Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hele-mount Clearing og farvning af Arabidopsis blomst organer og Siliques

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/56441
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

Summary

I denne protokol, vi beskriver teknikker til ordentlig dissektion af Arabidopsis blomster og siliques, nogle grundlæggende clearing teknikker, og valgt Farvning procedurer for hele-mount observationer af reproduktive strukturer.

Abstract

På grund af dets formidable værktøjer til molekylær genetiske undersøgelser er Arabidopsis thaliana en af de mest fremtrædende model arter i plantebiologi og navnlig plante reproduktiv biologi. Dog inddrage plante morfologiske, anatomiske og ultrastrukturelle analyser traditionelt tidskrævende indlejring og skæring procedurer til lysfelt, scanning og elektronmikroskopi. De seneste fremskridt i Konfokal Fluorescens mikroskopi, state-of-the-art 3D-computer-aided mikroskopiske analyser og løbende forfinelse af molekylære teknikker skal anvendes på minimalt forarbejdede hele-mount prøver, har ført til øget efterspørgsel efter udvikle effektive og minimal prøve forarbejdningsteknik. I denne protokol, vi beskriver teknikker til korrekt dissekere Arabidopsis blomster og siliques, grundlæggende clearing-teknikker, og nogle farvning procedurer for hele-mount observationer af reproduktive strukturer.

Introduction

Blomster blandt de vigtigste definere organer af dækfrøede planter. Blomsterplanter dukkede op omkring 90-130 millioner år siden1, og diversificeret så hurtigt, at deres hurtige udseende blev beskrevet som en "afskyelige mysterium" af Charles Darwin2. Plante forskere interesser i blomst udvikling er forskellige. Nogle forskning har fokuseret på at forstå den evolutionære oprindelse af blomsten som helhed, eller udviklingen af særlige anatomiske, strukturelle og funktionelle egenskaber af blomster3,4,5,6 . Den høje variation i blomstermotiver form og struktur, samt tilstande af kønnet og ukønnet reproduktion påberåbe dem, gøre blomsten en meget kompleks struktur. Dette har ført til forskellige bestræbelser på at karakterisere de anatomi og strukturelle elementer i blomstermotiver organer, ved hjælp af lys og elektron mikroskopiske teknikker, der kan kombineres med genetiske og molekylære undersøgelser7. Desuden, som kilde af frugter og frø, er blomster af afgørende betydning for menneskers og dyrs ernæring. Derfor, karakterisering af blomst og frugt udvikling har mange konsekvenser for anvendt forskning, herunder fødevaresikkerhed for en voksende befolkning og økologisk bevarelsesstrategier under et skiftende miljø8 , 9 , 10.

Blomst udvikling i Arabidopsis starter med blomst induktion og omdannelsen af den vegetative meristem til en blomsterstand (gruppe af blomster) meristem. Blomst primordia initieres lateralt på flanken af blomsterstand meristem11. Floral orgel primordia danne gradvis i koncentriske hvirvler udefra til midten af blomsten, og i sidste ende udvikle sig til bægerblade, kronblade, støvdragere og frugtblade7. Disse blomsteragtige organer opfylde særskilte nærende, beskyttende og funktionelle (fxbestøver tiltrækning) roller i forskellige plantearter, med kønsorganer fastholde udviklingen af mandlige og kvindelige gametofytter, henholdsvis12 , 13. gametofytter, til gengæld hver skelne et par mand (sæd) og kvindelige kønsceller (æg og central celle), der forener på dobbelt befrugtning danner den næste generation, de befrugtede æg, og den primære frøhvide, en terminal væv støtte den udviklingen af fosteret14,15. Frugt og frø udvikling støtter vækst, modning og opbevaring af embryoner og i sidste ende, dens spredning. Omfattende forskning er blevet udført for at karakterisere blomst og embryo udvikling i forskellige plantearter, især i arternes model Arabidopsis7,16,17.

