Summary
En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.
Abstract
Debido a sus formidables herramientas para los estudios genéticos moleculares, thaliana de Arabidopsis es una de las especies más destacadas del modelo en biología de plantas y, especialmente, en la biología reproductiva de plantas. Sin embargo, planta anatómica, morfológica y análisis ultraestructurales implican tradicionalmente lentos incrustar y seccionamiento procedimientos para campo brillante, análisis y microscopia electrónica. Recientes avances en la microscopía de fluorescencia confocal 3D asistido por ordenador microscópicos análisis de estado de la técnica y el refinamiento continuo de técnicas moleculares para ser utilizado en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a una mayor demanda de desarrollo de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo. En este protocolo, describen técnicas para disecar correctamente flores de Arabidopsis y silicuas, claro técnicas básicas y algunos procedimientos de tinción para montaje todo observaciones de estructuras reproductivas.
Introduction
Flores están definiendo entre los más importantes órganos de las angiospermas. Plantas con flores aparecieron hace unos 90 millones años1y tan rápido que su aparición rápida fue descrito como un "misterio abominable" por Charles Darwin2. El interés de los investigadores de planta en el desarrollo de la flor son diverso. Algunas investigaciones se ha centrado en comprender el origen evolutivo de la flor como un todo, o la evolución de características anatómicas, estructurales y funcionales de flores3,4,5,6 . La alta variación en forma floral y estructura, así como los modos de reproducción sexual y asexual, confiando en ellos, hacer la flor una estructura altamente compleja. Esto ha llevado a diversos esfuerzos por caracterizar las anatomía y características estructurales de los órganos florales, técnicas de luz y electrónica microscópica que podría combinarse con la investigación genética y molecular7. Además, como fuente de frutos y semillas, las flores son de suma importancia para la nutrición humana y animal. Por lo tanto, la caracterización del desarrollo de la flor y la fruta tiene muchas implicaciones para la investigación aplicada, incluyendo la seguridad alimentaria de una población humana creciente y las estrategias de conservación ecológica en un cambiante ambiente8 , 9 , 10.
Desarrollo de la flor en Arabidopsis comienza con la inducción floral y la transformación de lo meristemo vegetativo a un meristemo de la inflorescencia (grupo de flores). Primordios de flores se inician lateralmente en el flanco de la inflorescencia meristem11. Los primordios de órganos florales forman progresivamente en verticilos concéntricos desde el exterior al centro de la flor y eventualmente convierten en sépalos, pétalos, estambres y carpelos7. Estos órganos florales cumplen protección nutritiva, distinta y funcional (por ejemplo, atracción de polinizadores) papeles en diferentes especies de plantas, con los órganos sexuales, sostener el desarrollo de los gametofitos masculinos y femeninos, respectivamente12 , 13. los gametofitos, a su vez, cada uno distinguen un par de hombre (espermatozoides) y los gametos femeninos (óvulo y célula central), que se unen con doble fertilización para formar la próxima generación, el zigoto y el endosperma primario, un soporte de tejido terminal la desarrollo del embrión14,15. Apoyo al desarrollo de frutos y semillas el crecimiento, maduración y conservación del embrión y, eventualmente, su dispersión. Se ha realizado una amplia investigación para caracterizar el desarrollo flor y embriones de diversas especies, especialmente en la especie modelo Arabidopsis7,16,17.
Primeros análisis microscópicos del desarrollo de la flor se basaron en la observación técnicas tal como parafina o incrustación de resina y seccionamiento, combinación con la luz o la microscopía electrónica y procesamiento de las muestras requiere mucho tiempo. Estas técnicas microscópicas tradicionales fueron utilizadas a menudo en combinación con las investigaciones genéticas moleculares, como el análisis microscópicos de mutantes, la localización del ARN mediante hibridación en situ o la inmuno detección de proteínas. Recientes avances en microscopía de fluorescencia confocal y de amplio campo, en análisis de imagen asistido por ordenador 3D de estado de la técnica y el refinamiento continuo de los métodos moleculares que pueden utilizarse en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a la necesidad de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo que son preferentemente susceptibles de análisis cuantitativos. En los últimos años ha realizado progresos significativos en el desarrollo de técnicas claro espécimen animal montaje en conjunto. Procesar la muestra transparente mediante reactivos de urea o azúcar-base acuosa (p. ej., escala, SeeDB, cúbico)18,19,20, o eliminando selectivamente lípidos (usando el detergente SDS) después de inclusión de muestras en hidrogeles estables; la eliminación de lípidos puede lograr ya sea por difusión pasiva (p. ej., modificado claridad protocolo21, pacto-PARS-llantas22) o activamente por electroforesis (original claridad protocolo23 y24de la ley-PRESTO). Alentado por este progreso rápido, algunas técnicas derivadas también están surgiendo para su uso en las plantas.
