Summary
細胞遊走は開発、組織のメンテナンスと修復、および腫瘍発生の促進に欠かせない、成長因子、ケモカイン、サイトカインによって調節されています。このプロトコルでは、ドットの試金、アイソレータケージ キューに応答に接続されている、まとまりのある細胞シートの渡り鳥の表現型を評価するために二次元、制約のない移行アッセイについて説明します。
Abstract
複雑な生物は静的に表示が彼らの組織が継続的な売り上げ高の下です。細胞の年齢、死ぬとは新しい細胞に置き換えられて細胞移動組織内でしっかりと管弦楽に編曲された方法で。腫瘍の開発の間にこの平衡が妨げられるし、腫瘍細胞がローカル微小環境、遠いサイトに行き、最終的に遠隔部位に転移性の腫瘍を形成するために侵入するために原産の上皮を残します。ドットの試金はセル フリーエリアに細胞シートの網の動きを評価し、タイムラプス イメージングによる細胞遊走のパラメーターを分析する簡単な二次元の制約のない移行アッセイ。ドット アッセイは実証してここでは、侵襲的人間、肺コロニー形成乳房癌細胞ライン、MCF10CA1a を使用して上皮成長因子 (EGF)、乳癌細胞の悪性の可能性を高めるに知られている細胞の渡り鳥応答を分析して渡り鳥の細胞表現型を変更します。
Introduction
腫瘍細胞の in vitroの侵襲と転移の可能性を評価する移動分析広く使用されます。よく、傷やスクラッチの試金は上皮シートのセルをオフにエリア1,2,3への移行を評価するために使用されます。スクラッチのアッセイを行う細胞が単層にメッキされ、ピペット チップ「スクラッチ」または無料のセル領域が作成されます。スクラッチの試金、一般的な培養装置を設定する簡単なウェル プレート、複数のサンプルの処理を可能にするうことができます。ただし、スクラッチでセル単一層から物理的に削除されます、細胞死をしばしば受けます。さらに、細胞外マトリックス プレートに取り付けがしばしばスクラッチ処理中に破損しています。同様に、シリコンの使用を挿入します (たとえば、Ibidi 室4) またはステンシルの5,6,7細胞の機械的崩壊とコーティングに使用されるマトリックス蛋白質の部分的な除去につながることができます、プレート。傷や傷の閉鎖を監視の試金の別の欠点は、スクラッチが閉じられるまで、細胞の移動を分析のみことができます彼らの期間限定コースです。
ドット アッセイを行うセルをコーティングしたまたはコーティング プレート8の上に円形のコロニーとしてめっき。このめっき方法の理論的根拠は、移行または挿入またはセルの削除によって文化を乱すことがなく細胞周辺に侵入できる定義されたエッジを持つ細胞シートを取得することです。ドット アッセイの全体的な目標は、移行細胞シート端変位または、同様高い時空間的解像度で細胞の渡り鳥の表現型を解析するタイムラプス イメージングを実行するコロニー径で測定したを観察することです。
細胞遊走はアイソレータケージ手がかり EGF などの成長因子、サイトカイン、ケモカインなどの様々 な影響を受けます。EGF が成長因子、その受容体は、EGF 受容体9へのバインディングを介してその生物学的効果を発揮し、腫瘍細胞4,9,10の侵襲と転移挙動が増加します。ドット試金を研究に使用するここで、EGF は、人間、侵襲性肺コロニー乳房癌細胞ライン (MCF10CA1a)8,11,12を形成細胞の移動を刺激します。
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Protocol
1. 料理 (1 日目) のコーティング
注: しないように取り扱いにプレートの底に指紋や汚れを残します。
- マウスのコラーゲン氷の上の IV を解凍し、それを希釈 50 mM HCl (pH 1.3) 10 μ g/mL コラーゲン IV 溶液 3 mL を準備します。
注: コラーゲンを 37 ° C で沈殿させるしたがって、コラーゲン溶液を低温融解と使用中保つことが重要です。適切なサイズの因数を準備することによって凍結融解の繰り返しを避けるため-80 ° C で保存して - 12 ウェル ガラス底板の各ウェルに 250 μ L コラーゲン IV ソリューションを追加し、適切なサイズ、タイトな終了のプラスチック ボックスにそれらを置きます。湿らせたペーパー タオル上と湿気のある商工会議所を製造し、ボックスを プレートの周りに配置します。室温で一晩版を孵化させなさい。
