sito incisione prima della chiusura. - Utilizza una tecnica a 3 strati per chiusura.
- Suturare la fascia toracolombare usando 0 suturare in modo semplice, interrotto, tossicologica. Posto un stich ogni 5-8 mm per realizzare la chiusura a tenuta stagna.
- Sutura il tessuto sottocutaneo usando il 2-0 suturare in modo semplice, interrotto e invertito con un punto collocato ogni 5 a 8 mm per ottenere una resistenza adeguata.
- Chiudere la pelle utilizzando 0 suturare in modo semplice, in esecuzione o interrotto moda.
- Utilizzare un contatore dell'ago per assicurarsi che nessun diesis mancano all'appello for
- Irrigare la pelle con soluzione fisiologica, la pelle secca e posizionare il bendaggio adesivo strisce perpendicolari all'incisione.
- Posto garza sopra la benda strisce e attaccare un adesivo finale antimicrobico incise drappeggio.
10. Post-operatorio Animal Care
- estubare, coprire con coperte calde e trasportare l'animale a recupero.
- Seguire procedure standard di funzionamento istituzionale per il monitoraggio post-operatorio e recupero dalla chirurgia di sopravvivenza. Come minimo, osservare l'animale ogni 15min fino al ritorno della coscienza, oraria fino al recupero completo anestetico è realizzato e due volte al giorno da allora in poi.
- Fornire gestione del dolore post-operatorio somministrando IM o orale carprofen, dato a 4 mg/kg, una volta al giorno per 5 giorni che cominciano il giorno post-operatorio 0. Amministrare la buprenorfina SC SR, dato a 0,18 mg/kg, una volta il giorno postoperatorio 2.
- Amministrare antisepsi postoperatoria dando IM ceftiofur, dato a 5 mg/kg, una volta il giorno postoperatorio 4.
- Togliere la benda sul post-operatorio giorno 5-7. Rimuovere le suture quando la guarigione della ferita è completa, in genere il post-operatorio giorno 10-14.
- Umanamente eutanasia animale secondo le procedure standard di funzionamento istituzionale, una volta raggiunto l'endpoint dello studio.
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Representative Results
Valutazione istologica della diffusione per iniettato
Consegna di successo di injectate per DRG è determinata dalla valutazione istologica di DAPI diffondere. La tecnica prevede il posizionamento della punta dell'ago nel centro tridimensionale del DRG. Pertanto, consegna di successo è determinata dalla valutazione dell'entità di DAPI colorazione da sezioni istologiche sia vicino (sezioni centrali DRG) e lontano (periferici DRG sezioni) per la punta dell'ago. Figura 1A e 1B figura rappresentano un'iniezione di successo di un DRG. DAPI macchiatura fu dispersa uniformemente attraverso il parenchima DRG centro e periferico. Così, un successo iniezione di DRG è illustrata dalla diffusione diffusa di DAPI macchiatura tutta l'architettura tridimensionale di DRG. Iniezione sub-ottimale è illustrata dalla macchiatura incoerente. Per esempio, una colorazione minima (Figura 1) o macchiatura focale lungo il bordo esterno ma non interno aspetto del parenchima DRG (Figura 1) indica iniezione infruttuosa. Inoltre, considerati insieme, Figura 1 (sezione centrale DRG) e Figura 1 (sezione periferica di DRG) illustrano una mancanza di colorazione coerente all'interno di tre dimensioni per questo singolo DRG lombare.