En este trabajo métodos centrado en el modelo de Arabidopsis, describimos el procedimiento para la adecuada disección de capullos, flores y jóvenes silicuas y claro de todo Monte muestras para coloración diversa y procedimientos de observación mediante clásico o un método reciente de compensación basada en la SDS. Se dan ejemplos para almidón, Callosa y la coloración de la cromatina. Aunque estos procedimientos pueden necesitar más mejoras y adaptaciones cuando se utiliza con otras especies, esperamos se fijaron la etapa para la investigación adicional sobre estos métodos simples pero fundamentales que son el punto de partida de muchos proyectos de investigación.
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Protocol
1. flor y fijación de silicua
- Flores de la cosecha y silicuas de plantas sincronizan en la inauguración de la primera flor.
Nota: Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí, plantas Inicio floración aproximadamente 21 días después del trasplante de las placas de Murashige y Skoog (MS) al suelo. Semillas estratificadas durante 3 – 4 días a 4 ° C y germinado/cultivadas en placas de MS de 22 ° C/16 h luz y 18 ° C/8 h oscurezca durante 8 a 10 días, antes de transplantar las plántulas en suelo rico en nutrientes en macetas bajo las mismas condiciones (figura 1). El número de repeticiones depende del objetivo específico de investigación, pero se recomienda un mínimo de 5 inflorescencias (a partir de 5 plantas individuales) para cada tratamiento. Si las flores son la unidad experimental, se recomienda un mínimo de 10 flores por repetición. - Cortar las inflorescencias o flores (Figura 1E-H) con unas tijeras pequeñas (por ejemplo, tijeras) y colóquelos inmediatamente en un tubo de microcentrífuga (para fijación de flor inflorescencia única) o en un tubo cónico (para fijaciones colectivas) que contiene recién hecho de Carnoy metanol/ácido acético y fijadores FPA50 (dependiendo de la aplicación, vea abajo) en el hielo.
Nota: Las muestras deben estar completamente sumergidas en el fijador. - Dejar el tejido en el fijador durante 4 horas hasta toda la noche a 4 ° C.
Nota: Infiltración de vacío puede utilizarse para acelerar la penetración del fijador en el tejido, pero esto puede ser perjudicial a la preservación de la estructura del tejido. Los autores no implementan infiltración vacío. - Retirar el fijador, agregar suficiente etanol 70% para cubrir las muestras y volver a 4 ° C durante al menos 24 h; las muestras pueden permanecer indefinidamente en esta solución. Después de extraer el etanol, proceder de inmediato al siguiente paso; disección, o claro de SDS.
2. disección bajo el estereomicroscopio
- Puesto recién hecho etanol al 70% en vidrio de relojero a una placa Petri pequeña de apoyo.
-
La inflorescencia, flor/silicua en este recién hechas fijador y disecar bajo el estereomicroscopio con fórceps y una jeringa con una aguja.
- Use vidrio o dispositivo similar que permite que las muestras de estar totalmente cubierto con etanol (recomendado) para la disección de las inflorescencias y desgarrando órganos florales de las flores maduras (sépalos, pétalos y estambres puede ser diseccionado en esta etapa un relojero ) para evitar el riesgo de secar muestras.
-
Diseccionar silicuas y pequeños capullos en una diapositiva como se describe a continuación.
- Dejar a un lado vidrio de relojero con muestras previamente procesadas y utilice una diapositiva normal para la disección final.
- La muestra de interés hacia la diapositiva y agregar 10 μl de etanol al 70% fresco. Trabajar con rapidez en la disección final y añadir 10 μl de etanol, si es necesario, para mantener la muestra húmeda sin el líquido excesivo.
- Para soltar los granos de polen de los estambres, consulte el paso 5.1. Para la disección de los carpelos y los óvulos, siga el procedimiento descrito en la figura 2. Este procedimiento se aplica a todas las etapas de desarrollo del carpelo, incluyendo la etapa de desarrollo de silicuas verdes.
