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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/56441
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

Summary

In diesem Protokoll wir beschreiben Techniken für die richtige Zerlegung von Arabidopsis Blumen und Siliques, einige grundlegende Clearing-Techniken und Färbung Verfahren für ganz-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen ausgewählt.

Abstract

Aufgrund seiner gewaltigen Werkzeuge für Molekulare genetische Studien ist Arabidopsis Thaliana eines der prominentesten Modell Arten in Pflanzenbiologie und insbesondere Anlage Reproduktionsbiologie. Allerdings beinhalten Pflanzen-morphologische, anatomische und Ultrastrukturforschung Analysen traditionell zeitraubende einbetten und Verfahren für Hellfeld, Scannen und Elektronenmikroskopie-Schnitt. Jüngste Fortschritte in konfokale Fluoreszenzmikroskopie, State-of-the-Art 3-d-CAD-mikroskopische Analysen und die kontinuierliche Verbesserung der molekularen Techniken auf gering verarbeitete ganze-Mount Proben verwendet werden führte zu einer steigenden Nachfrage nach Entwicklung effizienter und minimale Probe Verarbeitungstechniken. In diesem Protokoll beschreiben wir Techniken für richtig sezieren Arabidopsis Blumen und Siliques, grundlegende Techniken, clearing und einige befleckenden Verfahren zur gesamten-Mount Beobachtungen der reproduktiven Strukturen.

Introduction

Blumen sind eines der wichtigsten Organe der Angiospermen definieren. Blühende Pflanzen erschienen vor 90 Millionen Jahren1, und so schnell, dass ihre schnelle aussehen als eine "abscheuliche Geheimnis" von Charles Darwin2beschrieben wurde diversifiziert. Die Interessen der Pflanzenforscher Blütenentwicklung sind vielfältig. Einige Forschung konzentriert sich auf das Verständnis des evolutionären Ursprungs der Blume als Ganzes oder die Entwicklung der spezifischen anatomischen, strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Blumen3,4,5,6 . Die hohe Varianz in florale Form und Struktur sowie die Modi der sexuelle und asexuelle Reproduktion unter Berufung auf sie, machen der Blume ein hochkomplexes Gebilde. Dies führte zu vielfältigen Bemühungen um die Anatomie und strukturelle Eigenschaften von blütenorganen, mit Licht und Elektronen mikroskopischen Techniken, die in mit genetischen und molekularbiologischen Untersuchungen7 Kombinationzu charakterisieren. Darüber hinaus als Quelle von Früchten und Samen, sind Blumen von größter Bedeutung für die Human-und Tierernährung. Daher hat die Charakterisierung von Blüte und Frucht Entwicklung viele Konsequenzen für angewandte Forschung, einschließlich der Sicherung der Ernährung einer wachsenden Weltbevölkerung und ökologische Erhaltung Strategien im Rahmen einer sich ändernden Umwelt8 , 9 , 10.

Blütenentwicklung in Arabidopsis beginnt mit Blume Induktion und die Transformation von der vegetativen Meristem, ein Blütenstand (Gruppe von Blumen) Meristem. Blume Primordia sind seitlich an der Flanke der Blütenstand Meristem11eingeleitet. Die floralen Orgel Primordia schrittweise in konzentrischen Windungen von außen in die Mitte der Blüte zu bilden und schließlich in Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter und Fruchtblätter7entwickeln. Diese blütenorganen erfüllen unterschiedliche nutritive, Schutz- und funktionale (z.B.Bestäuber Attraktion) Rollen in verschiedenen Pflanzenarten mit den Geschlechtsorganen, die nachhaltige Entwicklung der männlichen und weiblichen Gametophyten, bzw.12 , 13. die Gametophyten wiederum jeweils ein paar männlich (Sperma) unterscheiden und weiblichen Gameten (Ei und zentrale Zelle), die auf einen doppelte Befruchtung an die nächste Generation, die Zygote und primäres Endosperm bilden ein terminal Gewebe unterstützen die Entwicklung des Embryos14,15. Frucht und Samen Entwicklung unterstützen das Wachstum, Reifung und Konservierung des Embryo und schließlich seine Ausbreitung. Umfangreicher Forschung ist durchgeführt worden, zur Charakterisierung von Blume und Embryo Entwicklung in verschiedenen Pflanzenarten, vor allem in der Modell-Spezies Arabidopsis7,16,17.