Figura 1 : Valutazione tridimensionale della distribuzione di DAPI in iniettato DRG. (A) una sezione centrale da un DRG lombare iniettato rappresentativo di un risultato di successo. La macchiatura del colorante indicatore DAPI è uniformemente dispersi in tutto l'intero DRG in due dimensioni. (B) un parallelo, sezione periferica di DRG stesso in (A), che illustra la consistenza di DAPI diffuse all'interno di un secondo piano di sezione, confermando un'iniezione di successo in tre dimensioni. (C) una sezione centrale da un DRG lombare iniettato rappresentativo di un risultato Sub-ottimo. Minima o nessuna macchiatura di DAPI è visto tranne i fuochi occasionale. (D) una parallela, periferica sezione del DRG stesso in (C), che illustra la distribuzione parziale di DAPI lungo la periferia DRG. Blu: DAPI. Rosso: autofluorescenza. Scala bar = 500 μm (A e C), 100 μm (B e D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Abbiamo cercato di descrivere un metodo per l'esposizione chirurgica di DRG via laminotomy e intragangliari iniezione in una sana grande specie animali, in particolare, suina. Nei roditori, un metodo simile è stato dettagliato 12 e utilizzato per fornire gli agenti farmacologici convenzionali 8,10 e vettori virali 6,7,9,12 a DRG. I risultati dagli studi sugli animali piccoli sopra sono promettenti e speriamo che il nostro protocollo spianerà la strada per gli altri a tradurre questi risultati precedenti di suina. Animali sani e malati sono stati utilizzati negli studi di cui sopra, sostenere l'utilità di piccoli animali nella ricerca preclinica. Inevitabilmente, modelli animali di grandi dimensioni sarà necessari per rendere il confronto migliore disponibile a DRG umano in termini di distribuzione di dimensione e per iniettato. Per esempio, la differenza nella dimensione del DRG è chiaramente evidente tra ratti ed esseri umani. L5 DRG in adulto, ratti maschii misurano circa 2,6 x 1,5 mm 5 rispetto a 11,6 x 6,6 mm in esseri umani adulti, uomo, 21. Basato su misure radiografiche dal vivo nei suini, L5 DRG sono stati trovati per essere circa 8,0 x 6,0 mm 22. Di conseguenza, suina è situati come specie particolarmente utile per studio preclinico dovuto le somiglianze strutturali con il sistema nervoso umano e nelle vicinanze di anatomia muscoloscheletrica. Ciò è dimostrato dalla conversione inversa utilizzata per progettare questo protocollo secondo quello eseguito nella clinica. Inoltre, suina è utilizzare animali e è di crescente importanza nella ricerca biomedica. Questo protocollo sosterrà gli studi preclinici di intragangliari consegna di soluzioni iniettabili per avanzare i risultati precedenti dal lavoro in roditori ai grandi animali. Quindi, questo protocollo può promuovere nuove strategie per il trattamento di dolore cronico che integrano tecniche di veicolazione selettiva anatomicamente con nuovi agenti molecolarmente selettivi, che prevediamo, possono avere il potenziale per trasformare il dolore medicina 3.
Note aggiuntive per successo iniezione di DRG
Il periostio prelaminar ai livelli vertebrali lombari in maiali continua cephalad al posto di flavum di ligamentum. Durante laminotomia, il periostio possa essere separato facilmente tramite la disposizione della Pinza ossivora Kerrison e può imitare l'apparenza del mater di dura. È un passaggio fondamentale per distinguere il flavum di ligamentum, periostio, grasso epidurale e sac di dura come la dissezione viene eseguita. Inoltre, l'esposizione dello spazio epidurale è più efficiente e comporta meno sanguinamento se il periostio viene rimosso contemporaneamente con la lamina. Se il periostio non viene rimosso insieme osso, può essere incisa con una lama #11 e rimosso per esporre il grasso epidurale sottostante.
Per non fare del male è una priorità assoluta, e ciò deve essere bilanciata con l'obiettivo di DRG accesso e iniezione. Quindi, attenzione a non avanzare più lontano anteriormente l'evacuazione di grasso epidurale o anteromedially quanto sia necessario per consentire l'identificazione positiva del sac dural, manica di radice di nervo dural e DRG. La dissezione in direzione antero-mediale dove il sac dural dà luogo alla manica di radice di nervo dural è particolarmente pericolosa come una vena epidurale longitudinale si incontreranno. Inoltre, la dissezione in questa direzione aumenta il rischio di durotomy non intenzionale, segnalato dal deflusso di liquido cerebrospinale dalla superficie del sacco durale.
Un finale punto critico è quello di identificare il sacco durale, radici dorsali, DRG nella sua interezza e nervo spinale. Questo aiuta a stabilire 4 pezzi di convergenti anatomici la prova che garantisce la definizione completa di DRG. È necessario al fine di posizionare la punta dell'ago al suo centro tridimensionale, che permette l'ago di CED per stabilire un gradiente di pressione costante massimizzando al contempo la distanza ai contorni anatomici circostanti definire il DRG nella sua interezza. Entrambi i fattori aumentano notevolmente il volume erogato e la gamma di intraparenchymal diffondere 19,20. Consegna di injectate in una posizione che non è il vero centro anatomico si traduce in iniezione sub-ottimale perché risultato di pressioni incoerente quando iniettato perdite dal vicino sito di DRG puntura 20.