Tidlig mikroskopiske analyser af blomst udvikling var baseret på tidskrævende prøve behandling og observation teknikker, såsom paraffin eller harpiks indlejring og skæring, kombineret med lys eller Elektron Mikroskopi. Disse traditionelle mikroskopiske teknikker blev ofte brugt i kombination med molekylær genetiske undersøgelser, som mikroskopiske analyser af mutanter, lokalisering af RNA ved i situ hybridisering eller immuno-påvisning af proteiner. De seneste fremskridt i wide-felt og konfokal Fluorescens mikroskopi, state-of-the-art 3-D computer-aided billede analyser og løbende forfinelse af molekylære metoder, der kan bruges på minimalt forarbejdede hele-mount prøver, har ført til et behov for effektiv og minimal prøve databehandling, der er fortrinsvis indstillet til kvantitative analyser. I de seneste år, er der sket betydelige fremskridt i udviklingen af clearing teknikker på hele-mount animalske modellen. De render prøven gennemsigtig enten ved hjælp af vandig urea - eller sukker-baserede reagenser (fxSCALE, SeeDB, CUBIC)18,19,20, eller ved selektivt at fjerne lipider (ved hjælp af vaskemiddel SDS) efter indlejring prøver i stabile hydrogels; fjernelse af lipider kan opnås enten ved passiv diffusion (f.eks.ændret klarhed protokol21, PAGTEN-PARS-fælge22) eller aktivt ved elektroforese (oprindelige klarhed protokol23 og ACT-PRESTO24). Opmuntret af denne hurtige fremskridt, nogle afledte teknikker også vej til brug i planter.

I denne metoder papir fokuseret på model Arabidopsis, beskrive vi proceduren for ordentlig dissektion af blomsterknopper, blomster, og unge siliques og clearing af hele-mount prøver til forskellige farvning og observation procedurer ved hjælp af klassisk eller en nylig SDS-baserede clearing metode. Gives eksempler for stivelse, callose og kromatin farvning. Selvom disse procedurer kan have yderligere forbedringer og tilpasninger når det bruges med andre arter, håber vi, de vil sætte scenen for yderligere forskning på disse simple men kritiske metoder, der er udgangspunktet for mange forskningsprojekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. blomst og Silique fiksation

  1. Høst blomster og siliques fra planter synkroniseret ved åbningen af den første blomst.
    Bemærk: Under de eksperimentelle betingelser anvendes her, starte planter blomstringen ca 21 dage efter transplantation fra Murashige og Skoog (MS) plader til jord. Frø er stratificeret for 3-4 dage ved 4 ° C og spiret/dyrkes på MS plader på 22 ° C/16 h lys og 18 ° C/8 h mørke for 8-10 dage, før omplantning planter på næringsrig jord i potterne holdes under de samme betingelser (figur 1). Antallet flergangsbestemmelser afhænger af den specifikke forskning mål, men et minimum af 5 blomsterstande (fra 5 individuelle planter) for hver behandling anbefales. Hvis blomster er den eksperimentelle enhed, anbefales et minimum af 10 blomster pr. replikat.
  2. Skære blomsterstande eller blomster (figur 1E-H) ved hjælp af lille saks (fx, neglesakse) og læg dem straks i et microcentrifuge rør (til enkeltblomstrende blomsterstand fiksering) eller en konisk slange (for kollektive optagelse) indeholdende frisk gjort Carnoy's, methanol/eddikesyre eller FPA50 fikseringsmidler (afhængigt af programmet, se nedenfor) på is.
    Bemærk: Prøver skal være helt nedsænket i fiksativ.
  3. Forlade væv i fiksativ for 4 h til natten over ved 4 ° C.
    Bemærk: Vakuum infiltration kan bruges til at fremskynde udbredelsen af fiksativ ind i vævet, men det kan være skadeligt at bevare strukturen af vævet. Forfatterne gennemfører ikke vakuum infiltration.
  4. Fjerne fiksativ, tilføje nok 70% ethanol for at dække prøverne og returnere dem til 4 ° C i mindst 24 timer; prøver kan bo på ubestemt tid i denne løsning. Efter fjernelse af ethanol, gå straks til det næste skridt; dissektion eller SDS clearing.

