Summary
La migration cellulaire est essentielle pour le développement, la maintenance du tissue et réparation et tumorigenèse et est régulée par des facteurs de croissance, cytokines et chimiokines. Ce protocole décrit le dosage de la dot, une analyse bidimensionnelle, sans contrainte de migration afin d’évaluer le phénotype migrateur de feuilles de cellule cohésive, attaché en réaction aux signaux micro-environnementales.
Abstract
Bien que des organismes complexes apparaissent statiques, leurs tissus subissent une rotation continue. Comme les cellules âge, meurent et sont remplacées par de nouvelles cellules, cellules se déplacent dans les tissus d’une manière bien orchestrée. Au cours du développement de la tumeur, cet équilibre est perturbé, et les cellules tumorales quittent l’épithélium d’origine pour envahir le microenvironnement local, se rendre dans des endroits éloignés et pour finalement former des tumeurs métastatiques dans des sites éloignés. L’essai de la dot est un test simple, deux dimensions de la migration sans contrainte, pour évaluer le mouvement net de feuilles de cellule dans une zone acellulaire et d’analyser les paramètres de la migration cellulaire à l’aide de l’imagerie Time-lapse. Ici, le dosage de la dot est démontré à l’aide un homme envahissante, la colonie de poumon formant la lignée de cellules de cancer du sein, MCF10CA1a, pour analyser la réponse migratoire LiPo au facteur de croissance épidermique (EGF), qui est connu pour augmenter le potentiel maligne de cellules cancéreuses du sein et pour modifier le phénotype migratoire des cellules.
Introduction
Les essais de migration sont largement utilisés pour évaluer le potentiel invasif et métastatique des cellules tumorales in vitro. Le plus souvent, la blessure ou le zéro dosage sert à évaluer les migration des feuilles épithéliales dans une cellule effacée zone1,2,3. Pour effectuer le test de gratter, les cellules sont plaqués en une monocouche et un « scratch » ou zone acellulaire est créé avec un embout de la pipette. Le test de scratch est facile à configurer avec fournitures de vitroplants couramment disponible et peut être effectué en plaques multipuits, permettant ainsi à la transformation de plusieurs échantillons. Cependant, comme le scratch est fait, les cellules sont physiquement supprimées de la monocouche et souvent subir une mort cellulaire. En outre, fixée à la plaque de la matrice extracellulaire est souvent endommagée pendant le processus de se gratter. De même, l’utilisation de silicium insère (comme Ibidi chambres4) ou des pochoirs5,6,7 peut conduire à une rupture mécanique des cellules et l’élimination partielle des protéines de la matrice utilisée pour le revêtement de la plaques. Un autre inconvénient des essais de contrôle de fermeture des plaies ou égratignures est leur cours de durée limitée, comme la migration cellulaire seulement peut être analysée jusqu'à la fermeture de l’éraflure.
Dans la réalisation de l’essai de la dot, les cellules sont plaqués comme une colonie circulaire sur une plaque revêtues ou non revêtues8. La justification de cette stratégie de placage est d’obtenir des feuilles de cellule avec bords définis, qui peuvent migrer ou envahir dans les environs d’acellulaire sans perturber la culture par prélèvement de cellules ou d’inserts. L’objectif global de l’essai de la dot est d’observer la migration des feuilles de cellule, telle que mesurée par le déplacement de bord ou le diamètre des colonies, ainsi qu’effectuer une imagerie Time-lapse pour analyser le phénotype migratoire des cellules en plus haute résolution spatio-temporelle.
La migration cellulaire peut être affectée par une variété de signaux micro-environnementales comme facteurs de croissance tels que l’EGF, cytokines et chimiokines. EGF est un facteur de croissance qui exerce ses effets biologiques via la liaison à son récepteur, le récepteur EGF9et augmente le comportement envahissant et métastatique des tumeurs des cellules4,9,10. Ici, le test de point est utilisé pour étudier EGF stimulée la migration cellulaire dans une colonie de poumon humain envahissantes, formant breast cancer cell line (MCF10CA1a)8,11,12.