注: 成長分野だけは塗装する必要がある、それはコラーゲン溶液と、プレートの下部に取り付けられているカバー スリップをカバーするのに十分な (図 1A、Bのために板の回路図を参照してください)。 - 次の朝は、脱イオン H2O 2 回非吸収コラーゲンとバッファーを削除するとプレートをすすいでください。まあ、プレート下部に配置され、coverslip によって形成される (場合、水はそれがスプラッシュはこの領域に戻) 端にプレートの端に水を指示します。層流フードに板を風乾します。すぐに板を使用したり、4 ° C で最大 5 日間保存します。
注: 異なる細胞は異なるコーティング、フィブロネクチン、コラーゲンなど私を必要があります。
2. めっきドット アッセイ (2 日目)
-
細胞懸濁液を準備します。
- 細胞懸濁液を準備するには、5% 80% 合流馬血清を添加した DMEM/F12 中 60 mm 細胞培養用ディッシュで栽培されているセルを使用します。
- カルシウムとマグネシウム無料ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) で細胞を濯ぎ 1 回 500 μ L トリプシン-EDTA (常温) を追加し、37 ° C、5% CO2、加湿雰囲気でインキュベーターで 3-5 分のセルを孵化させなさい。
- トリプシン処理を停止し、カウントを 20 4.5 mL 培養液中の剥離細胞を中断、検定に細胞懸濁液の μ 因数。
- 3 分間 200 × g で遠心分離によっての 15 mL の円錐管の残りのセルのペレット、上清を吸引、3 x 106セル/mL に培養液中の細胞を再懸濁します。
注: その他の基材をコーティングや細胞の最適な細胞濃度は希釈系列の確立されなければなりません。3 x 106セル/mL は、出発点として推奨されています。
-
めっきセル
- コラーゲン IV の各カバー スリップの中心に細胞懸濁液の 10 μ L のドロップの場所 (図 1A, B) の塗装を傷に触れたりなし 12 ウェル ガラス底板にコーティング。プレートを付けるセルを許可するように、加湿雰囲気 37 ° C で 30 分間インキュベートします。倒立顕微鏡で細胞が接続されているを確認します。
注: 最高といえる、ドロップの端、単分子膜の形成は、(図 1C) を観察することができます。必要な場合は、プレートを孵化させなさいまで 3 h するインキュベーターの湿度が十分に高く、滴がすぐに乾燥してください。このステップの間にドロップ量の減少が見られる場合は、湿度を高める井戸間のスペースに PBS を追加します。 - 非添付のセルを削除する 2 回培養液 1 mL と井戸を優しく洗います。各ウェルには、培地 1 mL を追加します。ない浮遊細胞が残る、そうでなければもう一度洗浄を倒立顕微鏡で確認します。一晩で、37 ° C、5% CO2、加湿雰囲気、明確に定義された細胞シートを取得するセルを孵化させなさい。
注: 浮遊細胞はプレートに再アタッチして不要な細胞群れ体を形成する可能性があります。
- コラーゲン IV の各カバー スリップの中心に細胞懸濁液の 10 μ L のドロップの場所 (図 1A, B) の塗装を傷に触れたりなし 12 ウェル ガラス底板にコーティング。プレートを付けるセルを許可するように、加湿雰囲気 37 ° C で 30 分間インキュベートします。倒立顕微鏡で細胞が接続されているを確認します。
3. 刺激細胞 (3 日目)
- 逆顕微鏡を使用してコロニーが正しく成長しているセルを確認するすべての井戸を確認します。必要に応じて、不適切な井戸をマークし、それらを使用しないでください。
- 調査条件ごとに適切なプレートの各ウェルにラベルを付けます。重複した、または 3 通で各条件を実行します。
- 0.1% 馬血清 (飢えた中) を含む DMEM/f12 キーでセルを餓死に媒体を変更 3 h 前に細胞が刺激されます。
- EGF (最終濃度が 5 ng/mL) の添加、または他の目的の仲介によって細胞を刺激し、優しく 1 mL micropipettor を使用してメディアをミックス、プレートを旋回します。