2. dissektion under stereomikroskopet

  1. Læg frisklavet 70% ethanol i et ur maker glas placeret på en lille petriskål for støtte.
  2. Stedet Blomsterstand/blomst/silique på dette frisk gjort fiksativ og dissekere under stereomikroskopet med pincet og en sprøjte med en nål.
    1. Bruge et ur maker glas eller lignende enhed, der giver mulighed for prøver at være helt dækket med ethanol (anbefales) til dissektion af blomsterstande og rive fra hinanden blomstermotiver organer af modne blomster (bægerblade, kronblade og støvdrager kan blive dissekeret på dette stadium ) at undgå risikoen for prøver udtørring.
  3. Dissekere siliques og små blomsterknopper på et dias, som beskrevet nedenfor.
    1. Lægge ur maker glas med pre forarbejdede prøver, og bruge en normal dias til den endelige dissektion.
    2. Flytte udsnit af interesse til diaset og tilsæt 10 µL af frisk 70% ethanol. Arbejde hurtigt på den endelige dissektion og tilsæt 10 µL af ethanol, hvis nødvendigt, for at holde prøven fugtig uden overdreven væske.
    3. For at frigive pollenkorn fra støvdragere, se trin 5.1. For dissekere carpels og frøanlæg, skal du følge proceduren beskrevet i figur 2. Denne procedure gælder for alle faser af udviklingen af frugtblad, herunder fase af udviklingen af grønne siliques.
      Bemærk: Tilføj ikke ethanol, hvis der er tilstrækkelig ethanol fremførsel fra flytter prøverne; dissekere meget små prøver er meget lettere i en minimal mængde væske. Altid holde kun organer af interesse (bægerblade, kronblade, støvdragere, frugtblade, frøanlæg, frø eller pollenkorn) på diaset. Denne procedure vil sikre en ensartet tykkelse mellem dias og coverslip, svarende til tykkelsen af orgel under behandling, hvilket resulterer i en større ensartethed, og dermed effektiviteten for mikroskopiske undersøgelser (højere antallet af prøver der mål i samme brændplanet).
  4. Bruge et lille stykke trækpapir til at absorbere og fjerne så meget ethanol som muligt. Hurtigt videre til næste trin (afsnit 3, 4 eller 6) før prøven tørrer ud.

3. Kloral hydrat-baserede Clearing og kombinerede Clearing-farvning

Bemærk: Bedste resultater for Kloral hydrat-baserede clearing er fremstillet med FPA50 fast materiale.

  1. Sted 20 µL af clearing løsning (Kloral hydrat/glycerol, ændret Hoyer's medium, Herr's 4½ eller Herr's IKI-4½ løsninger) på modellen-bærende dias. Brug et par sprøjter med hypodermal nåle, at placere enhederne efter behov ved at mindske afstanden mellem dem, og pokkers dem hvor orgel af interesse vender nedad. Fjern eventuelle resterende luftboble ved hjælp af nålen.
  2. Sænke et coverslip sidelæns og forsigtigt lægge det, ved at trykke på meget forsigtigt, og vente, indtil clearing løsning fylder rummet i mellem. Tilføje minimal clearing løsning, hvis det er nødvendigt, at fylde hele rummet under coverslip.
  3. Placer diasset på en diasholderen og forlade det under stinkskab. Fortsæt til mikroskopiske observationer efter mindst 4 h og i de følgende 4-5 dage.

4. kombineret Alexander farvning og Herr's 4½ Clearing af Anthers

Bemærk: Den oprindelige Alexander protokol er baseret på frigive pollenkorn på diaset før farvning. En effektiv og mere informative, ændret Alexander farvning og clearing procedure er farvning af modne pollenkorn inden for moden men ikke-dehiscent støvknapper.

  1. Vælg friskhøstede blomsterknopper, der er ved at åbne med ikke-dehiscent støvknapper.
    Bemærk: Tag ikke yngre blomsterknopper, fordi Alexander farvning er beregnet til modne pollenkorn og ikke effektivt pletter umodne pollenkorn. Et minimum af 5 blomster pr behandling høstet fra forskellige planter og blomsterstande anbefales.
  2. Forberede en 96-brønd plade med nok Alexander løsning at dykke en blomsterknop. Udsætte støvknapperne fjerner bægerblade og kronblade og Fordyb dem i Alexanders løsning. Holde prøver under stinkskab for 1-3 h.
  3. Erstatte Alexanders løsning med Herr's 4½ løsning og placere multi godt pladen tilbage under stinkskab for en natten inkubation.
  4. Brug af pincet, forsigtigt flytte de ryddet blomsterknopper på et nyt dias. Da nogle fremførsel af Alexanders løsning kan forekomme, skal du bruge en trækpapir for at fjerne så meget clearing løsning som muligt.
  5. Dissekere støvdragere og fjerne alle andre væv. Følg trinene i afsnittet 3 bruger Herr's 4½ løsning.