Frühe mikroskopische Analysen der Blütenentwicklung beruhten auf zeitraubende Probenbearbeitung und Beobachtung, dass Techniken wie Paraffin oder Harz einbetten und -Schnitt, mit Licht oder Elektronenmikroskopie kombiniert. Diese traditionellen mikroskopischen Techniken wurden oft in Kombination mit molekularen genetischen Untersuchungen, wie mikroskopische Analysen von Mutanten, die Lokalisierung der RNA durch in Situ Hybridisierung oder die Immuno-Erkennung von Proteinen verwendet. Jüngste Fortschritte im Weitfeld- und konfokale Fluoreszenzmikroskopie in State-of-the-Art 3-d CAD-Bild-Analysen und die kontinuierliche Verfeinerung der molekularen Methoden, die auf gering verarbeitete ganze-Mount Proben verwendet werden kann führte zu einem Bedarf an Beispiel für effiziente und minimale Verarbeitungstechniken, die Quantitative Analysen bevorzugt zugänglich sind. In den letzten Jahren erhebliche Fortschritte bei der Entwicklung von Clearing-Techniken auf tierische Probe vollständig-hängen. Machen sie der Probe transparent entweder mit wässrigen Harnstoff oder zuckerhaltigen Reagenzien (z. B., Maßstab, SeeDB, KUBISCH)18,19,20, oder selektiv entfernen Lipide (unter Verwendung des Waschmittels SDS) nach Proben einbetten in stabilen Hydrogele; die Entfernung von Lipiden kann entweder durch passive Diffusion (z.B.Klarheit Protokoll21, Pakt-PARS-Felgen22geändert) oder aktiv durch Elektrophorese (ursprüngliche Klarheit Protokoll23 und ACT-PRESTO-24). Ermutigt durch diese schnelle Fortschritte, entstehen einige abgeleiteten Techniken auch für den Einsatz in Anlagen.

In diesem Methodenpapiers konzentrierte sich auf das Modell Arabidopsisbeschreiben wir das Verfahren für die ordnungsgemäße Zerlegung des jungen Siliques, Knospen und Blumen, und die Räumung des gesamten-Mount Proben für unterschiedliche Färbung und Beobachtung Verfahren mit klassische oder eine aktuelle SDS-basierte Clearing-Methode. Beispiele für Stärke, Zellstress und Chromatin zu beflecken. Obwohl diese Verfahren weitere Verbesserungen und Anpassungen bei Verwendung mit anderen Arten benötigen können, hoffen wir, dass sie die Bühne für die weitere Forschung auf diese einfachen, aber wichtigen Methoden festgelegt werden, die der Ausgangspunkt zahlreicher Forschungsprojekte sind.

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Protocol

1. Blume und Schote Fixierung

  1. Ernte Blumen und Siliques aus Pflanzen synchronisiert bei der Eröffnung der ersten Blüte.
    Hinweis: Unter den experimentellen Bedingungen hier verwendete, Pflanzen blühen beginnen ungefähr 21 Tage nach der Transplantation von Murashige und Skoog (MS) Platten zu Boden. Samen sind geschichtete für 3 – 4 Tage bei 4 ° C und gekeimt/gewachsen auf MS-Platten bei 22 ° C/16 h Licht und 18 ° C/8 h dunkel für 8 bis 10 Tage vor der Verpflanzung der Sämlinge auf nährstoffreichen Böden in Töpfen gehalten unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 1). Die Anzahl der Wiederholungen hängt von der spezifischen Forschungsziel, aber mindestens 5 Blütenstände (aus 5 einzelnen Pflanzen) für jede Behandlung wird empfohlen. Blumen sind das Versuchsgerät, empfiehlt ein Minimum von 10 Blüten pro replizieren.
  2. Schneiden Sie Blütenstände oder Blumen (Abb. 1E-H) mit einer kleinen Schere (z.B. Nagelschere) und legen Sie sie sofort in einem Microcentrifuge Schlauch (für einzelne Blütenstand/Blume Fixierung) oder eine konische Rohr (für kollektive Fixierungen) mit frisch gemacht Carnoy, Methanol/Essigsaure Säure oder FPA50 Fixiermittel (je nach Anwendung, siehe unten) auf dem Eis.
    Hinweis: Proben sollten vollständig in das Fixiermittel eingetaucht werden.
  3. Lassen Sie das Gewebe innerhalb der Fixiermittel für 4 h bei 4 ° c über Nacht
    Hinweis: Vakuum Infiltration kann verwendet werden, für die Beschleunigung des Eindringen von das Fixiermittel in das Gewebe, aber dies möglicherweise nachteilig für die Erhaltung der Struktur des Gewebes. Die Autoren umsetzen Vakuum Infiltration nicht.
  4. Das Fixiermittel zu entfernen, fügen Sie genügend 70 % igem Ethanol um die Proben zu decken, und bringt sie auf 4 ° C für mindestens 24 h; Proben können auf unbestimmte Zeit in dieser Lösung bleiben. Nach dem Entfernen von Ethanol, sofort mit dem nächsten Schritt fortfahren; Dissektion oder SDS-Clearing.