- セクション 4.1 で説明した刃先変位とのエッジの輪郭を観察する 1-4 日のプレートを孵化させなさいまたはセクション 4.2 で説明されているようにタイムラプス イメージングを実行します。
4. 細胞群れ体と細胞移動の可視化
-
ヘマトキシリン ・ エオジン (HE) 染色コロニー成長 (4-7 日目) を測定するには
- 70% エタノール (1 mL/ウェル) ~ 2 分のセルを修正します。
- ヘマトキシリン (1 mL/井戸)、~ 2 分で核を染色します。
- 洗浄細胞核まで水道水 (1 mL/も) が青、5-10 分。
- エオシン (1 mL/井戸)、~ 2 分で細胞質を染色します。
- (1 mL/井戸) の脱イオン水ですすいでください。
注: ヘマトキシリンとエオシンのソリューションすることができます収集し、かすかな染色になるまで複数回使用します。 - プレートを風乾します。
- プレートを反転し、ドットの直径を定規で測定します。また、カメラ プレートの写真を撮るし、ImageJ でドットの直径を分析します。
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微速度顕微鏡観察 (日 3)
- インキュベータ顕微鏡に切り替えるし、37 ° c. に温度を調整DH25 %o. 調整 CO2で加湿器を満たしなさい。インキュベーターのチャンバーを加湿して電動ステージを自由に移動できることを確認します。インキュベーターのチャンバーを閉じるでき、37 ° c. に調整する顕微鏡
注: 顕微鏡を使用 (材料表参照) ここで、セルがフォーカスの漂流を避けるためにイメージを作成する前に、この少なくとも 3 h の 37 ° C まで加熱する必要があります。 - インキュベータ顕微鏡のステージにプレートを置き、ステージ リストを設定します。画像 2 つの反対端と各セル ドット (図 1A) の中心。
- 対物レンズ 10 倍を使用して 15-24 h の 3 分毎の画像を取る。データをダウンロードして、選択したプログラムで画像解析を続行などImageJ や Matlab。
- インキュベータ顕微鏡に切り替えるし、37 ° c. に温度を調整DH25 %o. 調整 CO2で加湿器を満たしなさい。インキュベーターのチャンバーを加湿して電動ステージを自由に移動できることを確認します。インキュベーターのチャンバーを閉じるでき、37 ° c. に調整する顕微鏡
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Representative Results
侵襲型を使用して (図 1) を紹介ドット アッセイを行った肺コロニー モデル システムとして乳癌細胞 (MCF10CA1a) を形成します。ドット アッセイを生成するのに便利ですし、初心者の手でも再現性の高いセル ドットと簡単な試金 (図 1D) を実行します。ドット アッセイは、HE 染色、またはタイムラプス イメージングと組み合わせるし、後続の粒子画像流速測定法 (PIV) により、上皮のエッジ、セル速度、および端のセルとセル方向の変位を含むさまざまな移行パラメーターの検討上皮シートの無料のセル領域に移行します。最初に、セル ドットの位相コントラスト イメージングは、侵襲性肺コロニー形成乳房癌細胞 (MCF10CA1a) を維持する間葉系の表現型 EGF 刺激後明らかにしました。ただし、単一細胞シートを残している EGF 刺激細胞ドット (図 2矢印) でより頻繁に観察します。EGF に対する MCF10CA1a 細胞の反応はさらに彼によって評価された 4 日間の EGF と刺激された文化の染色します。確かに、EGF 刺激の結果増加コロニー径 (図 3)。これらの観察は、その移行を示す EGF の刺激細胞を変更可能性があります。