Nota: No agregue etanol si hay suficiente remanente de etanol de mover las muestras; disección de muestras muy pequeñas es mucho más fácil en una cantidad mínima de líquido. Mantenga sólo los órganos de interés (sépalos, pétalos, estambres, carpelos, óvulos, semillas o granos de polen) en la diapositiva. Este procedimiento asegurará un espesor uniforme entre el portaobjetos y cubreobjetos, correspondiente al espesor del órgano objeto de examen, resultando en una mayor homogeneidad y así eficacia para exámenes microscópicos (mayor número de ejemplares de blanco en el mismo plano focal).
- Use un pequeño trozo de papel secante para absorber y eliminar tanto etanol como sea posible. Proceder rápidamente al siguiente paso (sección 3, 4 o 6) antes de la muestra se seca a cabo.
3. a base de hidrato de cloral claro y tinción combinada de claro
Nota: Se obtienen mejores resultados de limpieza base de hidrato de cloral con FPA50 fijada material.
- Lugar 20 μl de solución de limpieza (hidrato de cloral/glicerol, modificado medio de Hoyer, 4½ de Herr o soluciones de IKI-4½ de Herr) en la diapositiva del rodamiento de la muestra. Con un par de jeringas con agujas hypodermal, coloque los especímenes reduciendo el espacio entre ellos, y los bancos donde el órgano de interés se enfrenta hacia abajo. Eliminar cualquier burbuja de aire restante usando la aguja.
- Bajar lateralmente un cubreobjetos y colocarlo, presionando muy suavemente suavemente y espere hasta que la solución claro llena el espacio entre. Añadir solución de compensación mínima, si es necesario, para llenar todo el espacio bajo el cubreobjetos.
- Coloque el portaobjetos sobre un soporte deslizante y dejarlo bajo la campana. Proceder a observaciones microscópicas después de al menos 4 h y durante los siguientes días 4 – 5.
4. combinado Alexander tinción y claro 4½ de Herr de anteras
Nota: El protocolo original de Alexander se basa en la liberación de los granos de polen en la diapositiva antes de la tinción. Un eficiente y más informativo, modificado Alexander coloración y procedimiento de despejo son la tinción de granos de polen maduros dentro de las anteras maduras pero no dehiscente.
- Elegir capullos recién cosechados que se van a abrir con anteras no dehiscente.
Nota: No tome más jóvenes capullos porque Alexander manchas está diseñado para los granos de polen maduros y no mancha eficientemente los granos de polen inmaduros. Se recomienda un mínimo de 5 flores por tratamiento de inflorescencias y diversas plantas. - Preparar una placa de 96 pocillos con solución de suficiente Alexander sumergir un brote de flor. Exponer las anteras quitando los sépalos y pétalos y sumergirlos en solución de Alexander. Mantener las muestras bajo la campana para 1-3 h.
- Reemplazar la solución de Alejandro con la solución 4½ de Herr y coloque la placa multi-bien debajo de la campana para una incubación durante la noche.
- Con unas pinzas, mueva suavemente los botones florales despejados hacia una nueva diapositiva. Puesto que puede ocurrir algún remanente de la solución de Alejandro, utilice un papel secante para quitar tanta solución claro como sea posible.
- Diseccionar los estambres y quitar todos los otros tejidos. Siga los pasos en la sección 3 con solución 4½ de Herr.
5. eliminación de la exina de los granos de polen
Nota: Recomendamos usar fijador de Carnoy para tinción DAPI.
- Siga los procedimientos de disección y fijación que se describe en las secciones 1 y 2. Por ahora, uno debe tener de uno a muchos estambres en la diapositiva dentro de una mínima cantidad de etanol al 70%.
- Utilice un papel secante para quitar exceso etanol y añadir 5-10 μl de la solución DAPI. Utilizando un par de jeringas con agujas, liberar los granos de polen dentro de esa pequeña cantidad de solución (por ejemplo, uso una jeringa para inmovilizar el estambre y el otro para liberar los granos de polen). Si la solución se seca, agregue otro 5 μl de DAPI.
- Quitar toda la suciedad del estambre es un paso crítico, que sólo los granos de polen quedan entre el portaobjetos y el cubreobjetos.