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Protocol
1. revêtement de plats (jour 1)
Remarque : Veillez à ne pas laisser des empreintes digitales ou la saleté sur le bas de la plaque lors de la manipulation il.
- Décongeler le collagène IV sur la glace de la souris et le diluer avec HCl (pH 1.3) 50 mM pour préparer 3 mL d’une solution de IV 10 µg/mL collagène.
NOTE : Collagène précipitera à 37 ° C. Il est donc important de garder la solution du collagène à basse température en fonte et en travaillant avec elle. Éviter les cycles de gel-dégel répétés en préparant des aliquotes de tailles appropriée et leur stockage à-80 ° C. - Ajouter 250 µL de solution de collagène IV dans chaque puits de plaques de verre de 12 puits à fond et rangez-les dans une boîte en plastique de taille appropriée, fermeture étanche. Placer une serviette en papier humide au-dessus et autour des plaques pour fabriquer une chambre humide et fermer la boîte. Incuber les boîtes pendant une nuit à température ambiante.
Note : Que seule la zone de croissance doit être revêtu, il est suffisant pour couvrir uniquement la lamelle couvre-objet, qui est attaché au bas de la plaque, avec une solution de collagène (voir Figure 1A, B pour un schéma de plaque). - Le lendemain matin, rincer les plaques avec désionisée H2O deux fois pour retirer le tampon et le collagène non absorbé. Diriger l’eau vers le bord de la plaque bien, non pas sur le bord formé par le fond de la plaque et le couvre-objet (si l’eau est reversé dans ce domaine qu'il éclaboussera). Sécher les plaques dans la hotte à flux laminaire. Utilisez les plaques immédiatement ou conserver à 4 ° C pendant 5 jours.
Remarque : Les différentes lignées cellulaires peuvent nécessiter différents revêtement, telles que la fibronectine ou collagène I.
2. plaquant le dosage de la Dot (jour 2)
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Préparation de la suspension cellulaire
- Pour préparer la suspension cellulaire, utiliser des cellules qui ont été cultivées dans un plat de vitroplants de 60 mm dans le milieu DMEM/F12 additionné de 5 % de sérum de cheval à la confluence de 80 %
- Rincer les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco exempts de calcium et de magnésium (SPD) une fois, ajouter 500 µL trypsine-EDTA (température ambiante) et incuber les cellules pendant 3-5 min dans un incubateur à 37 ° C, 5 % de CO2, atmosphère humidifiée.
- Suspendre les cellules individuelles dans 4,5 mL de milieu de culture pour arrêter l’activité de la trypsine et compter 20 quantité µL de la suspension cellulaire dans un hémocytomètre.
- Le reste des cellules dans un tube conique de 15 mL de granule par centrifugation à 200 x g pendant 3 min, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans un milieu de culture à 3 x 106 cellules/mL.
Remarque : Pour les autres substrats de revêtement et/ou de lignées cellulaires, la densité cellulaire optimale doit être établie dans une série de dilutions. 3 x 106 cellules/mL est recommandé comme point de départ.
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Cellules de placage
- Place une baisse de 10 µL de suspension cellulaire au centre de chaque lamelle couvre-objet du collagène IV enduit plaque de fond de verre de 12 puits sans toucher ni rayer le revêtement (Figure 1A, B). Incuber la plaque pendant 30 min à 37 ° C, une atmosphère humidifiée, pour permettre les cellules attacher. Dans un microscope inversé s’assurer que les cellules sont accrochés.
Remarque : Ceci peut être mieux vu au bord de la goutte, où la formation d’une monocouche peut être observée (Figure 1C). Si nécessaire, incuber la plaque jusqu'à 3 h. Veillez à ce que l’humidité dans l’incubateur est suffisamment élevée, comme les gouttes peuvent sécher rapidement. Si on observe une réduction du volume baisse au cours de cette étape, ajouter PBS aux espaces entre les puits pour augmenter l’humidité. - Laver délicatement les puits avec 1 mL de milieu de culture deux fois pour éliminer les cellules non inscrits. Ajouter 1 mL de milieu de culture dans chaque puits. Vérifier dans un microscope inversé qu’aucune cellule flottante restent, sinon laver les puits à nouveau. Incuber les cellules durant la nuit à 37 ° C, 5 % de CO2, atmosphère humidifiée, pour obtenir des feuilles de cellule bien définis.
