Summary
Comet analysen er en effektiv måte å oppdage DNA skade inkludert single og double-strandet DNA bryter. Vi beskriver alkaliske og nøytrale comet analyser for å måle DNA skade i kreftcellene evaluere den terapeutiske effekten av kjemoterapi.
Abstract
DNA skade er et vanlig fenomen for hver celle i løpet av sin levetid, og er definert som endring den kjemiske strukturen til genomisk DNA. Kreft behandlinger, som radio- og kjemoterapi, introdusere enorm ytterligere DNA skade, fører til celle syklus arrestasjon og apoptose begrense kreft progresjon. Kvantitativ vurdering av DNA skade under eksperimentelle kreft terapi er et viktig skritt å rettferdiggjøre effektiviteten av en gentoksisk agent. I denne studien vi fokusere på en enkelt celle geleelektroforese analysen, også kjent som kometen analysen, som kan kvantifisere enkelt og dobbel-strand DNA bryter i vitro. Comet analysen er en DNA skade kvantifisering metode som er effektiv og enkel å utføre, og har lav tid/budsjett krav og høy reproduserbarhet. Her markere vi nytten av kometen analysen for en prekliniske studie ved å evaluere gentoksisk effekten av olaparib/temozolomide Kombinasjonsbehandling U251 glioma celler.
Introduction
Comet analysen ble først utviklet av Ostling og Johanson i 1984 ved å demonstrere migrering av DNA fragmenter fra atomkjerner under en nøytral betingelse1. Teknikken ble senere utviklet av Singh et al., viser at en alkalisk tilstand vesentlig økt spesifisitet og reproduserbarhet analysen2. Siden da nøytral comet analysen brukes hovedsakelig til å oppdage double-strandet DNA pauser, mens alkaliske comet analysen er mer følsomme for mindre mengde DNA-skader, inkludert single og double strand DNA bryter, lut-labil nettsteder, DNA-DNA eller DNA-protein cross-linking og DNA single-strand bryter forbundet med ufullstendig excision reparere nettsteder3,4. Begge analyser tillate visualisering av fragmentert DNA, og gir en enkel måte å evaluere kvantitativt DNA skade. Comet analysen regnes som sensitive metode for i vitro og i vivo genetiske toksikologiske undersøkelser og gjelder for ulike forskningsfelt, som tidlig narkotika-kandidat valg, miljøovervåking, menneskelige biomonitoring, og grunnleggende forskning i DNA skade og reparere5.
Prinsippet om analysen er at under et elektrisk felt, fragmenterte DNA overfører ut av nucleoid kroppen (også kjent som "comet-hodet") og danner en DNA flekk i agarose gel (også kjent som "comet-hale"). Med nukleotid flekker, kan omfanget av DNA skade kvantifiseres ved å analysere "comets" dannet av dette enkelt celle geleelektroforese. Beregning av halen kan videre hjelpe sammenligne DNA skade annerledes eksperimentell grupper. Sammenlignet med tradisjonelle metoder for DNA skade gjenkjenning, er comet analysen direkte, følsom, billig og relativt enkle.
Strålebehandling og chemotherapies er vanlige strategier for kreftbehandling ved å generere enkelt tråd og dobbel tråd DNA bryter i kromosomene6. Det nylige fremskrittet i DNA reparasjon hemmere gjør en mer effektiv gentoksisk effekten av kombinasjonen kjemoterapi, og derfor reduserer potensielt systemisk bivirkninger som anemi, infeksjoner og benmarg undertrykkelse7, 8. i denne studien vi viste etterforskningen av en poly (ADP-ribose) utvalg (PARP) hemmer, olaparib (Ola)9. PARP er en rikelig kjernefysiske protein og er ansvarlig for DNA base excision reparasjon ved å danne en poly (ADP-ribose) polymer10. Temozolomide () er en muntlig tilgjengelig alkylating agent og har vært mye brukt for glioma pasient behandling. Ved hjelp av kometen analysen kvantifisere DNA skade, viser vi som kombinerer olaparib med temozolomide dypt øker DNA skade i glioma celler, noe som tyder på olaparib/temozolomide Kombinasjonsbehandling er en effektiv strategi å behandle glioma, som sammenlignet med temozolomide alene11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. klargjør reagenser
- 1 x PBS
- fortynne 100 mL 10 x PBS med 900 mL dH 2 O og justere pH 7,4 bruker en pH-meter. Butikken ved romtemperatur.