5. fjernelse af Exine fra pollenkorn

Bemærk: Vi anbefaler at bruge Carnoys fixativ for DAPI farvning.

  1. Følg fiksering og dissektion procedurerne beskrevet i punkt 1 og 2. Ved nu, bør man have en til mange støvdragere på dias i et minimum af 70% ethanol.
  2. Bruge en trækpapir til at fjerne overskydende ethanol og tilsættes 5-10 µL af DAPI løsning. Ved hjælp af et par sprøjter med kanyler, frigive pollenkorn inden for denne lille mængde af løsning (f.eks.brug en sprøjte til at immobilisere støvdrager og den anden til at frigive pollenkorn). Tilføje en anden 5 µL af DAPI, hvis løsningen tørrer ud.
  3. At fjerne alle rester af støvdrager er et afgørende skridt, således at kun pollenkorn er tilbage mellem diaset og coverslip.
  4. Placere en coverslip på modellen-bærende dias ved at sænke det sidelæns og tilføje den minimale mængde af DAPI opløsning kræves at fylde rummet. Placer en pegefinger på coverslip, og uden kvaser for meget lave en hurtig, fast og korte glidende bevægelse.
    Bemærk: For at måle den nødvendige kraft og amplituden af den glidende bevægelse, dette trin bør praktiseres flere gange, kontrollerer resultaterne hver gang under mikroskop.
  5. Tilføje DAPI løsning hvis det er nødvendigt og sted dias i en fugtig kasse i mørke ved 4 ° C i 15 min til 1 h. Fortsæt at observere prøver under wide-felt fluorescens eller Konfokal mikroskopi inden for 24 h. forsøge at kombinere denne procedure med SDS clearing for at kontrollere, om yderligere forbedre menter kan opnås.

6. sodium Dodecyl sulfat (SDS) Clearing

Bemærk: Afhængigt af blomster orglet skal analyseres, og forskernes evner til at dissekere meget bløde og små prøver, SDS behandling kan foretages enten før (for erfarne forskere) eller efter dissektion trin (for mindre erfarne forskere) på methanol-eddikesyre fast materiale.