したがって、ドットの試金は MCF10CA1a 細胞シートの動的移行表現型のより詳細な分析を実行する次に利用されました。9 h (ビデオ 1とビデオ 2) EGF で細胞の刺激を次の細胞シート端をイメージしましたし、イメージし、Matlab4,13,14PIV によって分析されました。PIV は、EGF が制御の細胞で 0.45 μ m/分から 0.63 μ m/分セル速度 (図 4A) を増加することを明らかにしました。同時に EGF が細胞の方向性を増加、EGF 刺激の文化 (図 4B) 0.79 にコントロールの文化で 0.95 からセル方向 (角度広がり) の変動の減少によって示されます。EGF は、HE 染色後 4 日 (図 3) で、356 μ m (図 4)、257 μ m から 9 h の上の上皮のエッジの半径方向の変位を増加しました。したがって、異なるその後試金との組み合わせでドットの試金の使用は、EGF が変更されること MCF10CA1a 細胞シートの端移行細胞のスピードと方向性が増加すると、その増加植民地半径の結果を示しています。
図 1:ドット アッセイをイメージングします。(A, B)細胞をガラス下部プレート井戸の中心に円形のコロニーとしてめっき。移行分析の画像は、(A) のコロニーの中心部と同様、2 つの反対端で撮影されます。(C) 暗視野像セル ドットと高倍率 (位相) 細胞 (センター) のプレートに取り付け後ドロップの端とセルのドットのエッジを表示 (左)、めっき中に。接続されたセルは、非添付の細胞は円形 (右) とフラットと多角形です。(D)ドットの直径は、再現性が高いです。ドットは、細胞が刺激され、直径は、ImageJ を使用して決定する前に、めっき直後をイメージしました。点のサイズは 1 つの実験だけでなく内で別のユーザーの間で再現性の高い、めっきセル ドット能力を得るために、少しトレーニングが必要 (E = 組織培養での経験 10 年以上私 = 4 週間未満の組織 c で体験ulture)。n = グループあたりのドット数 12。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2:EGF 変調 MCF10CA1a の細胞形態学的表現型。MCF10CA1a 細胞は、前にいた EGF 刺激 0.1% 馬血清を添加した DMEM/f12 キーで 3 h に飢えていた (5 ng/mL)。EGF 刺激のコロニーの端に単一のセルをシート (矢印) から移行する傾向があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: EGF 細胞コロニーの純成長率が増加します。MCF10CA1a 細胞は、前にいた EGF 刺激 0.1% 馬血清を添加した DMEM/F12 中 3 h に飢えていた (5 ng/mL)。4 日後、細胞はエタノール固定、ヘマトキシリンとエオシンで染色しました。EGF 刺激のドットは、4 日後の高い直径を持っています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:EGF は、渡り鳥 MCF10CA1a の細胞表現型を変調します。MCF10CA1a 細胞は、前にいた EGF 刺激 0.1% 馬血清を添加した DMEM/F12 中 3 h に飢えていた (5 ng/mL)。9 h. その後粒子画像流速測定法解析が Matlab13で行ったために、細胞は 3 分毎をイメージしました。速度の値は、フィールドごとに時間の経過と共に平均速度を表します。速度ベクトルの角度広がりと算出されました。
、および 0 (高指向性) からの範囲
(低方向)。角度広がりの減少増加方向と見なされます。半径方向の変位を算出した植民地半径 t = t で植民地半径から 0 h = 9 h. EGF 刺激 MCF10CA1a セル ドット増加セル速度 (A; 上部のパネル) の結果、角度広がりを減少または増加方向 (B; 中間パネル)、および高められた植民地半径 (C; 下のパネル)。データを表す平均 ± SEM の n = 3 の実験。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1:些細 MCF10CA1a 細胞タイムラプス イメージングします。画像が撮影された 9 h.のすべての 3 分してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
ビデオ 2:EGF 刺激による MCF10CA1a 細胞のイメージング時間経過 (5 ng/mL)。画像が撮影された 9 h.のすべての 3 分してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