- Lysis løsning (LS)
- forberede 2,5 M NaCl, 100 mM disodium EDTA, 10 mM Tris base og 200 mM NaOH i 900 mL dH 2 O, tar det vanligvis ca 20 min å tillate blandingen til å fullstendig løse opp. Justere pH 10 med en pH-meter. Legge til 1% natrium lauryl sarcosinate og 1% Triton X-100, og Juster det endelige volumet til 1000 mL. Kult å 4 ° C i minst 30 min før bruk.
- Alkalisk geleelektroforese løsning (AES), pH > 13
- forberede 200 mM NaOH og 1 mM disodium EDTA i 800 mL dH 2 O. justere pH og kontroller at det er pH > 13. Juster det endelige volumet til 1000 mL. Lage fersk før bruk og tøffe 4 ° c i minst 30 min før bruk.
- Nøytrale geleelektroforese sollution (ne)
- forberede 1000 mL nøytrale geleelektroforese buffer ved å blande 100 mM Tris base og 300 mM natrium acetate 1000 mL dH 2 O. justere pH å 9.0 med iseddik. Kult å 4 ° C i minst 30 min før bruk.
- DNA nedbør løsning (DPS)
- utarbeidelse av 10 mL 7,5 meter ammonium acetate lager. 50 mL av DNA nedbør løsning, blande 6,7 mL 7,5 meter ammonium acetate med 43.3 mL 95% etanol. Butikken ved romtemperatur.
- Beising løsning
- legge 1 µL 10 000 x grønne fluorescerende nukleinsyre flekker (f.eks SYBR Green) i 30 mL Tris-EDTA buffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM disodium EDTA, pH 7.4) og store 4 ° C. beskytte fra lys.
- 1% lavt Smeltepunkt agarose
- smelte 1% lavt Smeltepunkt poeng agarose (1 g i 100 mL dH 2 O) i en mikrobølgeovn. Swirl på agarose hver 15-20-s for å sikre at agarose er helt smeltet. Plasser agarose i 37 ° C vannbad for minst 20 min. før bruk.
- Pre varme pipette-spisser
- avskåret smale endene av P200 pipette-spisser av 3 og varm på 37 ° C før pipettering agarose.
2. Forberede Comet lysbilder
- Skyv belegg
- smelte 1% agarose (1 g i 100 mL dH 2 O) i en mikrobølgeovn i 2-3 minutter eller til agarose er helt smeltet. Dypp glass objektglass i agarose og tørk ene lysbildet med en lofri tørke.
- Lå lysbilder på flate air-dry eller varme ved 50 ° C for raskere tørking, bør det dannes en gjennomsiktig agarose film etter tørking. Plasser belagt lysbildene i 37 ° C før bruk.
- Utarbeidelse av enkeltcelle suspensjoner
- kultur og behandle glioma cellen
- kultur U251 MG cellene i DMEM-skinke F-12 medium med 10% FBS, 100 U/mL penicillin og 10 µg/mL streptomycin på 37 & # 176; C med 5% CO 2.
- Fordøye cellene med 1 mL trypsin for 3 min, og nøytralisere trypsin ved hjelp av DMEM-skinke F-12 medium med FBS. Samle i 15 mL tube, spinne på 300 x g for 4 min Sug opp mediet og suspendere cellene på 2 x 10 5 cellen/mL i 1 x PBS.
Merk: Cellen prøven bør være forberedt umiddelbart før analysen og alle prøvene skal håndteres i et mørkt eller nedtonet å hindre DNA skade fra lys. - Kombinerer celle suspensjon med 1% smeltet lavt Smeltepunkt agarose (på 37 ° C) i forholdet 1:10 (v/v), bland forsiktig av pipettering opp og ned og umiddelbart Pipetter 30 µL på et lysbilde. Bruker siden av den pipette spissen å spre agarose/cell blandingen for å sikre dannelsen av et tynt lag.
- Sted lysbildet flat på 4 ° C i mørket for 10 min. økende gelling tiden til 30 min forbedrer av prøvene i høy luftfuktigheten.
- Fordype lysbildet i 4 ° C LS i mørket 1t overnight.