  1. Bruge et ur maker glas, en konkav dias eller et microcentrifuge rør til at udruge dissekeret eller ikke-dissekeret prøver i 1% SDS og 0,2 N NaOH løsning natten over ved stuetemperatur.
  2. Håndterer med omhu, fordi prøven er meget bløde og har en gennemsigtig udseende. Skyl flere gange med vand.
    Bemærk: Resterne af SDS løsning kan føre til fældning når du tilføjer Farvningsopløsningen, fx, anilin blå.
  3. For ikke-dissekeret prøver, skal du følge dissektion proceduren beskrevet i afsnit 2, ved hjælp af vand i stedet for 70% ethanol. Efter dissekere det ønskede væv, fjerne eventuelle rester og snavs og eventuelle overskydende vand med en trækpapir, derefter tilføje 20 – 40 µL af Farvningsopløsningen og Fortsæt med skridt 6,5.
  4. Dissekeret prøver, omhyggeligt flytte prøven fra vask løsningen og placere det på et rent dias, og tilføje 20 – 40 µL af Farvningsopløsningen.
  5. Anbring forsigtigt en coverslip på diaset ved at sænke det sidelæns. Passe på ikke for at mase forberedelsen. Hvis væv er for blød, forlader sted nogen tynde separator i mellem dias og coverslip i dens hjørner (fx, tape eller en brækket coverslip), en kammer-lignende rum mellem dias og coverslip, sådan at coverslip ikke knuse modellen.
  6. Placere alle dias i en fugtig kasse, dæk den med alufolie og placere det ved 4 ° C i mindst 1 h. Fortsæt at observere prøven af med widefield fluorescens eller Konfokal mikroskopi inden for 24 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arabidopsis tilhører familien Brassicacea, forsynet med blomsterstande med biseksuelle blomster arrangeret i en halvskærm (figur 1). Hver blomst har fire bægerblade, fire kronblade, seks støvdragere (fire lange og to korte) og en en frugtstand Støvvejene er bestående af to medfødt sammenvoksede frugtblade (figur 1F-H) arrangeret i fire koncentriske hvirvler25,26. Arabidopsis har tenuinucellate, anatropous æganlæg arrangeret i parietal placentation i to rækker (12-20 frøanlæg i hver række) inden for hver af de to locules i æggestokkene (i alt 45-80 æganlæg) (ikke-offentliggjorte data og referencer27, 28 , 29 , 30). for at foretage robust sammenlignende analyser af blomst og embryo udvikling inden for en enkelt plante eller mellem forskellige planter (som replikater eller behandlinger), er det tilrådeligt at bruge den første åbne blomst som reference (figur 1b). på dette stadium har blomsterstand (figur 1E) normalt mellem 20 og 30 blomsterknopper spænder over alle stadier af blomst udvikling, og på nogenlunde samme stadier i andre personer (ikke-offentliggjorte data). Flere blomst ildens (danner mellem 5 og 20 blomster) vil blive indledt af blomsterstand meristem efter den første blomst åbnet. De to første blomster kan vise frugtbarhed defekter og derfor ikke bør medtages i analysen.

Clearing Arabidopsis blomster og blomstermotiver organer ved hjælp af Kloral hydrat-baserede udføres clearing løsninger31,32, herunder Herr's 4½ clearing løsning33, almindeligvis for differential interferens kontrast ( DIC) mikroskopiske analyser af blomst, silique og embryo udvikling (figur 3A-J). 4½ løsningen er specielt anbefales til at analysere støvdrager udvikling, og for organer kræver stærkere clearing kapacitet. Nogle Kloral hydrat-baserede løsninger anvendes dobbelt med henblik på clearing og farvning samtidigt; Dette er tilfældet for den oprindelige Alexander34 og Herr's IKI-4½35,36 løsninger. Alexander farvning er meget udbredt i Arabidopsis for at evaluere pollen abort. En ændret og mere informative Alexander farvning procedure37 er at bejdse hele støvknapper der indeholder modne pollenkorn. Denne procedure kræver en posterior clearing af støvknapperne ved hjælp af Herr's 4½ løsning (figur 3 K-L). Andre farvning teknikker, der anvendes i forskellige plantearter kan give et bedre skøn over pollen levedygtighed (f.eks.den fluorochromatic reaktion ved hjælp af fluorescein diacetat, farvning for callose, stivelse, DNA, og RNA og enzymatiske test ved hjælp af redox farvestoffer)38,39,40. Men de fleste af disse teknikker evaluere et bestemt aspekt af pollen korn, der ikke måske nødvendigvis korrelerer med pollen levedygtighed og vigtigere, pollen frugtbarhed. En evaluering af pollen spiring evne, og dets evne til at påvirke befrugtning og sat frø kan være mere præcis38-40. En meget mindre anvendte clearing-farvning procedure er Herr's IKI-4½, som kombinerer udredning og stivelse-farvning løsninger. Foruden farvning for stivelse (figur 4), kan denne procedure anvendes til generelle clearing formål når højere kontrast er nødvendige (f.eks. figur 3A, E).

En kombination af auramin og calcofluor bruges i mange plante arter41 til samtidig plette pollen exine og intine (figur 5A). De fleste af disse og andre kemiske farvestoffer pletter ikke en enkelt cellulære komponent, og derfor bør anvendes i kombination med mere direkte mærkning teknikker som GUS fluorescently markeret datamærke linjer antistoffer eller in situ hybridisering. De kan også vise flere excitation og emission spektre. DAPI, derimod er mere specifikke, og er normalt bruges til at plette kromatin og kromosom opslag42 under meiose og følge pollen udvikling43, bortset fra dens mangfoldige anvendelser som en kontrastfarve til kernen. Vi viser her, hvordan farvning intensiteten kan øges for at opnå en mere detaljeret visning af kromatin af sædceller og vegetativt kerner af mekanisk fjernelse af exine (figur 5B-C). Selv om denne teknik er meget nyttigt for dem interesseret i at udføre detaljerede analyser af kromatin, kromosomer og nukleare struktur, kan mekanisk fjernelse af exine påvirke tilrettelæggelsen af pollen korn, sådan at resultaterne bør være fortolkes med varsomhed.