2. Präparation unter dem Stereomikroskop

  1. Setzen Sie gemacht frisch 70 % Ethanol in einem Uhrmacher Glas auf eine kleine Petrischale für Unterstützung.
  2. Ort der Blütenstand/Blume/Schote dazu frisch aus Fixiermittel und unter dem Stereomikroskop mit Zange und eine Spritze mit einer Nadel zu sezieren.
    1. Verwenden Sie ein Uhrmacher Glas oder ähnliches Gerät, das die Proben mit Ethanol (empfohlen) für die Zerlegung der Blütenstände und zerreißen blütenorganen Reifen Blüten (Kelchblätter, Blütenblätter und Staubfäden können in diesem Stadium seziert werden total überzogen sein können ), das Risiko von Proben Austrocknen zu vermeiden.
  3. Sezieren Sie Siliques und kleine Blütenknospen auf einer Folie, wie unten beschrieben.
    1. Der Uhrenhersteller Glas mit vorbehandelte Proben beiseite, und verwenden Sie eine normale Folie für die endgültigen Zerlegung.
    2. Verschieben der Probe von Interesse auf die Folie und fügen Sie 10 µL frisch 70 % Ethanol. Arbeiten Sie zügig auf die endgültigen Zerlegung und 10 µL Ethanol, fügen Sie, falls nötig, um die Probe ohne übermäßige Flüssigkeit feucht zu halten.
    3. Für Freigabe Pollenkörner von Staubblättern, siehe Punkt 5.1. Folgen Sie für sezieren Fruchtblätter und Eizellen, Verfahren Sie wie in Abbildung 2. Dieses Verfahren gilt für alle Phasen der Entwicklung von Fruchtblatt, einschließlich der Entwicklungsstand des grünen Siliques.
      Hinweis: Fügen Sie Ethanol nicht hinzu, wenn es ausreichend Ethanol Verschleppung gibt von bewegten die Proben; sehr kleine Proben sezieren ist viel einfacher in eine minimale Menge an Flüssigkeit. Halten Sie immer nur die Organe von Interesse (Kelchblätter, Blütenblätter, Staubblätter, Fruchtblätter, Eizellen, Samen oder Pollenkörner) auf der Folie. Dieses Verfahren sorgt für eine gleichmäßige Dicke zwischen der Folie und Deckglas, entspricht der Dicke des Organs untersucht, wodurch eine höhere Homogenität und damit Effizienz für mikroskopische Untersuchungen (höhere Anzahl von Ziel-Proben in der gleichen Brennebene).
  4. Verwenden Sie ein kleines Stück Löschpapier zu absorbieren und so viel Ethanol als möglich zu entfernen. Schnell fahren Sie mit dem nächsten Schritt (Kapitel 3, 4 oder 6) vor der Probe austrocknet.

3. Chloral Hydrate-basierte Abrechnung und kombinierte Clearing-Färbung

Hinweis: Beste Ergebnisse für Chloral Hydrate-basierte Clearing werden mit FPA50 befestigt Material erzielt.

  1. Platz 20 µL der clearing-Lösung (Chloral Hydrate/Glycerin, modifizierte Hoyers Medium, die Herr 4½ oder Herr der IKI-4½ Lösungen) auf der Probe-Lager-Folie. Mit ein paar Spritzen mit hypodermal Nadeln, positionieren die Proben nach Bedarf durch Verringerung des Raumes zwischen ihnen, und spiegeln diejenigen wo steht das Organ der Zinsen nach unten. Entfernen Sie alle verbleibenden Luftblase mit der Nadel.
  2. Senken Sie ein Deckglas seitlich zu sanft legen Sie es, sehr sanft drücken und warten Sie, bis die Clearing-Lösung den Raum dazwischen füllt. Bei Bedarf den gesamte Raum unter dem Deckglas füllen, fügen Sie minimale Clearing-Lösung hinzu.
  3. Legen Sie die Folie auf einen Diahalter und lassen Sie es unter dem Abzug. Fahren Sie mit mikroskopischen Beobachtungen nach mindestens 4 h und in den nächsten 4 – 5 Tagen.

4. Alexander Färbung und der Herr 4½ Räumung der Antheren kombiniert

Hinweis: Das ursprüngliche Alexander-Protokoll basiert auf Freigabe Pollenkörner auf der Folie vor Verschmutzung. Eine effiziente und informativer, Alexander Färbung und clearing-Verfahren ist die Färbung der Reife Pollenkörner im Reifen aber nicht aufspringende Antheren geändert.

  1. Wählen Sie aus frisch geernteten Blütenknospen, die mit nicht aufspringende Antheren öffnen.
    Hinweis: Nehmen Sie jüngere Blütenknospen nicht, weil Alexander Färbung sich an Reife Pollenkörner richtet und nicht effizient unreifen Pollenkörner befleckt. Ein Minimum von 5 Blüten pro Behandlung aus verschiedenen Pflanzen und Blütenstände geerntet wird empfohlen.
  2. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit genügend Alexander Lösung um eine Blütenknospe zu versenken. Setzen Sie die Staubbeutel durch Entfernen der Kelchblätter und Kronblätter und tauche sie in Alexanders Lösung. Halten Sie die Proben unter dem Abzug für 1 – 3 h.
  3. Ersetzen Sie Alexanders Lösung zu, mit der Herr 4½ Lösung und setzen Sie die Multi-well-Platte wieder unter dem Abzug für eine Inkubation über Nacht.
  4. Mit Pinzette, sanft bewegen Sie die geräumten Blütenknospen in eine neue Folie. Da einige Verschleppung von Alexanders Lösung auftreten kann, verwenden Sie ein Löschpapier, um soviel Clearing-Lösung wie möglich zu entfernen.
  5. Die staubblätter zu sezieren und andere Gewebe zu entfernen. Führen Sie die Schritte in Abschnitt 3 des Herrn 4½-Lösung.