Remarque : Les cellules flottant risquent à recoller la plaque et à former des colonies de cellules indésirables.
- Place une baisse de 10 µL de suspension cellulaire au centre de chaque lamelle couvre-objet du collagène IV enduit plaque de fond de verre de 12 puits sans toucher ni rayer le revêtement (Figure 1A, B). Incuber la plaque pendant 30 min à 37 ° C, une atmosphère humidifiée, pour permettre les cellules attacher. Dans un microscope inversé s’assurer que les cellules sont accrochés.
3. stimulation des cellules (jour 3)
- Vérifier tous les puits à l’aide d’un microscope inverse pour s’assurer que la cellule colonies ont bien grandi. Le cas échéant, marquer puits inadaptées et ne les utilisent pas.
- Étiquetez chaque puits de la plaque de manière appropriée pour chaque condition étudiée. Exécuter chaque condition en double ou triple exemplaire.
- Changer le milieu affamer les cellules en DMEM/F12 contenant 0,1 % de sérum de cheval (milieu affamé) 3 h avant que les cellules sont stimulées.
- Stimuler les cellules par addition de l’EGF (concentration finale de 5 ng/mL) ou d’autres médiateurs désirés et mélanger délicatement le support à l’aide d’une micropipette de 1 mL ou en agitant la plaque.
- Incuber les plaques pour 1 à 4 jours observer le déplacement de bord et de contour bord tel que décrit à la section 4.1 ou effectuer une imagerie Time-lapse comme décrit à la section 4.2.
4. visualisation des Colonies cellulaires et Migration cellulaire
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L’hématoxyline-éosine (HE) souillure pour mesurer la croissance des colonies (4-7 jours)
- Fixer les cellules dans l’éthanol à 70 % (1 mL/puits) pendant environ 2 min.
- Tacher les noyaux avec l’hématoxyline (1 mL/puits), environ 2 min.
- Les cellules laver avec l’eau du robinet (1 mL/puits) jusqu'à ce que les noyaux sont bleus, 5-10 min.
- Tache de cytoplasme avec l’éosine (1 mL/puits), environ 2 min.
- Rincer à l’eau désionisée (1 mL/puits).
Remarque : L’hématoxyline et éosine solutions soient collectées et utilisées plusieurs fois jusqu'à ce que la coloration devient faible. - Sécher la plaque.
- Retournez la plaque et mesurer le diamètre de la dot avec une règle. Vous pouvez également prendre des photos de la plaque avec une caméra et d’analyser le diamètre de la dot dans ImageJ.
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Time-lapse microscopie (jour 3)
- Allumer le microscope de l’incubateur et ajuster la température à 37 ° C. Remplir l’humidificateur avec dH2O. réduire/agrandir le CO2 à 5 %. S’assurer que la chambre de l’incubateur est humidifiée et que la platine motorisée peut se déplacer librement. Fermer la chambre de l’incubateur et permettre au microscope pour s’adapter à 37 ° C.
Remarque : Le microscope (voir la Table des matières) utilisé ici doit être chauffé à 37 ° C pendant au moins 3 h avant que les cellules sont imagés pour éviter les dérives de la mise au point. - Placer la plaque sur la scène du microscope incubateur et mettre en place la liste de l’étape. Deux bords opposés de l’image et le centre de chaque point de la cellule (Figure 1A).
- Prendre des photos toutes les 3 min, de 15 à 24 h à l’aide de l’objectif 10 X. Télécharger les données et de procéder à l’analyse d’image dans un programme de choix, par exemple, ImageJ ou Matlab.