De fleste af disse fluorescerende farvestoffer anvendes uden forudgående clearing af væv; men i nogle tilfælde, de er forenelige med en posterior Kloral hydrat-baseret udredning på dias44. SDS clearing er for nylig blevet brugt som clearing reagens i dyre- og plantearter forskning og har vist sig at være forenelig med forskellige farvning procedurer for widefield fluorescens og konfokal mikroskopi (mPS-PI45 i planter og klarhed23, PAGTEN22 eller ACT-PRESTO24 dyr). Bruger en SDS-NaOH clearing før anilin blå farvning (figur 5 d-H), vi har kunnet opnå højere tilgængelighed til indre væv samt en bedre farvning for callose inden for blomstermotiver væv (figur 5I-L). Lignende resultater blev opnået for calcofluor (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: Fotografier af Arabidopsis planter og blomster. (A-D) Arabidopsis planter på forskellige stadier i livscyklusen: roset før sigtning (A), på første blomst åbning (B), med primære og et par sekundære blomsterstande (C) og i slutningen af blomstrende (D). (E) den typiske halvskærm af en Arabidopsis blomsterstand med blomster på forskellige udviklingsstadier, modning acropetally. (F-H) En Arabidopsis blomst på anthesis, illustrerer selvbestøvning (støvdrager rørende stigmatiseringen og frigive pollenkorn). Tal E-H er fokus stakke af 36, 53, 42 og 32 billeder, henholdsvis, samles ved hjælp af en software-værktøj (fx, Helicon Focus). F-H repræsenterer den samme blomst, hvor ét bægerblad, to kronblade og en kort støvdrager blev fjernet i H. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Hvordan at dissekere en Støvvejene og frøanlæg. (1-3) sted Støvvejene er på et dias med en minimal mængde af 70% ethanol og holdning hænder som afbildet på tegningen. Gøre skærer 1-3 følgende retninger angivet med de røde pile. Brug nålen med åbning vender opad og væk fra æganlæg for snit 2-3. (4-6) rotere frugtblad 180 grader som vist, og skære 4-6 som de første tre nedskæringer. (7) at fjerne ventilerne: bruge nålen med åbningen vendt nedad, placere den under frøanlæg, og skub nålen hurtigt til højre langs ventil margenen. For større frugtblade (anthesis og fremefter), eller med nogle dissektion ekspertise, kan man erstatte dette trin ved at gentage trin 2 og 5 på anden siden af frugtblad. (8-9) Fjern stigmatisering-stil og stilk med skarp nedskæringer ved hjælp af nålen med dens åbning sidelæns og væk fra æganlæggene. (10) gøre en lille skarp skåret på den fremsendende væv niveau på en af de to yderpunkter. (11) bruge pincet og nålen til at rive fra hinanden de to halvdele. (12) ved hjælp af pincet og nålen, forsigtigt flip én række af ovules at opnå to parallelle rækker. Alternativt kan du placere de to rækker lodret med replum liggende ovenfor og skub forsigtigt nedad langs replum at sprede de to ovule rækker på begge sider. To fladtrykt men stadig tilknyttet rækker af ovules efter clearing og farvning med Herr's IKI-4½ løsning er vist som en illustration af resultatet af dissektion. Skalere barer = 80 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Kloral hydrat-baserede clearing med eller uden farvning under flower udvikling. (A) A unge blomsterknop. (B-E) Støvdrager udvikling med mikrospore mor celler i cytokinesis (B), firklange af mikrosporer (C), pollen mitosen I (D) og tricellular pollenkorn (E). (F-J) Støvvejen er indeholdende æganlæg med megaspore mor celler (pil) inden meiose (F og G) og under meiotiske prophase jeg (H), med et binuclear Foster sac (pil), (jeg), og på befrugtning (J). Bemærk