5. entfernen die Exine aus Pollenkörner

Hinweis: Wir empfehlen Carnoy Fixativ für DAPI-Färbung.

  1. Führen Sie die Fixierung und Dissektion Verfahren, die in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben. Jetzt sollte man ein bis viele staubblätter auf der Folie in einen Mindestbetrag von 70 % Ethanol haben.
  2. Verwenden Sie ein Löschpapier, um überschüssige Ethanol zu entfernen, und fügen Sie 5 – 10 µL DAPI-Lösung. Mit ein paar Spritzen mit Nadeln, lassen Sie die Pollenkörner in diese kleine Menge Lösung (z. B.Verwendung einer Spritze, die Staubfäden und andererseits die Pollenkörner freizugeben zu immobilisieren). Fügen Sie ein weiteres 5 µL DAPI, wenn die Lösung trocknet aus.
  3. Entfernen allen Schmutz von den Staubfäden ist ein wichtiger Schritt, so, dass nur Pollenkörner sind zwischen der Folie und dem Deckglas Links.
  4. Platzieren Sie ein Deckglas auf der Probe-Lager-Folie durch seitlich absenken und fügen Sie die minimale Menge an DAPI-Lösung erforderlich, um den Raum zu füllen. Legen Sie einen Zeigefinger auf das Deckglas und ohne quetschen zu viel machen eine schnelle, feste und kurze Gleitbewegung.
    Hinweis: Um die notwendige Kraft und die Amplitude der gleitenden Bewegung einschätzen zu können, sollte diesen Schritt mehrmals geübt werden überprüft die Ergebnisse jedes Mal unter die Lupe genommen.
  5. DAPI-Lösung bei Bedarf hinzufügen und statt die Folie in eine feucht-Box im Dunkeln bei 4 ° C für 15 min bis 1 Uhr weiter Proben unter Weitfeld-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie innerhalb von 24 Std. zu beobachten versuchen, dieses Verfahren mit SDS löschen um zu überprüfen, ob weitere kombinieren verbessern rungen können abgerufen werden.

(6) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) löschen

Hinweis: Je nach floralen Organ analysiert werden, und auf der Forscher Fähigkeiten, sehr weich und kleine Exemplare zu zergliedern, die SDS-Behandlung kann erfolgen entweder vor (für erfahrene Forscher) oder nach der Dissektion Schritt (für weniger erfahrene Forscher) auf Methanol Essigsäure Säure Material fixiert.

  1. Verwenden Sie ein Uhrmacher Glas, eine konkave Folie oder einem Microcentrifuge Schlauch sezierte oder nicht seziert Proben in 1 % SDS und 0,2 N NaOH-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.
  2. Mit Vorsicht zu handhaben, weil die Probe sehr weich ist und eine transparente Erscheinung hat. Mehrmals mit Wasser abspülen.
    Hinweis: Reste der SDS-Lösung können zu Niederschlag führen, beim Hinzufügen der Färbelösung, z.B., Anilin-blau.
  3. Folgen Sie für nicht seziert Proben Dissektion Verfahren Sie wie in Abschnitt 2, mit Wasser statt 70 % Ethanol. Entfernen Sie nach sezieren das gewünschte Gewebe alle Reste und Schmutz und überschüssiges Wasser mit einem Löschpapier, dann fügen Sie 20 – 40 µL der Färbelösung und fahren Sie mit Schritt 6.5.
  4. Für seziert Proben sorgfältig bewegen der Probenmaterials aus der Waschlösung und legen Sie sie in eine saubere Folie und fügen Sie 20 – 40 µL der Färbelösung.
  5. Legen Sie ein Deckglas vorsichtig auf der Folie durch seitlich absenken. Achten Sie darauf, nicht um die Vorbereitung zu zerquetschen. Wenn das Gewebe zu weich ist, verlassen findet eine Trennlinie in der Folie und dem Deckglas an seinen Ecken (z.B., Band oder einem gebrochenen deckgläschen), dünn einen Kammer-artigen Raum zwischen Folie und Deckglas, derart, dass das Deckglas die Probe vernichten nicht.
  6. Legen Sie die Folien in einem feucht-Box, mit Alufolie decken Sie ab, und legen Sie sie bei 4 ° C für mindestens 1 Stunde fahren Sie mit die Probe mit Weitfeld-Fluoreszenz oder der konfokalen Mikroskopie innerhalb von 24 h zu beobachten.