- Coloque un cubreobjetos sobre la diapositiva del rodamiento de la muestra bajando hacia los lados y añadir la mínima cantidad de solución DAPI que llenan el espacio. Coloque el dedo índice sobre el cubreobjetos, y sin aplastamiento muy mucho hacer un rápido y firme y corto movimiento de deslizamiento.
Nota: Para medir la fuerza necesaria y la amplitud del movimiento deslizante, este paso debe realizarse varias veces, comprobar los resultados cada vez que bajo el microscopio. - Agregar solución DAPI si es necesario y mejorar el portaobjetos en una caja húmeda en la oscuridad a 4 ° C por 15 min a 1 h. proceder a observar las muestras con fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal en 24 h. tratar de combinar este procedimiento con el SDS claro para comprobar si otro lugar momentos pueden obtenerse.
6. sodio dodecil sulfato (SDS) de claro
Nota: Según el órgano floral a analizar y habilidades del investigador para disecar los especímenes muy suaves y pequeño, el tratamiento de SDS puede realizarse ya sea antes (para investigadores experimentados) o después de la disección paso (por menos los investigadores) en ácido acético en metanol fijada material.
- Usar vidrio de relojero, un portaobjetos cóncavo o un tubo de microcentrífuga para incubar muestras disecadas o no disecado en 0.2 N NaOH solución durante la noche a temperatura ambiente y 1% SDS.
- Manejar con cuidado porque la muestra es muy suave y tiene un aspecto transparente. Enjuague varias veces con agua.
Nota: Remanente de la solución de SDS podrían conducir a la precipitación al añadir la solución de tinción, por ejemplo, azul de anilina. - Para muestras no disecados, siga el procedimiento de disección que se describe en la sección 2, utilizar agua en lugar de etanol al 70%. Después de disecar el tejido deseado, retire cualquier restos y residuos y cualquier exceso de agua con un papel secante, luego añadir 20-40 μl de solución de tinción y continúe con el paso 6.5.
- Para las muestras disecadas, cuidadosamente mover la muestra de la solución de lavado y colóquela en un portaobjetos limpio y añadir 20-40 μl de solución de tinción.
- Coloque suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos bajando hacia los lados. Tenga cuidado de no para aplastar la preparación. Si el tejido es muy suave, lugar cualquiera delgada separador entre el portaobjetos y el cubreobjetos en sus esquinas(por ejemplo, cinta o un cubreobjetos roto), dejando un espacio de cámara como entre portaobjetos y cubreobjetos, tal que el cubreobjetos no triturar a la muestra.
- Coloque todas las diapositivas dentro de una caja húmeda, cubrir con papel de aluminio y coloque en 4 ° C durante por lo menos 1 h. proceder a observar a la muestra con fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal en 24 h.
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Representative Results
Arabidopsis pertenece a la familia Brassicacea, teniendo las inflorescencias con flores bisexuales dispuestas en un corimbo (figura 1). Cada flor tiene 4 sépalos, cuatro pétalos, seis estambres (cuatro largos y dos cortos) y un Gineceo sincárpico de dos congénitamente carpelos (Figura 1F-H) dispuestos en cuatro verticilos concéntricos25,26. Arabidopsis tiene tenuinucellate, óvulos anatropous dispuestas en placentación parietal en dos filas (12-20 óvulos en cada fila) dentro de cada uno de los dos lóculos del ovario (un total de 45 – 80 óvulos) (datos no publicados y referencias27, 28 , 29 , 30). para llevar a cabo análisis comparativos robustos de flor y embrión de desarrollo dentro de una planta individual o entre diferentes plantas (como repeticiones o tratamientos), es recomendable utilizar la primera flor abierta como referencia (figura 1B). en esta etapa, la inflorescencia (Figura 1E) generalmente tiene entre 20 y 30 capullos que abarca todas las etapas del desarrollo de la flor y en etapas más o menos similares en otros individuos (datos no publicados). Más meristemos de flor (formando entre 5 y 20 flores), serán iniciados por el meristemo de la inflorescencia después de la primera flor. Las dos primeras flores pueden mostrar defectos de fertilidad y, por lo tanto, no deben incluirse en el análisis.