spor af en pollen tube (pil) inden for den micropylar region af ovule i J. (K-L) Modificerede Alexander er farvning af anthers med fuld (K) eller reduceret pollen levedygtighed på grund af varmestress (L). Bemærk de tomme cytoplasma og uregelmæssige former af aborterede pollenkorn i anther locules i L. Arabidopsis vildtype Col-0 tiltrædelse. Clearing eller farvning: Herr's 4½ for B-D og F-J, Herr's IKI-4½ for A og E, og ændret Alexander farvning for K-L. Skalere barer = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: stivelse dynamics under flower og tidligt frø udvikling. Repræsentative resultater illustrerer den dynamiske stivelse omsætning under flower udvikling. (A-C) Den tredje bølge af stivelse amylogenesis/amylolysis i de sidste faser af støvdrager udvikling som for nylig beskrev39. (D-G) Repræsentative resultater af den unikke stivelse bølge i pollen korn med en top af amylogenesis i den bicellular fase. (H-N) Repræsentative resultater af stivelse dynamics i æganlæg på megaspore mor celle stadium (H), udvikle kvindelige gametofytter (-K), og i den tidlige seed udvikling (lige efter befrugtning i Larsen, binucleate frøhvide i M , og octant embryo fase i N). Arabidopsis vildtype Col-0 tiltrædelse. Skalere barer = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: nogle klassiske farvning procedurer til fluorescens mikroskopi og effekten af SDS-clearing. (A) Calcofluor-auramin farvning under pollen modning hvor intine farves blå (calcofluor) og exine intenst grønne (auramin). (B-C) Mekaniske fjernelse af exine og DAPI farvning af tricellular pollenkorn. (D-H) Repræsentative billeder af en blomsterstand før (D, som inddrives fra fiksativ) og efter SDS clearing (E-H). Bemærk gennemsigtighed af væv, der giver mulighed for observation af Vaskulaturen i Blomsterstanden stamceller (G) og blomsterknop stilk (H). (I-J) Anilin blå farvning for callose i mikrosporer på stadiet tetrad inden for støvdrager. Sammenligne klarheden og intensitet af farvning mellem de ikke-SDS ryddet anther, (jeg) og SDS-ryddet anther (J). (K) en SDS-ryddet og anilin blå farves anther med mikrosporer under pollen mitosen I. Bemærk synchrony af mange pollenkorn i denne fase i disse to locules. (L) An SDS-ryddet og anilin blå farves ovule efter befrugtningen. Bemærk callose farvning i resterne af pollen tube og frø frakke. Arabidopsis vildtype Col-0 tiltrædelse. Skalalinjen = 20 µm (A-C,-L); 1 mm (D-H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksistensen af mange blomsterknopper inden for en enkelt blomsterstand af Arabidopsis, der spænder over alle blomst udviklingsstadier, tilbyder en unik mulighed for undersøgelser rettet mod kendetegner en effekt af en behandling eller en udviklingsmæssig funktion samtidigt på tværs af de forskellige stadier af blomst udvikling. En god referencepunkt mellem forskellige individuelle planter er åbningen af den første blomst af den største blomsterstand. Planter er behandlet på en sådan måde, at blomstringen er synkroniseret så meget som muligt (f.eks.3-4 dage stratificering ved 4 ° C maksimerer synkron frø spiring og dermed mere selv blomstring), og kun planter, der åbner deres første blomst på den samme dag er taget som en batch til at distribuere mellem behandlinger og replikater; partier klar på hinanden følgende dage kan bruges til at gentage eksperimentet. Efter denne procedure, mere robust komparative analyser, kontrollere for miljømæssige og udviklingsmæssige variationer inden for og mellem planter, kan udføres.