- kultur og behandle glioma cellen
3. Enkelt celle geleelektroforese
- Fortsett å alkalisk (trinn 3.2) eller nøytral (trinn 3.3) comet analysen
- For alkaliske comet analysen
- forsiktig fjerne lysbilder fra LS avløp overskytende buffer og forsiktig oppsluke AES 1t på 4 ° C at DNA avkobling. Holde lysbildene i mørket.
- Legg til pre kjølt AES i geleelektroforese lysbilde skuffen, overskrider ikke 0,5 cm over lysbildene (dette avhenger av størrelsen på geleelektroforese enheter), plassere lysbilder inne og dekk med en cap. Angir nettspenningen 1 V/cm (lengden mellom elektrodene) og kjører i 30 min på 4 ° C.
- Avløp overskytende geleelektroforese løsning fra lysbilde. Forsiktig fordype lysbilder to ganger i dH 2 O for 5 min hver ved romtemperatur.
- Fordype forsiktig lysbilder i 70% etanol i 5 minutter ved romtemperatur. Videre til trinn 4.
- For nøytral comet analysen
- forsiktig fjerne lysbildene fra LS avløp overskytende buffer og forsiktig fordype i NES i 30 min på 4 ° C. holde lysbildet i mørket.
- Legg til pre kjølt nøytrale geleelektroforese buffer i geleelektroforese lysbilde skuffen, overskrider ikke 0,5 cm over lysbilder (dette avhenger av størrelsen på geleelektroforese enheter), plassere lysbilder inne og dekk med en cap. Angir nettspenningen 1 V/cm (lengden mellom elektrodene) og kjører for 45 min 4 ° C.
- Avløp overskytende buffer fra lysbilder. Forsiktig fordype lysbilder i DPS i 30 min ved romtemperatur.
- Forsiktig fordype lysbildene i 70% etanol i 30 min ved romtemperatur. Videre til trinn 4.
4. Stain Comet lysbilder
- tørr lysbilder på 37 ° C i 10-15 min i mørket.
- Sted 50-100 µL grønne fluorescerende nukleinsyre flekker løsning på hver tørket agarose og flekk i 15 min ved romtemperatur i mørket.
- Skyll lysbildene kort i dH 2 O og tørke helt på 37 ° C i mørket. Image vinningen og analyse.
5. Image oppkjøpet og analyse
Merk: visualisering og kvantifisering av DNA bryter er basert på epifluorescence mikroskopi og komet analysen programvare (se Tabell for materiale) 12 .
- Sett lysbildene på mikroskopet med en lysbildeholderen. Sikre agarose gel er vendt mot linsen. Tilfeldig ta bilder fra farget comet lysbilder fluorescens mikroskop med en 10 x linsen. Unngå kantene og områdene rundt noen luftbobler.
- Sikre hver kometen hale distribueres vannrett. Comet hoder må starte fra venstre og halen fra høyre.
- Lagre hvert bilde i et binært TIF-format med lyse DNA flekken og mørk bakgrunn. Laste bilder på programvare ved hjelp av " Velg filer som skal analysere " knapp, som ligger til venstre for verktøylinjen. Visningsvinduet et bilde skal vises ( figur 1).
- Tegne en måling ramme på skjermen og Juster dets størrelse i henhold til kometen av cellen. Klikk på " Juster " knappen for å angi terskelen av hodet, comet og hale etter bildet og deretter den " starte målinger " knappen ( figur 1).
- Velge en celle med rammen og aktivere målingen ved å klikke med musen på de " analysen kometen " knappen; en intensitet bildet vises på det " profiler " vindu med parameterne valgt mål. Resultatene kan lagres ved å klikke på " lagre resultatet " knappen ( figur 1).
Merk: Programvaren beregner parameterne inkludert lengden på kometen hale, prosentandelen av tailed DNA, hale øyeblikket (TM) og oliven hale øyeblikket (OTM). Hale øyeblikk blir beregnet av formler som følger:
- analysere minst 50 celler per behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nåværende protokollen beskriver en trinnvis arbeidsflyt for comet analysen gjennomføring og dataanalyse (figur 1). Resultatene fra alkaliske og nøytrale comet analyser viste at kometen hale doksorubicin-behandlet U251 celler (1 µM, 20 h) var lengre og hadde høyere DNA intensitet, antyder en betydelig akkumulering av fragmentert DNA på grunn av kjemoterapi (figur 2).