- Allumer le microscope de l’incubateur et ajuster la température à 37 ° C. Remplir l’humidificateur avec dH2O. réduire/agrandir le CO2 à 5 %. S’assurer que la chambre de l’incubateur est humidifiée et que la platine motorisée peut se déplacer librement. Fermer la chambre de l’incubateur et permettre au microscope pour s’adapter à 37 ° C.
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Representative Results
L’essai de point présenté ici (Figure 1) a été réalisée par envahissantes, formant des cellules de cancer du sein (MCF10CA1a) comme système modèle des colonies de poumon. Le dosage de la dot donne des points de cellules hautement reproductible même dans la main de débutants, ce qui en fait un moyen pratique et facile à exécuter le test (Figure 1D). Le test point combiné avec il coloration ou Time-lapse imagerie et vélocimétrie par image de particules ultérieures (PIV) permet l’étude des divers paramètres de migration, y compris le déplacement de bords épithéliales, la vitesse de la cellule et directionnalité de cellule sous forme de cellules sur les bords d’une feuille épithéliale migrent vers une zone acellulaire. Au départ, imagerie de contraste de phase de points de la cellule a révélé qu’envahissantes, poumon colonie formant cellules mammaires cancéreuses (MCF10CA1a) maintiennent un phénotype mésenchymateux après stimulation par EGF. Cependant, monocellules laissant la feuille sont observés plus fréquemment dans la cellule stimulée par l’EGF dots (Figure 2, flèches). La réponse des cellules MCF10CA1a à EGF a été plus amplement évaluée par HE la coloration des cultures qui ont été stimulées avec EGF pendant 4 jours. En effet, EGF-stimulation a provoqué un diamètre accru de colonie (Figure 3). Ces observations indiquent que la migration de l’EGF cellules stimulées peuvent être modifiées.
Par conséquent, le test point servait ensuite pour effectuer une analyse plus détaillée du phénotype la migration dynamique des feuilles de cellule MCF10CA1a. Cellules sur les bords de la feuille ont été photographiés pendant 9 h suite à la stimulation des cellules avec EGF (vidéo 1 et vidéo 2) et les images ont ensuite été analysées par PIV dans Matlab4,13,14. PIV a révélé que EGF augmente la vitesse de cellules (Figure 4A) à 0,63 µm/min de 0,45 µm/min dans les cellules contrôles. Dans le même temps, EGF a augmenté la directionnalité des cellules, et cela se traduit par une réduction de la variabilité de la directivité (écart angulaire) de cellule de 0,95 dans les cultures témoins à 0,79 en cultures stimulée par l’EGF (Figure 4B). EGF a augmenté le déplacement radial du bord épithélial plus de 9 h de 257 µm à 356 µm (Figure 4), a été également observée par il coloration après 4 jours (Figure 3). Ainsi, l’utilisation du dosage dot en combinaison avec différents dosages ultérieurs montre que EGF altère migration sur les bords des feuilles de cellules MCF10CA1a telle que la vitesse de la cellule et la directionnalité sont augmentées, résultant dans un rayon de colonie accrue.