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Representative Results

Arabidopsis gehört zur Familie Brassicacea, Lager Blütenstände mit bisexuell Blumen in einer doldentraube (Abbildung 1). Jede Blume hat vier Kelchblätter, vier Blütenblätter, sechs staubblätter (vier lange und zwei kurze) und ein syncarpous Gynoeceum, bestehend aus zwei Geburt an geschmolzenen Fruchtblätter (Abb. 1F-H) in vier konzentrische Umgänge25,26angeordnet. Arabidopsis hat Tenuinucellate, anatropous Samenanlagen in parietalen Einpflanzung in zwei Reihen (12-20 Samenanlagen in jeder Zeile) in jedem der zwei Nischen des Eierstocks (insgesamt 45 – 80 Eizellen) angeordnet (unveröffentlichte Daten und Referenzen27, 28 , 29 , 30). um robuste vergleichende Analysen der Blume und Embryo Entwicklung innerhalb einer einzelnen Anlage oder zwischen verschiedenen Pflanzen (als Wiederholungen oder Behandlungen) zu verpflichten, ist es ratsam, die erste offene Blume als Referenz (Abbildung 1 b). in diesem Stadium der Blütenstand (Abbildung 1E) hat in der Regel zwischen 20 und 30 Blütenknospen umfasst alle Phasen der Blütenentwicklung und in etwa ähnliche Phasen bei anderen Personen (unveröffentlichte Daten). Mehr Blume meristeme (zwischen 5 und 20 Blumen bilden) werden durch den Blütenstand Meristem eingeleitet werden, nach die erste Blüte öffnen. Die ersten beiden Blüten könnte Fruchtbarkeit Defekte aufweisen und sollten daher nicht in die Analyse einbezogen werden.

Clearing von Arabidopsis Blumen und blütenorganen mit Chloral Hydrate-basierte clearing-Lösungen31,32, einschließlich der Herr 4½ clearing-Lösung33, häufig erfolgt für differential Interferenz Kontrast ( DIC) mikroskopische Analysen der Blume, Schote und Embryo Entwicklung (Abb. 3A-J). Die 4½ Lösung ist speziell für Stamen Entwicklung zu analysieren, und Organe erfordern stärkere Clearing Kapazität empfohlen. Einige Chloral Hydrate-basierte Lösungen sind für den doppelten Zweck von clearing und gleichzeitig Färbung verwendet; Dies ist der Fall für die ursprüngliche Alexander34 und die Herr IKI-4½35,36 Lösungen. Alexander, die Färbung ist in Arabidopsis verbreitet, um Pollen Abtreibung zu bewerten. Eine modifizierte und informativer Alexander Färbung Verfahren37 ist, ganze Antheren mit Reife Pollenkörner zu beflecken. Dieses Verfahren erfordert eine posteriore Lichtung die Staubbeutel mit Herr der 4½-Lösung (Abbildung 3 K-L). Anderen befleckenden Techniken in verschiedenen Pflanzenarten verwendet möglicherweise eine bessere Abschätzung der Pollen Lebensfähigkeit (z. B.die fluorochromatic Reaktion mit Fluorescein-Diacetat, Färbung für Zellstress, Stärke, DNA, RNA und enzymatische Tests mit bieten. Redox-Farbstoffe)38,39,40. Allerdings bewerten die meisten dieser Techniken einen bestimmten Aspekt des pollenkorn, die nicht unbedingt mit Pollen Lebensfähigkeit und allem Pollen Fruchtbarkeit korrelieren kann. Eine Bewertung der Pollen Keimfähigkeit und seine Fähigkeit zur Befruchtung bewirken und stellen Samen möglicherweise genauer38–40. Eine viel weniger gebrauchte Clearing-Färbung Prozedur ist Herr von IKI-4½, die Reinigung und Stärke-Färbung Lösungen verbindet. Neben der Färbung für Stärke (Abbildung 4), kann dieses Verfahren für allgemeine Clearing Zwecke verwendet werden, wann immer höherer Kontrast benötigt (z. B. Abbildung 3A, E) ist.

Eine Kombination von Auramin und Calcofluor ist in vielen pflanzlichen Arten41 verwendet, um gleichzeitig die Pollen Exine und Intine (Abb. 5A) färben. Die meisten von diesen und anderen chemischen Farbstoffe keine Flecken, eine einzelne zelluläre Komponente und sollte daher in Kombination mit direkter Kennzeichnung Techniken wie GUS oder fluoreszent markiert Markierungslinien, Antikörper oder in Situ Hybridisierung verwendet werden. Sie können auch mehrere Anregung und Emission-Spektren zeigen. DAPI, im Gegensatz dazu ist genauer, und dient in der Regel, Chromatin und Chromosom breitet sich42 während der Meiose zu beflecken und Pollen Entwicklung43, neben seinen vielfältigen Anwendungen wie eine gegenfärbung für den Kern zu folgen. Hier zeigen wir, wie die Färbung Intensität erhöht werden kann, um eine detailliertere Ansicht des Chromatins der Spermien und vegetativen Kernen durch mechanisch entfernen die Exine (Abbildung 5 b-C) zu erhalten. Obwohl diese Technik sehr hilfreich für Interessenten, die ist bei der Durchführung von detaillierter Analysen von Chromatin und Chromosomen Kernstruktur, wirkt die mechanische Entfernung der Exine die Organisation das pollenkorn so dass Ergebnisse sollten mit Vorsicht interpretieren.