Una delle difficoltà con l'utilizzo di un ago di CED per iniezione di DRG è quello della conformità. Una volta avviato l'iniezione, la punta dell'ago deve essere mantenuta quanto ancora possibile, altrimenti gradienti pressori dissiperà a causa di cambiamenti improvvisi di conformità 20. Movimento respiratorio è una fonte di movimento continuo durante l'iniezione. Tuttavia, il rischio di movimento dell'ago secondaria all'escursione respiratoria è in gran parte rimosso ancorando l'ago guida e CED entro il prima della muscolatura paraspinal puntura del DRG come l'ago e il DRG si muovono in sincronia con la respirazione. La durata dell'iniezione per un volume di 100 totali μL 24 min al tasso ha fatto un passo descritto qui. Prestare la massima attenzione per limitare le interruzioni esterne dell'apparato di iniezione intero durante questo periodo. Disposizione del campo chirurgico, personale e gli ostacoli circostanti deve essere modificata come necessario prima di avviata l'iniezione per garantire un'interfaccia indisturbata tra la punta dell'ago CED e DRG.
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Disclosures
Nessuno; gli autori non hanno conflitti di interesse relativi a questo studio.
Acknowledgments
Lo studio è stato effettuato con il supporto dalla Fondazione famiglia Schulze (per A.S.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large humane animal sling | Britz & Company | 002539 | Modified to include abdominal aperture |
| Adhesive patient return electrode - 9 inch | Medtronic | E7506 | - |
| Ranger blood & fluid warming system | 3M | 24500 | - |
| Lactated Ringer's fluid | Hospira | 0409-7953-09 | - |
| Force air warming device | 3M | 77500 | - |
| Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol) | 3M | 8630 | - |
| Sterile disposable surgical towels | Medline | MDT2168286 | - |
| Ioban 2 incise drape | 3M | 6651EZSB | - |
| Disposable suction canister and tubing | Medline | DYND44703H | - |
| Button switch electrosurgical monopolar pencil | Medtronic | E2450H | - |
| Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch | Bovie | A826 | - |
| #15 blade | Miltex | 4-315 | - |
| #11 blade | Miltex | 4-311 | - |
| 4 x 4 surgical gauze | Dynarex | 3262 | - |
| Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch | Miltex | 11-618 | - |
| Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch | Sklar | 42-2078 | - |
| Gelpi self-retaining retractor, 7 inch | Sklar | 60-6570 | - |
| Freer elevator, 5 mm | Medline | MDS4641518F | - |
| Bone wax | Ethicon | W31G | - |
| Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm | Sklar | 42-2852 | - |
| Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm | Medline | MDS4052802 | - |
| Leksell angled rongeur, 2 mm | Sklar | 40-4097 | - |
| Gelfoam, size 50 | Pfizer | AZL32301 | - |
| Cottonoid patty | Medtronic | 8004007 | - |
| Frazier suction tip, 6 Fr | Sklar | 50-2006 | - |
| Frazier suction tip, 10 Fr | Sklar | 50-2010 | - |
| Dandy blunt right angle nerve hook | Medline | MDS4005220 | - |
| Nylon suture, 6-0 | Ethicon | 697G | - |
| Castroviejo smooth micro needle holder | Medline | MDG2428614 | - |
| 22 gauge Quinke point spinal needle | Halyard Health | 18397 | - |
| 32 gauge CED needle with locking Luer hub | See comments | n/a | As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014). |
| Polyethylene tubing, 5 feet | Scientific Commodities | BB31695-PE/05 | - |
| Monoject syringe, 3 mL | Kendall | SY15352 | - |
| NanoJet syringe pump | Chemyx | 10050 | - |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | - |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | - |
| Bulb irrigation syringe | Medline | DYND20125 | - |
| Fine-toothed Adson forceps | Medline | MDS1000212 | - |
| Vicryl suture, 0 | Ethicon | J603H | - |
| Vicryl suture, 2-0 | Ethicon | J317H | - |
| Needle counter | Medline | NC20FBRGS | - |
| Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch | 3M | R1547 | - |
References
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- Burma, N. E., Leduc-Pessah, H., Fan, C. Y., Trang, T. Animal models of chronic pain: Advances and challenges for clinical translation. J Neurosci Res. , (2016).
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- Pleticha, J., et al. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. J Neurosurg. 121 (4), 851-858 (2014).