Kvantitativ analyse for enten alkaliske eller nøytral comet analysen viste betydelig økt kometen hale formasjon etter doksorubicin behandling (figur 3A) indikerer DNA skade. Resultatene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM og t-tester ble brukt for statistiske sammenligninger. Kvantifisering av halen fra begge analyser bekreftet økningen av gjennomsnittlig hale øyeblikk: For alkaliske comet analysen, 0.134 ± 0.0448 (n = 52) vs 13.84 ± 1.325 (n = 51), p < 0.01; For nøytral comet analysen, 0.596 ± 0.06668 (n = 78) vs 9.979 ± 0.658 (n = 51), p < 0,01. Disse dataene gir en kvantifiserbare indeks for å evaluere DNA skade. Videre forbedret Kombinasjonsbehandling PARP hemmer olaparib og temozolomide betydelig DNA skade i glioma celler (Figur 3 c), økte lengden og intensiteten av kometen hale signalet. Olaparib alene ikke innføre DNA-skader, mens det potentiated gentoksisk effekten av kjemoterapi agent temozolomide (DMSO 0.9836 ± 0.3377 (n = 64); Olaparib, 0.6663 ± 0.2325 (n = 51); TMZ, 6.197 ± 0.572 (n = 51); Olaparib + TMZ, 44.04 ± 1.269(n = 115), p < 0,01).
Figur 1 : Trinnvise bildet analyse ved hjelp av kometen analysen programvare. (A) verktøylinjen til kometen analysen programvare. (B) alkaliske comet analysen som et eksempel: brukergrensesnittet til kometen analysen programvare består av en bildevisningen, intensitet profil og oppkjøp-vinduet. (C) bildet bakgrunn, comet region og komet hodet ble definert i programvaren. (D) intensiteten profiler av kometen hode (rød) og hale (grønn) tegnes, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Representant bilder av alkaliske og nøytrale comet analyser. U251 glioma celler ble behandlet med doksorubicin og undersøkt av alkalisk (øvre panel) og nøytral (nedre paneler) komet analyser (skala bar = 10 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representant data av kometen hale øyeblikk. (A) alkaliske comet analysen data plott. p < 0,01. (B) nøytral comet analysen data plott. p < 0,01. (C) Comet analysen analyse avslørt synergistisk effekten av Kombinasjonsbehandling inkludert temozolomide (TMZ) og olaparib (Ola). p < 0,01. (D) representant bilder av glioma celler under Kombinasjonsbehandling av temozolomide og olaparib (skala bar = 10 µm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Comet analysen er et effektivt verktøy til å måle singel og dobbel-strand DNA pauser på cellenivå. Analysen er mye brukt som en "gyllen standard" i studier om gentoksisitet og biomonitoring13, alt fra grunnleggende lesjoner, DNA krysskoblinger, narkotika utvikling og alkali følsomme områder. I studien viste vi to forskjellige trinnvise protokoller for alkaliske og nøytrale comet analyser, henholdsvis. Kombinere enkelt celle geleelektroforese, fluorescerende mikroskopi og bilde tolkning, gir både i alkaliske og nøytrale comet analyser kvantitative metoder å vurdere omfanget av DNA skade i vitro.
Flere viktige tiltak er avgjørende for vellykket gjennomføring av kometen analysen. For eksempel bør utvises trinnene av forberedelse av reagenser. Hver løsning bør være fersk forberedt og holdt på den riktige temperaturen for minst 30 min før bruk, for å forhindre endogene DNA skade eller reparere under eksempel forberedelse. Et annet viktig skritt er utarbeidelse av levedyktig encellede suspensjon. Det er viktig å holde agarose på 37 ° C før bruk, for å maksimere celle overlevelse av kometen lysbildene. Cellen/agarose suspensjon bør være forberedt umiddelbart før analysen. Bruker siden av pipette-spisser for å spre cellen/agarose suspensjon bidrar til å oppnå et tynt lag med agarose på lysbildene slik at de fleste cellene kan plasseres i samme fokalplanet under mikroskopi. Eventuelt ripe kantene på lysbildene bruke en diamant-tipped for å forbedre agarose vedlegget.
Til tross for fordelene comet analysen finnes det flere begrensninger på denne tradisjonelle metoden14,15. For eksempel begrenses gjennomstrømningen av kometen analysen av prosessen med glass lysbilder utarbeidelse. I enkelte tilfeller kan gir en åtte-vellet objektglass en løsning for å forbedre analysen gjennomstrømming. En annen begrensning er at kometen analysen bare representerer forholdet mellom fragmentert DNA i celler. Det kreves tilleggsinformasjon støttende å skildre grundig mobilnettet endringene foruten DNA skade. I så fall kan apoptose analyse, γH2A.X flekker og immunoblotting være svært nyttig å gi en grundig analyse av ulike aspekter å avsløre effekten av DNA skadelige stoffer.