Figure 1 : Imagerie le dosage dot. (A, B) Les cellules sont plaqués comme une colonie circulaire au centre du puits à fond plat en verre. Pour l’analyse de la migration, les images sont prises à deux arêtes opposées ainsi que le centre de la colonie (A). (C) champ sombre image de dot de la cellule au cours de l’électrodéposition (à gauche) et à fort grossissement (contraste de phase) montrant le bord de la goutte et le bord de la dot de la cellule après les cellules fixés à la plaque (Centre). Les cellules attachées sont plats et polygonales, tandis que les cellules non inscrits sont rondes (à droite). (D) Le diamètre des points est très reproductible. Points ont été imagées immédiatement après l’ensemencement et avant que les cellules sont stimulées et le diamètre déterminé à l’aide de ImageJ. La taille de la dot est hautement reproductible au sein d’une des expériences, ainsi qu’entre différents utilisateurs et peu de formation est nécessaire pour obtenir la compétence dans les points de la cellule d’électrodéposition (E = plus de 10 ans d’expérience en culture de tissus, j’ai = moins de 4 semaines d’expérience dans le tissus c ulture). n = 12 points par groupe. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : EGF module le phénotype morphologique des cellules MCF10CA1a. MCF10CA1a cellules ont été privées pendant 3 h en DMEM/F12 additionné de 0,1 % de sérum de cheval avant d’être stimulés avec EGF (5 ng/mL). Au bord des colonies stimulée par l’EGF monocellules ont tendance à migrer hors de la feuille (flèches). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : EGF augmente la croissance nette des colonies cellulaires. MCF10CA1a cellules ont été privées pendant 3 h dans un milieu DMEM/F12 additionné de 0,1 % de sérum de cheval avant d’être stimulés avec EGF (5 ng/mL). 4 jours plus tard, les cellules sont l’éthanol fixés et colorés à l’hématoxyline et éosine. Stimulée par l’EGF points ont un diamètre supérieur après 4 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : EGF module le phénotype migratoire des cellules MCF10CA1a. MCF10CA1a cellules ont été privées pendant 3 h dans un milieu DMEM/F12 additionné de 0,1 % de sérum de cheval avant d’être stimulés avec EGF (5 ng/mL). Les cellules ont été imagées toutes les 3 min à 9 h. ultérieure particle image velocimetry analyse a été effectuée dans Matlab13. Les valeurs de vitesse représentent la vitesse moyenne au fil du temps pour chaque champ. Écart angulaire de vecteurs de vitesse a été calculée comme étant :
où 
et varie de 0 (haute directivité) à 
(faible directivité). Une diminution de l’écart angulaire est considérée comme une augmentation dans la directionnalité. Déplacement radial a été calculé en soustrayant le rayon de la colonie à t = 0 h depuis le rayon de la colonie à t = 9 h. EGF-stimulation de MCF10CA1a cellule points a donné lieu à une vitesse accrue des cellules (A ; panneau supérieur), diminue l’écart angulaire ou augmenté de directivité (B ; moyen Groupe d’experts) et le rayon de la colonie accrue (C ; panneau inférieur). Les données représentent la moyenne ± SEM de n = 3 expériences. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1 : Time-lapse imagerie de cellules non stimulées de MCF10CA1a. Images ont été prises toutes les 3 min pour 9 h. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 2 : Time-lapse imagerie de cellules MCF10CA1a stimulé avec EGF (5 ng/mL). Images ont été prises toutes les 3 min pour 9 h. s’il vous plaît cliquez ici pour visualiser cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
Les cellules tumorales progression migrent vers loin le tissu d’origine à envahir les tissus environnants et à métastaser dans des endroits éloignés,15. Migration des cellules d’une colonie de cellules peut être observée dans l’essai de la dot. Ici, le dosage de la dot est illustré en analysant le phénotype migratoire des cellules cancéreuses du sein humain en réponse à l’EGF.
Pour obtenir des résultats exacts et reproductibles plusieurs étapes dans la mise en place de la dot, les dosages sont critiques. Tout d’abord, le revêtement de la plaque détermine si et comment les cellules fortes peuvent adhérer à la plaque et si les cellules migrent. Il faut que le revêtement de la plaque avec le collagène IV ou autre matrice extracellulaire est homogène afin de minimiser la variabilité expérimentale. En outre, il doit s’assurer que les cellules étudiées attachent à migrent sur la plaque de revêtement et plusieurs expériences avec différentes matrices dans plusieurs concentrations pourraient être nécessaires pour optimiser les conditions de revêtement d’une lignée de cellules choisies. Deuxièmement, l’électrodéposition précise des cellules est cruciale pour la reproductibilité. L’empreinte de la chute de la cellule détermine la taille de la dot de la cellule ainsi que sa forme. Idéalement, la goutte est déposée sans toucher la surface de la pipette. La forme de la goutte est alors principalement déterminée par la tension superficielle de la surface de la plaque, ce qui entraîne une empreinte circulaire de diamètre reproductible. Par conséquent, le diamètre de la dot de la cellule peut être modifié en changeant le volume de suspension cellulaire plaqué.