Flores de Arabidopsis y órganos florales con base de hidrato de cloral claro claro soluciones31,32, incluyendo 4½ de Herr claro solución33, es comúnmente ejecutado por (de contraste de interferencia diferencial Análisis microscópicos de DIC) del desarrollo de la flor, silicua y embrión (Figura 3A-J). La solución 4½ se recomienda específicamente para analizar desarrollo de estambre y de los órganos que requieren una mayor capacidad de compensación. Algunas soluciones de hidrato de cloral se utilizan para el doble propósito de claro y manchas simultáneamente. Este es el caso34 de Alejandro original y IKI 4½35,36 soluciones de Herr. Alexander la coloración es ampliamente utilizado en Arabidopsis para evaluar aborto del polen. Un Alexander más informativo y modificado tinción procedimiento37 es manchar todo anteras que contienen los granos de polen maduros. Este procedimiento requiere una limpieza posterior de las anteras con solución 4½ de Herr (figura 3 K-L). Otras técnicas de tinción utilizadas en diferentes especies de plantas podrían proporcionar una mejor estimación de la viabilidad del polen (por ejemplo, la reacción fluorochromatic con Diacetato de fluoresceína, tinción de Callosa, almidón, ADN y ARN y pruebas enzimáticas mediante tintes de redox)38,39,40. Sin embargo, la mayoría de estas técnicas evaluar un aspecto concreto de los granos de polen que podría no necesariamente correlacionan con viabilidad de polen y, importantemente, la fertilidad del polen. Una evaluación de la capacidad de germinación de polen y su capacidad para efecto de la fertilización y las semillas podrían ser más preciso38–40. Un procedimiento de coloración de claro mucho menos usado es IKI-4½ de Herr, que combina las soluciones de limpieza y manchas de almidón. Además de la coloración para el almidón (figura 4), este procedimiento puede utilizarse para propósitos de limpieza general cada vez mayor contraste es necesaria (por ejemplo, Figura 3A, E).
Se utiliza una combinación de auramina y calcoflúor en muchos planta especie41 simultáneamente manchar la exina de polen y la intina (figura 5A). La mayoría de estos y otros tintes químicos no manchan un componente celular y, por lo tanto, deben utilizarse en combinación con técnicas de etiquetado más directas como GUS líneas marcador fluorescente etiquetado, anticuerpos o hibridación in situ . También pueden mostrar múltiples espectros de emisión y excitación. DAPI, en cambio, es más específico y generalmente se usa para teñir cromosomas y cromatina diferenciales42 durante la meiosis y para seguir polen desarrollo43, aparte de sus múltiples aplicaciones como un contraste para el núcleo. A continuación, os mostramos cómo puede aumentarse la intensidad de la tinción para obtener una vista más detallada de la cromatina de los espermatozoides y los núcleos vegetativos retirando mecánicamente la exina (figura 5B-C). Aunque esta técnica es muy útil para los interesados en la realización de análisis detallados de la estructura nuclear, cromatina y cromosomas, la remoción mecánica del exine podría afectar la organización del grano de polen, que resultados deben ser interpretado con cuidado.
La mayoría de estos tintes fluorescentes se utiliza sin previa limpieza de los tejidos; pero en algunos casos, son compatibles con un posterior borrado en la diapositiva44a base de hidrato de cloral. Recientemente se ha utilizado como compensación de reactivo en la investigación animal y vegetal y se ha demostrado para ser compatible con diferentes procedimientos de tinción de campo amplio de la fluorescencia y microscopía confocal (mPS-PI45 plantas y claridad23, SDS claro Pacto22 o acto PRESTO24 en animales). Usando un SDS-NaOH claro antes de anilina azul tinción (figura 5-H), hemos conseguido lograr mayor accesibilidad a los tejidos internos, así como una mejor coloración de Callosa en tejidos florales (figura 5I-L). Resultados similares fueron obtenidos para calcoflúor (datos no mostrados).