Det er mange programvare for comet bildeanalyser utdataene inneholder en rekke ulike parametere. Mest brukte parameterne er halen lengden, prosentandelen av DNA i halen og hale øyeblikket. Hale lengde kan bare brukes på et lavt nivå av DNA skade, siden det ikke pleier å endre halen er etablert14. Deretter intensiteten av halen øker når skaden er forbedret. Andelen DNA i comet halen er en annen nyttig parameter, som det er lineært relatert til bryte frekvens. Hale øyeblikket kombinerer hale lengde og hale intensitet i én verdi, dermed er det mest nyttige og brukte parameteren.
Comet analysen er mye brukt i gentoksisitet testing og menneskelige biomonitoring. Med utviklingen av DNA reparasjon hemmere kan comet analysen et verdifullt verktøy for å teste kombinasjon behandlinger som forbedrer resultatet av tradisjonelle kjemoterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av programmet for Intramural forskning på NIH, NCI og CCR. Alle forfattere fikk Intramural forskningsstipend fra NIH og NCI CCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 10x PBS(Ca++, Mg++ free) | TEKnova | P0196 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| EDTA | TEKnova | E0308 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaOH | Sigma | 72068 | |
| Sodium lauryl sarcosinate | Sigma | L7414 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Sodium acetate | Sigma | 32318 | |
| Glacial acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Ammonium acetate | Sigma | A1542 | |
| SYBR Green | Invitrogen | S33102 | |
| Low melting point agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Agarose | Invitrogen | 16500 | |
| 95% ethanol | WARNER-GRAHAM | #64-17-5 | |
| Trypsin | GIBICO | 25300-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Glass tissue slides | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 63422-11 | |
| Kimwipes | KIMberly-Clark | ||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | DENVILLE | ||
| Pipette Tips | SHARP | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Microwave | Avanti | ||
| Waterbath | PRECISION | ||
| Horizontal electrophoresis chamber | TREVIGEN | Cometassay ES II | |
| Power supply | Bio-Rad | ||
| Incubator | Quincy Lab | Model 12-140E | |
| Fluorescent microscope | Zeiss | LSM700 | |
| Micropipettor | Eppendorf |
References
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Tice, R. R., et al. Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environ Mol Mutagen. 35 (3), 206-221 (2000).
- Shah, A. J., Lakkad, B. C., Rao, M. V. Genotoxicity in lead treated human lymphocytes evaluated by micronucleus and comet assays. Indian J Exp Biol. 54 (8), 502-508 (2016).
- Azqueta, A., Collins, A. R. The essential comet assay: a comprehensive guide to measuring DNA damage and repair. Arch Toxicol. 87 (6), 949-968 (2013).
- Goldstein, M., Kastan, M. B. The DNA damage response: implications for tumor responses to radiation and chemotherapy. Annu Rev Med. 66, 129-143 (2015).
- Gavande, N. S., et al. DNA repair targeted therapy: The past or future of cancer treatment? Pharmacol Ther. 160, 65-83 (2016).
- Torgovnick, A., Schumacher, B. DNA repair mechanisms in cancer development and therapy. Front Genet. 6, 157 (2015).
- Weston, V. J., et al. The PARP inhibitor olaparib induces significant killing of ATM-deficient lymphoid tumor cells in vitro and in vivo. Blood. 116 (22), 4578-4587 (2010).
- Brown, J. S., O'Carrigan, B., Jackson, S. P., Yap, T. A. Targeting DNA Repair in Cancer: Beyond PARP Inhibitors. Cancer Discov. 7 (1), 20-37 (2017).
- Lu, Y., et al. Chemosensitivity of IDH1-Mutated Gliomas Due to an Impairment in PARP1-Mediated DNA Repair. Cancer Res. 77 (7), 1709-1718 (2017).
- Konca, K., et al. A cross-platform public domain PC image-analysis program for the comet assay. Mutat Res. 534 (1-2), 15-20 (2003).
- Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutat Res. 681 (1), 93-109 (2009).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Sci Rep. 4, 7200 (2014).