Ainsi, plusieurs points doivent être examiner lorsque vous effectuez le test de la dot. Tout d’abord, la densité des cellules de la suspension cellulaire doit être ajustée à l’enduit, ainsi que pour le type de cellule utilisé. En général, si la goutte se propage plus larges, des densités plus élevées de cellules sont nécessaires aux cellules de la plaque en monocouches confluentes. Par ailleurs, plus de cellules doivent être plaquées pour obtenir une monocouche confluente si les cellules sont petites et ne se propagent pas autant que par rapport aux grosses cellules étalées. Deuxièmement, le test de point peut être adopté à plaque de différents formats et pour ce faire, la taille de point peut être adaptée aux plus petits puits en réduisant le volume de la dot plaqué, et si vous le souhaitez, des points plus gros peuvent être plaqués à l’aide de la baisse des volumes plus élevés. Troisièmement, certaines cellules lignes seront attache pas à la plaque dans les 30 minutes, auquel cas le temps de l’électrodéposition peut être prolongée jusqu'à 3 h. De même, le revêtement de la plaque doit être adapté aux cellules à migrer sur et il faut ne pas se gratter l’enduit lorsque les cellules de placage. Si les cellules ne pas attacher ou migrer sur la matrice choisie, autres types de revêtement, par exemple le collagène 1 ou la fibronectine, peuvent être explorées ou changé des concentrations de protéines de la matrice, temps d’incubation et une température d’incubation pendant le revêtement des plaques. Matrice extracellulaire adaptée pour les lignées cellulaires spécifiques peut-être se trouve dans la littérature.
Le dosage de la dot a très peu de limitations. C’est un test de migration à deux dimensions et ainsi ceci peut être considéré comme un désavantage par rapport aux essais en trois dimensions, qui sont toutefois plus difficile à réaliser que des tests à deux dimensions. Un problème majeur est peut-être que la prolifération des cellules peut influencer les résultats, surtout si rapide prolifération des lignées cellulaires sont utilisées et la migration cellulaire est évaluée sur de longues périodes de temps comme l’a fait ici pour l’analyse du diamètre de la colonie après 4 jours. De même, lors d’essais de gratter la fermeture d’un zéro blessure est affectée par la prolifération des cellules dans la feuille de la cellule ; et lors d’essais de chambre de Boyden, surtout si le sérum ou autres médiateurs qui induisent des proliférations cellulaires sont utilisés comme un facteur chimiotactique, prolifération accrue des cellules dans le bas du réservoir pouvant fausser des résultats. Cellule de suivi peut être utilisé spécifiquement observer le mouvement des cellules non-proliférantes. En outre, la prolifération des cellules peut être réduite par la famine (i) sérum comme fait ici et/ou (ii) l’inhibition de la mitose par addition de mitomycine ou autre prolifération inhibiteurs4,16. Pour réduire la prolifération des cellules, cependant, veiller à ne pas endommager les cellules au point qu’ils peuvent migrer n’est plus. Fait intéressant, nous avons trouvé une migration sans contrainte semblable d’analyse que la prolifération des cellules n’est pas corrélée avec le déplacement du bord, même si elle est impliquée dans le maintien de l’intégrité épithéliale feuille au cours de la migration4,5, 17. Cela ouvre une question intéressante : la prolifération des cellules du est une composante nécessaire de la migration d’une feuille de cellule ? Il est prévu que migration des feuilles de cellule avec adhérences cellule-cellule forte dans le milieu environnant sera négativement affectée si la prolifération est bloquée tout à fait, comme la feuille par la suite ne sera plus en mesure d’élargir et de soutenir la migration des cellules. À ce stade, les cellules doivent migration soit lente ou s’arrête, ou la feuille devrait perturber. À l’inverse, la migration des feuilles avec adhérences cellule-cellule faible peut être moins touchée que les cellules peuvent quitter la feuille pour migrer de façon indépendante, comme la diffusion au bord de la feuille épithélial. Ainsi, la migration cellulaire et la prolifération des cellules sont interdépendants, et toute tentative de bloquer la prolifération des cellules afin d’étudier la migration de la feuille doit être soigneusement examinée. Ainsi, analyser la migration de la feuille pour la plupart analyses au titre de la privation de sérum qui réduit mais n’abolit pas la migration cellulaire.