Figura 1: Fotografías de flores y plantas de Arabidopsis . (A, D) Las plantas de Arabidopsis en diferentes etapas del ciclo vital: roseta antes pernos (A), en la primera apertura de la flor (B), con primaria y algunas secundarias inflorescencias (C) y al final de la floración (D). (E) la típica forma de corimbo de un Arabidopsis inflorescencia con flores en diferentes etapas de desarrollo, maduración acropetally. (F-H) Una flor de Arabidopsis en antesis, ilustrando la autopolinización (estambre tocar el estigma y la liberación de los granos de polen). Figuras E-H son pilas foco de 36, 53, 42 y 32 cuadros, respectivamente, montados con una herramienta de software (por ejemplo, Helicon Focus). F-H representan la misma flor donde se retiraron un sépalo, dos pétalos y un estambre corto en H. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Cómo diseccionar un Gineceo y óvulos. (1-3) lugar el Gineceo en un portaobjetos con una mínima cantidad de etanol al 70% y la posición de las manos como se muestra en el dibujo. Hacer cortes de 1-3 siguiendo las direcciones indicadas por las flechas rojas. Utilice la aguja con la abertura hacia arriba y lejos de los óvulos para cortes 2-3. (4-6) gire el carpelo 180 grados como se muestra y haga cortes 4-6 como los tres primeros cortes. (7) quitando las válvulas: utilizar la aguja con la abertura hacia abajo, coloque debajo de los óvulos y deslice la aguja rápidamente a la derecha en el margen de la válvula. Para mayor carpelos (antesis y hacia adelante), o con algunos conocimientos de disección, se puede sustituir este paso repitiendo los pasos 2 y 5 en el otro lado del carpelo. (8-9) Quite el estigma-estilo y el pedúnculo con agudo corta usando la aguja con su apertura hacia los lados y de los óvulos. (10) hacer un agudo pequeño corte en el tejido de transmisión nivel en uno de los dos extremos. (11) utilizar las pinzas y la aguja para desgarrar las dos mitades. (12) utilizando las pinzas y la aguja, girar suavemente una fila de óvulos para obtener dos filas paralelas. Alternativamente, coloque dos filas verticalmente con replum miente arriba y presione suavemente hacia abajo a lo largo del replum difundir las dos hileras de óvulos en cada lado. Dos aplanado pero aún Unidos hileras de óvulos después de despejar y tinción con solución de IKI-4½ de Herr se muestran como un ejemplo del resultado de la disección. Barras de escala = 80 μm haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: compensación base de hidrato de cloral con o sin tinción durante el desarrollo de la flor. (A) A joven floral. (B-E) Desarrollo de estambre con madre de microsporas células en citocinesis (B), tétradas de microsporas (C), mitosis de polen granos de polen que (D) y tricellular (E). (F-J) Gineceo que contiene los óvulos con células de madre de la megáspora (flecha) antes de la meiosis (F y G) y durante la profase meiótica I (H), con un dinuclear embrión saco (flecha) () y en la fertilización (J). Tenga en cuenta la huella de un tubo polínico (flecha) dentro de la región micropilar del óvulo en la J. (K-L) Modificado Alexander de la coloración de las anteras con completo (K) o reducción de viabilidad de polen debido a estrés por calor (L). Observe el citoplasma vacío y formas irregulares de los granos de polen abortados en los lóculos de la antera en Arabidopsis L. adhesión de Col-0 de tipo salvaje. Borrar o coloración: 4½ de Herr , B, D y F J, Herr de IKI-4½ para A y Ey modificado de Alexander para K L. Barras de la escala = 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: dinámica de almidón flor y temprano desarrollo de la semilla. Resultados representativos que ilustran la rotación dinámica del almidón durante el desarrollo de la flor. (A-C) La tercera ola de almidón amylogenesis/amylolysis durante las últimas etapas de desarrollo de estambre como recientemente descrito39. (D G) Resultados representativos de la onda única de almidón en el grano de polen con un pico de amylogenesis en la etapa bicellular. (H-N) Resultados representativos de la dinámica de almidón en óvulos en la etapa de la célula de madre de la megáspora (H), en el desarrollo de gametofitos femeninos (-K) y durante el desarrollo temprano de la semilla (justo después de la fertilización en L, endospermo binucleate en M y de la etapa de embrión octante en N). Adhesión de Col-0 de tipo salvaje de Arabidopsis. Barras de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: algunos clásicos procedimientos para microscopía de fluorescencia y el efecto de la remoción de SDS de tinción. (A) calcoflúor-auramina tinción durante la maduración del polen donde el intine se tiñe azul (calcofluor) y el exine intensamente verde (auramina). (B-C) Remoción mecánica de la exina y la coloración de DAPI de granos de polen tricellular. (D H) Cuadros representativos de una inflorescencia antes (D, como recuperado de fijador) y después de SDS claro (E H). Tenga en cuenta la transparencia del tejido