Die meisten dieser fluoreszierende Farbstoffe werden ohne vorherige Clearing des Gewebes verwendet; aber in einigen Fällen sind sie kompatibel mit einer hinteren Chloral Hydrate-basierte auf der Folie44löschen. SDS clearing hat vor kurzem als clearing-Reagenz in der Tier- und Pflanzenwelt Forschung verwendet worden und hat gezeigt, dass mit verschiedenen befleckenden Verfahren zur Weitfeld Fluoreszenz und konfokalen Mikroskopie (mPS-PI45 in Pflanzen und Klarheit23, kompatibel Pakt22 oder ACT-PRESTO24 bei Tieren). Mit einem SDS-NaOH clearing vor Anilin blaue Färbung (Abbildung 5-H), konnten wir höhere Zugang zu inneren Geweben sowie eine bessere Färbung für Zellstress innerhalb Blumen Gewebe (Abbildung 5I-L) zu erreichen. Ähnliche Ergebnisse wurden für Calcofluor (Daten nicht gezeigt).

Figure 1
Abbildung 1: Fotos von Arabidopsis -Pflanzen und Blumen. (A-D) Arabidopsis-Pflanzen in den verschiedenen Phasen des Lebenszyklus: Rosette vor Verschraubung (A), am ersten Blüte öffnen (B), mit primär- und ein paar sekundäre Blütenstände (C) und am Ende der Blüte (D). (E) die typischen doldentraube eine Arabidopsis Blütenstand mit Blüten in unterschiedlichen Entwicklungsstadien, acropetally Reifung. (F-H) Eine Arabidopsis Blume bei Vollblüte, illustriert Selbstbestäubung (staubblätter die Narbe berühren und loslassen Pollenkörner). Zahlen E-H sind Fokus Stapeln von 53, 36, 42 und 32 Bilder, bzw. mit einem Software-Tool (z.B.Helicon Focus) montiert. F-H vertreten die gleiche Blume, wo ein Kelchblatt, zwei Blütenblätter und einen kurzen Staubfäden in Hentfernt wurden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: wie man ein Gynoeceum und Eizellen zergliedern. (1-3) findet das Gynoeceum auf einer Folie mit einer minimalen Menge von 70 % Ethanol und Position Hände wie in der Zeichnung dargestellt. Machen schneidet 1-3 folgt die Anweisungen durch den roten Pfeilen angezeigt. Benutzen Sie die Nadel mit der Öffnung nach oben und Weg von der Eizellen für Kürzungen von 2-3. (4-6) Fruchtblatt 180 Grad zu drehen, wie gezeigt, und schneidet 4-6 wie die ersten drei Einschnitte zu machen. (7) Entfernen der Ventile: benutzen Sie die Nadel mit der Öffnung nach unten, legen Sie sie unter die Samenanlagen und schieben Sie die Nadel schnell nach rechts entlang der Ventil-Marge. Für größere Fruchtblätter (anthese und vorwärts), oder mit einigen Dissektion Expertise kann man diesen Schritt durch Wiederholung der Schritte 2 und 5 auf der anderen Seite das Fruchtblatt ersetzen. (8-9) Entfernen der Stigma-Stil und der Stiel mit scharfen schneidet mit der Nadel mit ihrer Öffnung seitlich und Weg von den Samenanlagen. (10) stellen eine kleine scharfe schneiden bei der Übertragung Gewebe Ebene an einem der beiden Extreme. (11) die Zange und die Nadel verwenden, um die beiden Hälften auseinander heftig zu zerreißen. (12) mit der Zange und die Nadel sanft flip eine Zeile der Eizellen zu zwei parallele Reihen zu erhalten. Alternativ legen Sie die zwei Zeilen vertikal mit der oberhalb liegenden Replum und drücken Sie sanft nach unten entlang der Replum, die beiden Ovulum Reihen auf beiden Seiten zu verbreiten. Zwei abgeflacht, aber noch angebrachten Reihen von Eizellen nach Reinigung und Färbung mit Herr IKI-4½ Lösung als Beispiel für das Ergebnis der Obduktion gezeigt werden. Skalieren Sie Bars 80 µm = Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Chloral Hydrate-basierte Clearing mit oder ohne Färbung während der Blütenentwicklung. (A) A junge Blütenknospe. (B-E) Staubfäden Entwicklung mit Microspore Mutter Zellen in Cytokinese (B), tetraden der Microspores (C), Pollen Mitose Pollenkörner ich (D) und Tricellular (E). (F-J) Gynoeceum mit Eizellen mit Megaspore Mutter Zellen (Pfeil) vor der Meiose (F und G) und während meiotischen Prophase I (H), mit einem binuclear Embryo Sac (Pfeil), (ich) und bei Befruchtung (J). Beachten