Autres essais de migration afin d’étudier la migration de la feuille sur une surface bidimensionnelle comprennent le scratch ou le dosage de la plaie et, plus récemment, essais de migration sans contrainte à l’aide de silicium ou de PDMS chambers et de pochoirs qui permettent l’électrodéposition de cellules dans des zones définies et migration sans contrainte des cellules dans la zone acellulaire après le retrait de la chambre ou au pochoir1,3,4,5,6,7,16. Ces derniers essais et le dosage de la dot offrent haute reproductibilité entre les mains d’utilisateurs inexpérimentés mais aussi expérimentés que le bordé de la cellule détermine la forme et la taille de la colonie. En revanche, le grattage de la couche cellulaire lors d’essais de gratter nécessite pratique et même dans les mains des experts certaines parties de la feuille peut être arraché par erreur si l'on utilise des lignées de cellules qui forment les monocouches serrés. Cette question est améliorée lorsque les gabarits ou les chambres de silicone sont utilisés pour placage les cellules, bien que nous avons observé blessant erronée des feuilles de la cellule après l’enlèvement des Ibidi chambres. Le dosage de la dot évite ce problème car les cellules sont plaqués en colonie et laisse pousser librement. Pour les mêmes raisons, le test point autorise également les cellules de migrer sur le revêtement non altéré, ce qui est facilement perturbé par grattage ou le retrait de la chambre/pochoir lors d’autres essais de migration. En outre, comme les cellules ne sont pas blessés par grattage ou la suppression des chambres/pochoirs, la mort des cellules et la libération associée de cytokines associé à la suppression des chambres/gabarits n’a aucun impact sur les migrations dans le dosage de la dot. Enfin, les cellules sont souvent trop plaqués dans scratch tests et essais en utilisant les gabarits ou les chambres. Ainsi, après compensation des cellules en grattant les hors ou en supprimant les barrières physiques qui entravent la migration cellulaire, la monocouche cellulaire détendra et cellule sont poussés, se répand dans la zone acellulaire sans migrer activement. En revanche, dans l’analyse de la dot, feuilles de cellule peuvent s’établir pendant la nuit avant migration est observée, et la migration cellulaire plutôt que de détente de la plaque de cellules peut être observée.
L’analyse de la dot, qui peut être facilement effectuée sans aucun équipement spécialisé, se prête à une gamme d’essais ultérieurs, y compris la coloration des cellules afin d’évaluer la morphologie des colonies brut et cellule diffusion8, immunomarquage8, Time-lapse imagerie et analyse ultérieure des données à l’aide de ImageJ, Matlab ou autre image analysis software13. Paramètres supplémentaires tels que la corrélation des vecteurs de voisins ou leurs trajectoires de séparation peuvent être évalués plus précisément décrivent la cohérence du mouvement cellulaire dans les feuilles13. Time-lapse imagerie peut également être combiné avec immunostaining et ImageJ pris en charge le suivi de la cellule afin de mieux connaître dans la migration cellulaire. Par exemple, points peuvent être immunocolorées pour les protéines du cytosquelette après imagerie Time-lapse et cellules peuvent ensuite suivre avec ImageJ pour analyser comment l’expression de ces protéines influe sur le phénotype migratoire des cellules. Une autre utilisation future est suivi de la cellule unique de cellules exprimant des protéines fluorescentes nucléaires. Important, le dosage de la dot peut être réalisé en plaques multipuits et est telle convenable pour un débit moyen à élevé d’imagerie, ce qui en fait un outil très abordable et facilement accessible à l’écran l’effet de drogues ou d’interférents sur la migration de la feuille.
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Disclosures
L’auteur n’a rien à divulguer.
Acknowledgments
L’auteur tient à remercier zemzmi Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo et Carole Parent pour lire et commenter sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu par le programme de recherche intra-muros du National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
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