que permite la observación de la vasculatura dentro del tallo de la inflorescencia (G) y el pedúnculo floral (H). (-J) Anilina azul coloración para Callosa de microsporas en la etapa de la tétrada en estambre. Compare la claridad y la intensidad de la coloración entre el no-SDS despejó antera () y la antera SDS-despejado (J). (K) un SDS-despejado y anilina azul antera manchada con microsporas durante polen mitosis I. tenga en cuenta la sincronía de muchos granos de polen en esta etapa de estos dos lóculos. (L) un SDS-despejado y anilina azul manchada óvulo después de la fertilización. Nota Callosa la coloración en los restos del tubo polínico y en la capa de semilla. Adhesión de Col-0 de tipo salvaje de Arabidopsis . Barra de escala = 20 μm (A-C-L); 1 mm (D-H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La existencia de muchos brotes de flor en una inflorescencia simple de Arabidopsis, que abarca todas las etapas del desarrollo flor, ofrece una oportunidad única para estudios tendientes a caracterizar un efecto de un tratamiento o una característica del desarrollo al mismo tiempo a través de las diferentes etapas de desarrollo de la flor. Un punto de referencia entre diferentes plantas individuales es la apertura de la primera flor de la inflorescencia principal. Las plantas son tratadas de tal manera que se sincroniza la floración tanto como sea posible (e.g., 3 a 4 días de germinación sincrónica y por lo tanto más uniforme floración maximiza la estratificación a 4 º C) y solamente las plantas que abren su primera flor en el mismo día son tomado como un lote para distribuir entre los tratamientos y repeticiones; listo en días sucesivos lotes pueden utilizarse para replicar el experimento. Siguiendo este procedimiento, Analisis comparativo más robustos, control de las variaciones ambientales y de desarrollo dentro y entre plantas, se puede realizar.
Con tinción de Lugol solución de clearing de Herr nos permitida no sólo mejora el contraste en muestras limpia en comparación con soluciones de limpieza clásica, sino también para caracterizar la dinámica de almidón durante el desarrollo de la flor y el embrión, como recientemente reportado para Arabidopsis 46. usar este simple procedimiento, fueron capaces de desentrañar la existencia de una nueva ola de almidón amylogenesis-amylolysis durante el desarrollo de la antera y dinámica de almidón se correlacionan con cambios globales en la expresión de genes de codificación de proteínas implicada en el metabolismo del azúcar y el almidón. Este análisis mostró que el GPT6 es el translocador de fosfato de azúcar desde el citosol a amyloplasts para síntesis de almidón. Los resultados detallados en la dinámica de almidón en varios tejidos se abre la posibilidad de caracterizar otros genes importantes en el metabolismo de almidón y para abordar cuestiones no resueltas relativas a menos estudiadas pero importantes etapas de desarrollo de la planta. Base de yodo almidón coloración no es cuantitativa y debe ser complementada con otros métodos46.
Investigación en busca de mejora claro procedimientos compatibles con microscopía de fluorescencia se ha intensificado en los últimos años, especialmente en el campo animal. Aunque el campo de investigación de la planta se está demorando, y claro en gran parte se basa en soluciones tradicionales claro para el análisis de CID (p. ej., soluciones de hidrato de cloral, benzoato de bencilo, ftalato de dibutilo y salicilato de metilo)31 ,33,47,48, alentado por los progresos rápidos en el campo animal, algunas técnicas similares están surgiendo usando urea - (p. ej., ClearSee49 y otros50), y 2, 2'-thiodiethanol-based claro procedimientos51,52. Aquí, demostramos que el uso del detergente SDS en combinación con NaOH hace que el tejido transparente y mejora de algunos procedimientos, como la anilina azul para Callosa y calcoflúor para celulosa de tinción la fluorescencia clásica. Basado en estos resultados prometedores, avances similares en la eliminación selectiva de lípidos en base la SDS se pueden esperar en el campo de la planta en un futuro cercano. Puesto que las células vegetales tienen las paredes celulares rígidas que están ausentes en las células animales, la previa inclusión en hidrogeles podría no ser necesaria, como es el caso de tejidos animales. Otros tintes fluorescentes y fluoróforos utilizados en líneas de marcador genético podrían ensayarse mediante este procedimiento de compensación.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por la Universidad de Zurich, un IEF Marie Curie Grant (grant no. TransEpigen-254797 a A.H.), una beca avanzada del Consejo Europeo de investigación (no de la concesión. Medea-250358 a U.G.) y un proyecto de investigación y desarrollo tecnológico (grant MecanX a U.G.) de SystemsX.ch, la iniciativa Suiza en biología de sistemas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
References
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