Sie die Ablaufverfolgung einer Pollen-Röhre (Pfeil) in der micropylar Region der das Ovulum in J. (K-L) Modifizierte Alexander die Färbung der Staubbeutel mit voller (K) oder Pollen Lebensfähigkeit durch Hitzestress (L) reduziert. Beachten Sie die leeren Zytoplasma und unregelmäßigen Formen der abgebrochenen Pollenkörner innerhalb der Anthere Nischen in L. Arabidopsis Wildtyp Col-0 Beitritt. Löschen oder Färbung: der Herr 4½ für B-D und F-J, Herr der IKI-4½ für A und Eund Alexander Färbung für K-Lgeändert. Skalieren von Balken = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Stärke Dynamik während der Blüte und frühen seed Entwicklung. Repräsentative Ergebnisse zur Veranschaulichung des dynamischen Stärke Umsatzes während der Blütenentwicklung. (A-C) Die dritte Welle der Stärke Amylogenesis/Amylolysis in den letzten Phasen der Staubfäden Entwicklung beschrieben erst39. (D-G) Repräsentative Ergebnisse der einzigartigen Stärke Welle in das pollenkorn mit einem Spitzenwert von Amylogenesis in der bicellular Phase. (H-N) Repräsentative Ergebnisse der Stärke Dynamik in Eizellen bei der Megaspore Mutterzelle (H), bei der Entwicklung von weiblichen Gametophyten (-K) und während der frühen Saatgutentwicklung (nur nach der Befruchtung in L, zweikernige Endosperm in M , und Oktant Embryonalstadium in N). Arabidopsis Wildtyp Col-0 Beitritt. Skalieren von Balken = 20 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: einige klassische Verfahren für die Fluoreszenz-Mikroskopie und die Wirkung der SDS-Clearing Beflecken. (A) Calcofluor-Auramin Färbung während der Pollen Reifung wo die Intine blau gefärbt ist (Calcofluor) und die Exine intensiv grün (Auramin). (B-C) Mechanische Entfernung der Exine und DAPI-Färbung des Tricellular Pollenkörner. (D-H) Repräsentative Bilder des Blütenstands vor (D, wie erholt Fixativ) und nach SDS clearing (E-H). Beachten Sie die Transparenz des Gewebes, die die Beobachtung des Gefäßsystems innerhalb der Blütenstand stengel (G) und die Blütenknospe Stiel (H) ermöglicht. (-J) Anilin blauen Färbung für Kallose in Microspores Stadium der Vierheit innerhalb der Staubgefäße. Vergleichen Sie die Klarheit und die Intensität der Färbung zwischen nicht-SDS Anthere (ich) und der SDS geclearte Anthere (J) gelöscht. (K) ein SDS-gelöscht und Anilin-blau gefärbten Anthere mit Microspores während der Pollen Mitose I. Beachten Sie die Synchronität der vielen Pollenkörner zu diesem Zeitpunkt in diese zwei Nischen. (L) ein SDS-geräumt und Anilin-blau gefärbt Eizelle nach der Befruchtung. Beachten Sie Kallose Färbung in den Überresten der Pollen-Röhre und in der Samenschale. Arabidopsis Wildtyp Col-0 Beitritt. Maßstabsleiste = 20 µm (A-C-L); 1 mm (D-H). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Die Existenz von vielen Blütenknospen innerhalb einer einzigen Blütenstand der Arabidopsis, überspannt alle Blume Entwicklungsstadien, bietet eine einzigartige Gelegenheit für Studien, die darauf abzielen, einen Effekt der Behandlung oder eine Entwicklungsstörung Funktion charakterisieren gleichzeitig über die verschiedenen Phasen der Blütenentwicklung. Ein guter Bezugspunkt zwischen verschiedenen Einzelpflanzen ist die Eröffnung der ersten Blüte der wichtigsten Blütenstand. Pflanzen werden behandelt, so dass Blüte synchronisiert wird so viel wie möglich (z. B.3 – 4 Tage Schichtung bei 4 ° C maximiert die synchrone Samenkeimung und daher gleichmäßiger Blüte) und nur Pflanzen, die am selben Tag ihrer ersten Blüte öffnen genommen als Batch zwischen Behandlungen und Wiederholungen zu verteilen; Chargen bereit an aufeinander folgenden Tagen können verwendet werden, um das Experiment zu replizieren. Robuster vergleichende Analysen, controlling für Umwelt- und entwicklungspolitische Variationen innerhalb und zwischen den Pflanzen, im Anschluss an dieses Verfahren kann durchgeführt werden.

Kombination von Lugol Fleck mit Herr der Clearing-Lösung erlaubt uns nicht nur um den Kontrast in geräumten Proben im Vergleich zu klassischen Clearing-Lösungen zu verbessern, sondern auch Stärke Dynamik bei der Blume und Embryo Entwicklung zu charakterisieren, wie kürzlich berichtet, für Arabidopsis 46. mit diesem einfachen Verfahren, wir konnten die Existenz einer neuen Welle von Stärke Amylogenesis-Amylolysis während der Anthere Entwicklung zu entwirren und Stärke Dynamik korrelieren mit globalen Veränderungen in der Expression der Gene codieren Proteine beteiligt im Stoffwechsel von Zucker und Stärke. Diese Analyse ergab, dass GPT6 die Nyrianer des Zucker-Phosphat aus dem Zytosol zu Amyloplasten für stärkesynthese ist. Die detaillierten Ergebnisse auf Stärke Dynamik in verschiedenen Geweben eröffnet die Möglichkeit der Charakterisierung anderer wichtiger Gene in Stärke Stoffwechsel und ungelöste Fragen zu weniger studierten, aber wichtigen Verfahrensschritten der Pflanzenentwicklung. Jodhaltiges Stärke Färbung ist nicht quantitativ, und sollte mit anderen Methoden46ergänzt werden.

Forschung auf der Suche nach verbessert Ausgleichsvorgänge, die kompatibel mit Fluoreszenz-Mikroskopie hat in den letzten Jahren vor allem in tierischen Bereich verstärkt. Obwohl die Pflanze Forschungsfeld hinterher hinkt und weitgehend clearing auf traditionelle Clearing Lösungen für DIC Analyse (z.B.Chlorgas Hydrat-basierte Lösungen, Benzyl Benzoat, Dibutyl phthalat und Methylsalicylat setzt)31 ,33,47,48, ermutigt durch die rasante Entwicklung im Bereich tierischen einige ähnlichen Techniken entstehen mit Harnstoff - (z.B., ClearSee49 u.50), und 2, 2'-Thiodiethanol-basierte clearing-Verfahren51,52. Hier zeigen wir, dass die Verwendung der SDS Reinigungsmittel in Verbindung mit NaOH das Gewebe transparent macht und verbessert einige klassische Fluoreszenz Färbung Verfahren wie Anilin blau für Zellstress und Calcofluor für Zellulose. Basierend auf diesen viel versprechenden Ergebnissen, kann ähnliche Fortschritte bei der SDS-basierte selektive Entfernung von Lipiden im Feld Werk in naher Zukunft zu rechnen. Da Pflanzenzellen starre Zellwände haben, die abwesend sind in tierischen Zellen, die vorherige Einbettung in Hydrogele möglicherweise nicht notwendig, da bei tierischen Geweben der Fall ist. Andere fluoreszierende Farbstoffe und Fluorophore verwendet in genetischen Markerlinien könnte dieses Clearingverfahren untersucht werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von der Universität Zürich, ein IEF Marie Curie Grant (keine zu gewähren. TransEpigen-254797, A.H.), ein Advanced Grant des Europäischen Forschungsrates (keine zu gewähren. Medea-250358, UG), und ein Projekt Forschung und Technologieentwicklung (Grant MecanX, UG) von SystemsX.ch, die Schweizer Initiative in Systembiologie.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
Ethanol Scharlau ET00102500
Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Methanol Scharlau ME03062500
Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
Propionic acid Sigma-Aldrich 81910-250 ml
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 15307
Glycerol Roth 3783.1
Gum arabic Fluka 51198
Lactic acid Fluka 69773
Phenol Sigma-Aldrich 77607-250ML We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil Sigma-Aldrich C8392-100ML
Xylene Roth 4436.1
Iodine Fluka 57665
Potassium iodide Merck 5043
Malachite Green Fluka 63160
Fuchsin acid Fluka 84600
Orange G Sigma 7252
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate Applichem A1047,1000
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763-1KG
Potassium phosphate Sigma-Aldrich 04347
EDTA Applichem A2937,1000
Calcofluor Sigma F6259 Fluorescent brightener 28
Auramine Chroma 10120
DAPI Sigma D9542 toxic
Triton-X-100 Sigma T8787
Aniline blue Merck 1275
MS medium Carolina 19-57030
Nutrient-rich substrate Einheitserde ED73
Watch maker's glass No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
Forceps DUMONT BIOLOGY 0108-5
Syringe BD BD Plastipak 300013 1 ml
Preparation needle BD BD Microlance 304000
Microscope slides Thermo Scientific 10143562CE cut edges
Coverslips Thermo Scientific DV40008
Humid box A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½ To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M) Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.

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Vollständig-hängen Clearing und Färbung des <em>Arabidopsis</em> Blume Organe und Siliques
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Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).

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