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Discussion
腫瘍の進行の間に周囲の組織に侵入し、15遠隔部位に転移する起源の組織から移行します。細胞の細胞群からの移動は、ドットのアッセイで観察できます。ここでは、ドットの試金は EGF に応えてひと乳癌細胞の渡り鳥の表現型の分析によって例証されます。
ドットのセットアップでいくつかの手順の正確かつ複製可能な結果を得るための試金は重要です。まず、プレートのコーティングは、場合強い細胞をプレートに付着できる方法と、細胞の移行を決定します。コラーゲン IV や他の細胞外マトリックスとプレートのコーティングが実験的変動を最小限に抑えるために均質な注意する必要があります。さらに、それは選ばれた細胞ラインのコーティング条件を最適化する必要がありますいくつかの濃度の異なる行列を複数の実験と、細胞を付けるし、コーティングされたプレートに移行保障されなければなりません。第二に、セルの正確なめっきは再現性にとって重要です。セルのドロップのフット プリントは、その形状と同様に、セルのドットのサイズを決定します。理想的には、ドロップは、ピペット チップの表面に触れることがなく配置されます。ドロップの形状は、ほとんど、再現可能な直径の円形のフット プリントで、プレート表面の表面張力によって決定されますし。その結果、細胞懸濁液メッキのボリュームを変更することによりセル ドットの直径を変更できます。
したがって、いくつかの点、ドットの分析を実行するときに考慮するのに。まず、細胞懸濁液の細胞密度は、コーティングだけでなく、セルの型に調整する必要があります。一般に、ドロップのスプレッドは広い、高い細胞密度は、合流単分子膜板セルに必要です。さらより多くの細胞は細胞が小さいのに比べて大きい、拡散セルくらいは広がって場合コンフルエント単層を取得するめっきする必要があります。第二に、ドット アッセイは、異なるプレート フォーマットを採用できる、このドットのサイズに適応できる小さい井戸メッキ、ドットのボリュームを減らすことによってと大きいドットをドロップして、高いボリュームを使用して、めっきすることが必要な場合。第三に、行に添付しません 30 分内でプレートにはメッキ時間いくつかのセルには、3 h までを拡張できます。同様に、プレートのコーティングに移行するセルに適したする必要があります、ときにセルをメッキ コーティングに傷を付けないは注意が必要があります。セル、アタッチまたは選択されたマトリックスに移行しない場合、コーティング、コラーゲン 1 やフィブロネクチンなどの他の種類を調べることができます、または板のコーティングの間にマトリックス蛋白質、インキュベーション時間と温度の濃度変更します。特定のセルの行の適切な細胞外マトリックスは文献で見つけられるかもしれない。
ドットの試金には、ほとんどの制限がありません。二次元遊走アッセイによる、このようにこの可能性があります見なされるただし、三次元の試金、に比べてより多くの不利な点二次元アッセイよりも実行することは困難です。主要な問題は、おそらく高速増殖細胞を使用し、細胞遊走が長い期間 4 日後コロニー径の分析のためここで終わったものとして評価される場合に特に細胞増殖が結果に影響を与えることです。同様に、スクラッチのアッセイでは、細胞シート; 内細胞増殖によって傷傷の閉鎖が影響を受けます。・ ボイデン室アッセイの血清や細胞増殖を誘発する他のメディエーターは、走化性因子として使用される場合は特に下部室の増加細胞増殖結果が不正確に。具体的には非増殖細胞の運動を観察する単一細胞トラッキングを使用できます。また、マイトマイシンまたは他の増殖阻害剤4,16の添加により、(i) 血清飢餓ここで行う、および/または (ii) による細胞分裂阻害細胞増殖を小さくできます。細胞の増殖を減らすためには、しかし、注意が必要損傷しないように彼らはもはや移行できる範囲のセル。興味深いことに、我々 は同じような制約のない移行で見つけたがそれは移行4,5の間に上皮シートの健全性の維持に関与している細胞の増殖は、エッジの変位と相関性がない試金 17。これは興味深い質問を開きます: 細胞増殖細胞シートの移行に必要なコンポーネントは、?シート最終的にできなくなりますを展開し、細胞の移行をサポートすることができる、拡散が完全にブロックされている場合、強力な細胞間接着と細胞シートの周囲の環境への移行が否定的影響をことが期待されます。この時点でセルは低速または停止のいずれかの移行をかシートを中断する必要があります。逆に、低細胞接着斑とシートの移行は細胞は、上皮細胞シートの端に散乱など個別に移行するシートを残すことができます、影響が少なくなる可能性があります。したがって、細胞遊走と細胞増殖が相互依存し慎重に検討する必要がある細胞増殖をブロックのシート移行を検討しよう。したがって、分析シート移行の試金、ほとんど減少が細胞遊走を廃止しない血清飢餓下で実行されます。
2次元の表面上のシート移行を勉強する他の移行の試金含めるスクラッチ傷試験やより最近では、シリコンや PDMS チャンバと定義された領域内のセルのめっきをするステンシルを使用して制約のない移行アッセイと商工会議所またはステンシル1,3,4,5,6,7,16を除去した後の無料のセル領域にセルの制約のない移行は。これらの後者の試金およびドット アッセイは、セルめっき形状とコロニーのサイズによって決定されるため未経験と同様、経験豊富なユーザーの手で再現性の高いを提供しています。対照的に、スクラッチの試金で細胞膜の傷、練習が必要です、でもシート部の専門家の手にすることができますを食い物に誤ってタイトな単分子膜を形成する細胞を使用している場合。シリコーン室またはステンシルで使用するめっきセル、Ibidi 室を除去した後の細胞シートの誤った負傷が確認されたものの、この問題が向上します。ドットの試金はセルを植民地にメッキして自由に育つことができるようこの問題を回避できます。同じ理由でドット アッセイでは、簡単に傷や他の移行の試金商工会議所/ステンシルの除去によって妨げられる不変のコーティングに移行する細胞ができます。さらに、細胞が傷やチェンバース/ステンシルの除去で怪我しない細胞死とチェンバース/ステンシルの除去に関連付けられているサイトカインの関連するリリース ドット アッセイの移動に影響を与えません。最後に、電池がスクラッチ試金および室またはステンシルを使用して試金で過剰メッキ多い。したがって、セルをクリアすると、それらをオフに傷または細胞の移動を妨げる物理的な障壁の取り外しによって、単層細胞がリラックスして、セルを押した後は積極的に移行せず無料のセル領域に 。対照的に、ドットのアッセイで細胞シートを確立できます自身一晩前に移行を観察し、細胞シートの緩和ではなく、細胞の移動を観察できます。
簡単に、特別な機器なしに行うことができる、ドット アッセイ総コロニー形態および細胞散乱8、免疫染色8、時間経過を評価する細胞の染色などその後の試金の範囲にそれ自身を貸すイメージングおよび ImageJ、Matlab、または他の画像解析ソフトウェア13を使用して以降のデータ分析。追加のパラメーターなど、隣接するベクトルの相関関係やその分離軌道評価できますより正確にシート13内細胞運動のコヒーレンスをについて説明します。免疫染色タイムラプス イメージングを組み合わせることもできます、ImageJ サポート細胞遊走にさらなる洞察力を得るために細胞追跡。たとえば、ドットはタイムラプス イメージング後細胞骨格蛋白質の immunostained をすることができます、ImageJ を使用したセルの渡り鳥の表現型に影響を与えるこれらの蛋白質の表現の分析は、細胞を追跡し。もう一つの将来の使用は核蛍光蛋白質を発現する細胞の単一細胞追跡です。重要なは、ウェルプレートでドット アッセイを行うことが、中-高スループットに適したこのようなイメージングは、シート移動に及ぼす薬や Shrna を画面に簡単にアクセスし、非常に手頃なツールそれを作るします。
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Disclosures
著者は、何を開示します。
Acknowledgments
著者は、読書と原稿のコメントを Bhagawat サブラマニアン、李 (ジェイソン) チャン ポール ランダッツォとキャロル ・親に感謝したいです。この作品は、国立がん研究所の学内研究プログラムによって支えられた健康の国民の協会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
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