Kombinere Lugols pletten med Herr's clearing løsning tillod os ikke blot at forbedre kontrasten i ryddet prøver i forhold til klassisk clearing løsninger, men også til at karakterisere stivelse dynamics under flower og embryo udvikling, som for nylig rapporteret for Arabidopsis 46. bruger denne enkle procedure, vi var i stand til at optrævle eksistensen af en ny bølge af stivelse amylogenesis-amylolysis under anther udvikling, og at korrelere stivelse dynamics med globale ændringer i udtrykket af gener kodning proteiner involveret i sukker og stivelse stofskifte. Denne analyse viste, at GPT6 er translocator af sukker-fosfat fra cytosol til amyloplasts for stivelse syntese. De detaljerede resultater på stivelse dynamics i forskellige væv åbner muligheden for kendetegner andre vigtige gener i stivelse stofskifte, og at løse uløste spørgsmål vedrørende mindre studerede men vigtigt udviklingstrin plante. Jod-baserede stivelse farvning er ikke kvantitative, og bør suppleres med andre metoder46.

Forskning søger forbedret clearing procedurer, der er kompatible med Fluorescens mikroskopi har intensiveret i de seneste år, især med hensyn til dyr. Selv om feltet plante forskning sakker agterud, og clearing i vid udstrækning bygger på traditionelle clearing løsninger for DIC analyse (f.eks.Kloral hydrat-baserede løsninger, benzyl benzoate, dibutylphthalat og Methylsalicylat)31 ,33,47,48, opmuntret af den hurtige fremskridt i feltet dyr nogle lignende teknikker opstår ved hjælp af urinstof - (fx, ClearSee49 og andre50), og 2, 2'-thiodiethanol-baserede clearing procedurer51,52. Her, viser vi, at brugen af SDS vaskemiddel i kombination med NaOH gør vævet gennemsigtig og forbedrer nogle klassiske fluorescens farvning procedurer, såsom anilin blå for callose og calcofluor for cellulose. Baseret på disse lovende resultater, kan lignende fremskridt med SDS-baserede selektive fjernelse af lipider forventes i feltet plante i den nærmeste fremtid. Da planteceller har stive cellevægge, der er fraværende i animalske celler, forudgående integrering i hydrogels kan ikke være nødvendigt, som er tilfældet for animalsk væv. Andre fluorescerende farvestoffer og fluorophores anvendes i genetiske markør linjer kan analyseres ved hjælp af denne clearingsystem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af universitetet i Zürich, en IEF Marie Curie Grant (give nr. TransEpigen-254797 til A.H.), en avanceret ydelse af det Europæiske Forskningsråd (give nr. Medea-250358 til U.G.), og en forskning og teknologiudvikling projekt (grant MecanX til U.G.) fra SystemsX.ch, den schweiziske initiativ i systembiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
Ethanol Scharlau ET00102500
Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Methanol Scharlau ME03062500
Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
Propionic acid Sigma-Aldrich 81910-250 ml
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 15307
Glycerol Roth 3783.1
Gum arabic Fluka 51198
Lactic acid Fluka 69773
Phenol Sigma-Aldrich 77607-250ML We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil Sigma-Aldrich C8392-100ML
Xylene Roth 4436.1
Iodine Fluka 57665
Potassium iodide Merck 5043
Malachite Green Fluka 63160
Fuchsin acid Fluka 84600
Orange G Sigma 7252
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate Applichem A1047,1000
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763-1KG
Potassium phosphate Sigma-Aldrich 04347
EDTA Applichem A2937,1000
Calcofluor Sigma F6259 Fluorescent brightener 28
Auramine Chroma 10120
DAPI Sigma D9542 toxic
Triton-X-100 Sigma T8787
Aniline blue Merck 1275
MS medium Carolina 19-57030
Nutrient-rich substrate Einheitserde ED73
Watch maker's glass No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
Forceps DUMONT BIOLOGY 0108-5
Syringe BD BD Plastipak 300013 1 ml
Preparation needle BD BD Microlance 304000
Microscope slides Thermo Scientific 10143562CE cut edges
Coverslips Thermo Scientific DV40008
Humid box A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½ To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M) Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmål 134 Herr's clearing Hoyer's clearing SDS clearing Lugols jod farvning DAPI farvning anilin blå ovule udvikling pollen udvikling
Hele-mount Clearing og farvning af <em>Arabidopsis</em> blomst organer og Siliques
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hedhly, A., Vogler, H.,… More

Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter