Summary
Zellmigration ist entscheidend für Entwicklung, Gewebe-Wartung und Reparatur und Tumorgenese und wird durch Zytokine, Wachstumsfaktoren und Chemokine reguliert. Dieses Protokoll beschreibt Dot-Test, eine zweidimensionale, ungezwungene Migration Assay den wandernden Phänotyp der beigefügten, geschlossene Zelle Blätter als Reaktion auf microenvironmental Hinweise zu beurteilen.
Abstract
Auch wenn komplexe Organismen statisch erscheinen, sind ihre Gewebe unter einem kontinuierlichen Umsatz. Als Alter Zellen, bewegen sterben und werden durch neue Zellen ersetzt Zellen in den Geweben in gewissem Sinne dicht orchestrierte. Während der Entwicklung von Tumoren ist dieses Gleichgewicht gestört, und Tumorzellen lassen das Epithel des Ursprungs, der lokalen Mikroumgebung, ferne Orte bereisen und bilden schließlich metastasierten Tumoren an entfernten Standorten zu erobern. Die Dot-Assay ist ein einfache, zweidimensionale ungezwungene Migration Assay, Nettobewegung Zelle Blätter in einem zellfreien Bereich bewerten und Parameter der Zellwanderung mit Zeitraffer-Bildgebung zu analysieren. Hier der Dot-Test zeigt sich mit einem menschlichen invasive, Lunge koloniebildenden Brust-Krebs-Zell-Linie, MCF10CA1a, wandernden Reaktion der Zellen auf epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), analysieren die bekannt ist, bösartige Potenzial von Brustkrebs-Zellen zu erhöhen und die wandernden Phänotyp der Zellen ändern.
Introduction
Migration-Assays sind weit verbreitet, die invasive und metastatische Potential der Tumor Zellen in Vitrozu bewerten. Am häufigsten wird die Wunde oder Kratzer Assay verwendet, um Migration von epithelialen Blätter in eine Zelle gelöscht Bereich1,2,3bewerten. Um der Scratch-Test durchzuführen, sind Zellen in einem monomolekularen Film beschichtet und einen "Kratzer" oder zellfreie Bereich wird mit einer Pipettenspitze erstellt. Der Scratch-Test ist einfach mit handelsüblichen Gewebekultur Lieferungen einzurichten und im Multi-well-Platten, so dass für die Verarbeitung mehrerer Proben durchgeführt werden kann. Jedoch da der Kratzer hergestellt wird, Zellen sind physisch aus der Monolage entfernt und oft durchlaufen Zelltod. Extrazellulärer Matrix an der Platte befestigt ist darüber hinaus oft kratzen dabei beschädigt. Ebenso die Verwendung von Silizium wird eingefügt (z. B. Ibidi Kammern4) oder Schablonen5,6,7 zu mechanischen Störungen der Zellen und der teilweisen Entfernung der Matrixproteine Beschichtung führen die Platten. Ein weiterer Nachteil von Assays Überwachung Verschluss von Wunden oder Kratzer ist ihre begrenzte Zeit natürlich da Zellwanderung nur analysiert werden kann, bis der Kratzer geschlossen wird.
Bei der Durchführung des Dot-Tests, sind Zellen als eine kreisförmige Kolonie auf einer beschichteten oder unbeschichteten Platte8vergoldet. Die Gründe für diese Beschichtung-Strategie soll Zelle Blätter mit definierten Kanten zu erhalten, die dringen in die Zelle-freie Umgebung ohne zu stören die Kultur durch Abbau von Zellen oder Beilagen oder migrieren können. Das übergeordnete Ziel des Dot-Assays ist Migration der Zelle Blätter gemessen am Rande Verschiebung oder Kolonie Durchmesser, sowie hinsichtlich durchführen, Time-Lapse imaging zu analysieren, die wandernden Phänotyp der Zellen in räumlich-zeitliche Auflösung beobachten.
Zellwanderung kann durch eine Vielzahl von microenvironmental Signale wie Chemokine, Zytokine und Wachstumsfaktoren wie EGF beeinträchtigt werden. EGF ist ein Wachstumsfaktor, der übt seine biologische Wirkung über Bindung an seinen Rezeptor EGF-Rezeptor-9, und invasive und metastasierten Verhalten von Tumor Zellen4,9,10erhöht. Hier ist der Dot-Test zur Untersuchung EGF stimuliert Zellwanderung in eine menschliche invasive, Lunge koloniebildenden Brust Krebs Zelle Linie (MCF10CA1a)8,11,12.
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Protocol
(1) Beschichtung der Gerichte (Tag 1)
Hinweis: Stellen Sie sicher nicht, Fingerabdrücke oder Schmutz auf der Unterseite der Platte zu verlassen, beim Umgang.
- Tauen Sie Maus Kollagen IV auf Eis auf, und verdünnen Sie es mit 50 mM HCl (pH 1.3) um 3 mL einer 10 µg/mL Kollagen IV Lösung vorzubereiten.
Hinweis: Kollagen wird Niederschlag bei 37 ° C. Es ist daher wichtig, die Kollagen-Lösung bei niedriger Temperatur zu halten, beim Auftauen und mit ihm arbeiten. Vermeiden Sie wiederholte Frost-Tau-Wechseln durch die Vorbereitung entsprechend dimensionierte Aliquote und speichert sie bei-80 ° C. - Jede Vertiefung des 12-Well Glas Bodenplatten 250 µL Kollagen IV Lösung hinzu, und legen Sie sie in eine entsprechend dimensionierte, dicht schließender Kunststoff-Box. Feuchten Papiertuch über und um die Platten für die Herstellung einer feuchten Kammer und schließen Sie das Feld zu platzieren. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei Raumtemperatur.
Hinweis: Da nur das Wachstumsfeld werden beschichtet muss, es ist ausreichend, nur das Deckglas abdecken, die an der Unterseite der Platte, die mit Kollagen-Lösung verbunden ist (siehe Abbildung 1A, B für eine schematische Darstellung der Platte). - Am nächsten Morgen spülen Sie Platten mit entionisiertem H2O zweimal, nicht absorbiert Kollagen und Puffer zu entfernen. Richten Sie das Wasser an den Rand der Platte gut, nicht an den Rand von Platte unten und das Deckglas (wenn Wasser in diesem Bereich können sie Spritzen wird pipettiert) gebildet. Trocknen Sie die Platten in der Laminar-Flow-Haube an der Luft. Platten sofort verwenden oder für bis zu 5 Tage bei 4 ° C lagern.
Hinweis: Verschiedene Zelllinien benötigen unterschiedliche Beschichtung, z. B. Fibronektin oder Kollagen ich.
(2) Beschichtung der Dot-Assay (Tag 2)
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Vorbereitung der Zellsuspension
- Zur Vorbereitung der Zellsuspension verwenden Sie Zellen, die angebaut wurden in einer 60 mm Gewebe Kulturschale in DMEM/F12 Medium mit 5 % Pferd Serum zu 80 % Zusammenfluss ergänzt
- Spülen Sie die Zellen mit Kalzium und Magnesium-freie Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) einmal fügen Sie 500 µL Trypsin-EDTA (Raumtemperatur hinzu) und inkubieren Sie die Zellen für 3-5 min. im Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2, feuchte Atmosphäre.
- Aussetzen der freistehenden Zellen in 4,5 mL Kulturmedium zu stoppen Trypsin Aktivität und zählen eine 20 µL aliquoten die Zellsuspension in eine Hemocytometer.
- Pellet-die restlichen Zellen in einem 15 mL konische Röhrchen durch Zentrifugation bei 200 X g 3 min, Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Zellen in Kulturmedium bis 3 x 106 Zellen/mL.
Hinweis: Für andere Beschichtung Substraten und/oder Zelllinien, muss die optimale Zelldichte in einer Verdünnungsreihe hergestellt werden. 3 x 106 Zellen/mL empfiehlt sich als Ausgangspunkt.
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Galvanischen Zellen
- Statt einen Tropfen 10 µL Zellsuspension in der Mitte der einzelnen Deckglas des Kollagen IV beschichtet 12-Well Glas Bodenplatte ohne berühren oder kratzen die Beschichtung (Abbildung 1A, B). Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° C, feuchte Atmosphäre, damit die Zellen befestigen. Check-in einem inversen Mikroskop, dass die Zellen verbunden sind.
Hinweis: Dies kann am besten gesehen werden am Rand des Tropfens, wo kann Bildung von einem monomolekularen Film (Abbildung 1C) beobachtet werden. Bei Bedarf, brüten die Platte bis zu 3 h. sicher sein, dass die Luftfeuchtigkeit im Inkubator hoch genug ist, wie die Tropfen schnell austrocknen können. Wird eine Reduzierung des Volumens Tropfen während dieses Schritts eingehalten, fügen Sie PBS hinzu, die Zwischenräume zwischen den Brunnen um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen. - Waschen Sie vorsichtig die Brunnen mit 1 mL Kulturmedium zweimal um die fraktionslosen Zellen zu entfernen. Fügen Sie 1 mL Kulturmedium in jede Vertiefung. Check-in einem inversen Mikroskop, dass keine schwimmenden Zellen bleiben, sonst die Brunnen wieder waschen. Inkubieren Sie Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2, befeuchtete Atmosphäre, gut definierte Zelle Blätter zu erhalten.
Hinweis: Schwimmende Zellen sind wahrscheinlich auf die Platte wieder anzubringen und zu unerwünschten Zelle Kolonien bilden.
- Statt einen Tropfen 10 µL Zellsuspension in der Mitte der einzelnen Deckglas des Kollagen IV beschichtet 12-Well Glas Bodenplatte ohne berühren oder kratzen die Beschichtung (Abbildung 1A, B). Inkubieren Sie die Platte für 30 min bei 37 ° C, feuchte Atmosphäre, damit die Zellen befestigen. Check-in einem inversen Mikroskop, dass die Zellen verbunden sind.
3. Förderung der Zellen (Tag 3)
- Überprüfen Sie alle Brunnen mit einem inversen Mikroskop um diese Zelle sicherzustellen, die Kolonien richtig gewachsen sind. Ggf. Markieren Sie ungeeignete Brunnen und verwenden Sie sie nicht.
- Beschriften Sie jede Vertiefung der Platte entsprechend für jede Bedingung untersucht. Führen Sie jede Bedingung in doppelt oder dreifach.
- Ändern Sie das Medium, um die Zellen in DMEM/F12 mit 0,1 % Pferd Serum (hungernden Medium) verhungern 3 h bevor Zellen stimuliert werden.
- Stimulieren die Zellen durch Zugabe von EGF (Endkonzentration 5 ng/mL) oder andere gewünschte Mediatoren und vorsichtig mischen das Medium mit einer 1 mL Micropipettor oder durch Schütteln der Plattenrandes.
- Inkubieren Sie die Platte für 1-4 Tage, Rand Verschiebung und Rand Kontur zu beobachten, wie in Abschnitt 4.1 beschrieben oder Zeitraffer Bildgebung durchführen, wie in Abschnitt 4.2 beschrieben.
(4) Visualisierung der Zelle Kolonien und Zellwanderung
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Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung zur Messung der Koloniewachstum (Tag 4-7)
- Zellen in 70 % igem Ethanol (1 mL/Na) für ~ 2 min zu beheben.
- Kerne mit Hämatoxylin (1 mL/gut), ~ 2 min. Fleck.
- Waschen Zellen mit Leitungswasser (1 mL/Na) bis Kerne sind blau, 5-10 Minuten.
- Fleck Zytoplasma mit Eosin (1 mL/gut), ~ 2 min.
- Spülen Sie mit entionisiertem Wasser (1 mL/Na).
Hinweis: Hämatoxylin und Eosin Lösungen gesammelt und verwendet werden können mehrere Male, bis die Färbung ohnmächtig wird. - Trocknen Sie Platte an der Luft.
- Drehen Sie die Platte und gemessen Sie der Punkt-Durchmesser mit einem Lineal. Alternativ die Platte mit einer Kamera fotografieren und analysieren des Punkt-Durchmessers in ImageJ.
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Zeitraffer-Mikroskopie (Tag3)
- Schalten Sie das Inkubator-Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Füllen Sie den Luftbefeuchter mit dH2O. Adjust CO2 auf 5 %. Stellen Sie sicher, dass die Inkubator Kammer befeuchtet ist und dass die motorisierte Bühne frei bewegen kann. Die Inkubator-Kammer in der Nähe und lassen Sie das Mikroskop auf 37 ° c einstellen
Hinweis: Das Mikroskop verwendet (siehe Tabelle Material) hier sollte auf 37 ° C für mindestens 3 h erhitzt werden, bevor die Zellen abgebildet werden, um zu vermeiden, driften die Schärfentiefe. - Die Platte auf der Bühne des Mikroskops Inkubator und richten Sie die Bühne-Liste. Bild zwei gegenüberliegenden Kanten und das Zentrum von jeder Zelle Punkt (Abb. 1A).
- Nehmen Sie Bilder alle 3 min für 15-24 h mit 10 X-Objektiv. Laden Sie die Daten und fahren Sie mit Bildanalyse in einem Programm Ihrer Wahl, z.B.ImageJ oder Matlab.
- Schalten Sie das Inkubator-Mikroskop und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C. Füllen Sie den Luftbefeuchter mit dH2O. Adjust CO2 auf 5 %. Stellen Sie sicher, dass die Inkubator Kammer befeuchtet ist und dass die motorisierte Bühne frei bewegen kann. Die Inkubator-Kammer in der Nähe und lassen Sie das Mikroskop auf 37 ° c einstellen
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Representative Results
Die Dot-Assay präsentiert hier (Abbildung 1) erfolgte mittels invasiver, Lunge koloniebildenden Brustkrebs-Zellen (MCF10CA1a) als Modellsystem. Der Dot-Test ergibt hoch reproduzierbare Zelle Punkte selbst in der Hand von Anfängern, so dass es eine bequeme und leicht auszuführende Assay (Abbildung 1D). Die Dot-Assay kombiniert mit er Färbung oder Zeitraffer Bildgebung und nachfolgenden Partikel Image Velocimetry (PIV) ermöglicht die Untersuchung der verschiedenen Migrationsparametern einschließlich Verschiebung der epithelialen Kanten, Zelle Geschwindigkeit und Zelle Direktionalität als Zellen an den Rändern von einem epithelialen Blatt Wandern Sie in eine Zelle-freie Zone. Zunächst ergab Phase Kontrast Bildgebung der Zelle Punkte, dass invasive, Lunge Kolonie bildenden Brustkrebs-Zellen (MCF10CA1a) einen mesenchymalen Phänotyp nach Stimulation mit EGF pflegen. Allerdings werden einzelne Zellen, so dass das Blatt immer häufiger in EGF-stimulierten Zellen Punkte (Abbildung 2, Pfeile) beobachtet. Die Reaktion der MCF10CA1a Zellen auf EGF wurden weiter durch HE Färbung der Kulturen, die für 4 Tage mit EGF gefördert wurden. EGF-Stimulation führte in der Tat eine erhöhte Kolonie Durchmesser (Abbildung 3). Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass die Migration von EGF stimulierte Zellen verändert werden könnte.
Daher wurde der Dot-Test als nächstes eingesetzt, um eine genauere Analyse des Phänotyps der MCF10CA1a Zelle Blätter dynamische Migration durchführen. Zellen an den Blechkanten wurden für 9 h nach Stimulation von Zellen mit EGF (Video 1 und Video 2) abgebildet und Bilder wurden dann von PIV in Matlab4,13,14analysiert. PIV ergab, dass EGF von 0,45 µm/min in Kontrollzellen Zelle Geschwindigkeit (Abb. 4A) bis 0,63 µm/min erhöht. Zur gleichen Zeit EGF Direktionalität der Zellen erhöht, und wird dies durch eine Reduzierung der Variabilität der Zelle Direktionalität (eckige Spread) von 0,95 in Kontrolle Kulturen 0,79 im EGF-stimulierten Kulturen (Abbildung 4B). EGF erhöht die radiale Verschiebung der epithelialen Kante mehr als 9 h 257 µm bis 356 µm (Abbildung 4), wie auch er nach 4 Tagen (Abbildung 3) Färbung beobachtet wurde. So zeigt die Verwendung des Dot-Assays in Kombination mit verschiedenen nachfolgenden Tests, dass EGF Migration an den Rändern der MCF10CA1a Zellen Blätter ändert sich derart, dass die Zelle Geschwindigkeit und Direktionalität erhöht werden, was zu einer erhöhten Kolonie Radius.
Abbildung 1: Imaging des Dot Tests. (A, B) Zellen sind als kreisförmige Kolonie in der Mitte der unteren Platte Brunnen Glas beschichtet. Für Migrationsanalyse werden Bilder auf zwei gegenüberliegenden Kanten sowie das Zentrum der Kolonie (A) getroffen. (C) Dunkelfeld Bild der Zelle Punkt während der Beschichtung (links) und in höhere Vergrößerung (Phasenkontrast) zeigt der Rand des Tropfens und dem Rand der Zelle dot nach Zellen an der Platte (Mitte). Angeschlossene Zellen sind flach und polygonale, fraktionslosen Zellen Runden (rechts). (D) Der Durchmesser der Punkte ist sehr reproduzierbar. Punkte wurden unmittelbar nach der Beschichtung und abgebildet, bevor Zellen angeregt wurden und der Durchmesser bestimmt mit ImageJ. Die Punktgröße ist sehr reproduzierbar im Rahmen eines Experiments sowie zwischen verschiedenen Benutzern und wenig Training ist erforderlich, um gute Kenntnisse in der galvanischen Zelle Punkte zu gewinnen (E = mehr als 10 Jahre Erfahrung in der Gewebekultur, ich = weniger als 4 Wochen Erfahrung im Gewebe c inborn). n = 12 Punkte pro Gruppe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: EGF moduliert die morphologischen Phänotyp der MCF10CA1a Zellen. MCF10CA1a Zellen hungerten für 3 h in DMEM/F12 mit 0,1 % Pferd Serum ergänzt, bevor sie mit EGF stimuliert wurden (5 ng/mL). Am Rande des EGF-stimulierten Kolonien tendenziell Einzelzellen aus dem Bogen (Pfeile) zu migrieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : EGF erhöht Nettozuwachs der Zelle Kolonien. MCF10CA1a Zellen hungerten für 3 h in DMEM/F12 Medium mit 0,1 % Pferd Serum ergänzt, bevor sie mit EGF stimuliert wurden (5 ng/mL). 4 Tage später, wurden Zellen Ethanol fixiert und gefärbt mit Hämatoxylin und Eosin. EGF-stimulierten Punkte haben einen höheren Durchmesser nach 4 Tagen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : EGF moduliert die wandernden Phänotyp der MCF10CA1a Zellen. MCF10CA1a Zellen hungerten für 3 h in DMEM/F12 Medium mit 0,1 % Pferd Serum ergänzt, bevor sie mit EGF stimuliert wurden (5 ng/mL). Zellen wurden alle 3 min abgebildet, für 9 h. nachfolgende Partikelanalyse Image Velocimetry in Matlab13durchgeführt wurde. Geschwindigkeitswerte repräsentieren die Durchschnittsgeschwindigkeit im Laufe der Zeit für jedes Feld. Eckige Ausbreitung der Geschwindigkeitsvektoren wurde wie folgt berechnet:
wo 
, und reicht von 0 (hoher Richtwirkung) bis 
(geringe Richtwirkung). Eine Abnahme der eckigen Ausbreitung gilt eine Erhöhung des Direktionalität. Radiale Verschiebung errechnete sich durch Subtraktion des Kolonie Radius bei t = 0 h aus der Kolonie Radius bei t = 9 h. EGF-Stimulation der MCF10CA1a Zelle Punkte führte zu erhöhten Zelle Geschwindigkeit (A; obere Leiste), eckige Ausbreitung verringert oder erhöht Direktionalität (B, Mitte Panel) und erhöhte Kolonie Radius (C; Bodenplatte). Darstellung von Daten Mittelwert ± SEM von n = 3 Experimente. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1: Time-Lapse Bildgebung unstimulierte MCF10CA1a Zellen. Bilder wurden alle 3 min für 9 h Bitte klicken Sie hier aufgenommen, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 2: Time-Lapse imaging von MCF10CA1a Zellen stimuliert mit EGF (5 ng/mL). Bilder wurden alle 3 min für 9 h Bitte klicken Sie hier aufgenommen, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Migrieren Sie bei Fortschreiten der Tumorzellen vom Gewebe des Ursprungs das umliegende Gewebe einzudringen und Metastasen in entfernten Standorten15. Wanderung von Zellen von einer Zelle Kolonie kann in der Dot-Probe beobachtet werden. Hier ist der Dot-Test dargestellt, durch die Analyse des wandernden Phänotyps von menschlichen Brustkrebszellen in Reaktion auf EGF.
Um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten mehrere Schritte bei der Einrichtung des Punktes sind Assays entscheidend. Die Beschichtung der Platte bestimmt zunächst, ob und wie starke Zellen an der Platte haften können und wenn Zellen wandern. Darauf sollte geachtet werden, dass die Beschichtung der Platte mit Kollagen IV oder andere extrazelluläre Matrix homogene, experimentelle Variabilität zu minimieren. Darüber hinaus muss sichergestellt werden, dass die Zellen untersucht beimessen und Wandern auf die beschichtete Platte, und mehrere Versuche mit verschiedenen Matrizen in mehreren Konzentrationen notwendig sein können, die Ansatzbedingungen für eine gewählte Zelllinie zu optimieren. Zweitens wird die genaue Beschichtung der Zellen für Reproduzierbarkeit von entscheidender Bedeutung. Die Grundfläche des Tropfens Zelle bestimmt die Größe der Zelle Punkt als auch seine Form. Im Idealfall wird die Tropfen ohne die Pipettenspitze berühren der Oberfläche gelegt. Die Form des Tropfens wird dann meist durch die Oberflächenspannung der Plattenoberfläche, was zu einer kreisförmigen Grundfläche von reproduzierbaren Durchmesser bestimmt. Infolgedessen kann der Durchmesser des Punktes Zelle verändert werden, durch Ändern der Lautstärke der Zellsuspension überzogen.
So sind einige Punkte zu berücksichtigen den Dot-Test durchführen. Erstens muss die Zelldichte der Zellsuspension auf der Beschichtung sowie auf den Zelltyp verwendet angepasst werden. Im Allgemeinen, wenn die Tropfen größere Margen, sind höhere Zelldichten Platte Zellen in konfluierende Monolagen erforderlich. Darüber hinaus müssen weitere Zellen überzogen werden, um eine konfluierende Monolage zu erhalten, wenn Zellen klein sind und nicht viel im Vergleich zu großen, ausladenden Zellen verbreiten. Zweitens der Dot-Test angenommen werden kann, um verschiedene Plattenformate, dafür, die Punktgröße kann angepasst werden in kleinere Vertiefungen durch Verringerung des Volumens des Punktes vernickelt und falls gewünscht, können größere Punkte mithilfe von Drop Mengenausweitungen überzogen werden. Drittens kann einige Zellen, die Linien nicht die Platte innerhalb von 30 min, in welchem Fall die Beschichtung Zeit beimessen werden bis zu 3 h verlängert werden. Ebenso muss die Beschichtung der Platte geeignet für Zellen auf Migration und sollte darauf geachtet werden, nicht um die Beschichtung zu kratzen, wenn die Zellen Plattieren. Wenn Zellen nicht anhängen oder auf der gewählten Matrix migrieren, andere Arten der Beschichtung, z. B. Kollagen 1 oder Fibronektin, erkundet werden oder Konzentrationen von Matrixproteine, Inkubationszeiten und Inkubation Temperaturen während der Beschichtung der Platten verändert. Geeigneter extrazellulärer Matrix für spezielle Zelllinien könnte in der Literatur gefunden werden.
Der Dot-Test hat einige Einschränkungen. Es ist ein zweidimensionales Migration-Assay und somit kann dies als als ein Nachteil im Vergleich zu dreidimensionalen Assays, die jedoch sind mehr schwierig durchzuführen als zweidimensionale Assays. Ein großes Problem ist vielleicht, dass Zellproliferation Ergebnisse beeinflussen kann, insbesondere dann, wenn schnell proliferierenden Zelllinien verwendet und Zellwanderung bemisst sich über längere Zeiträume wie hier für die Analyse von der Kolonie Durchmesser nach 4 Tagen gemacht wurde. Ebenso ist im Scratch-Assays Zellproliferation innerhalb der Zelle Blatt die Schließung der Wunde Kratzer betroffen; und in Boyden Kammer Assays, insbesondere dann, wenn Serum oder andere Mediatoren, die Zelle Proliferationen führen als eine Lockstoffgradient dienen erhöhten Zellproliferation in der unteren Kammer kann Ergebnisse verzerren. Einzelne Zelle tracking lässt sich Bewegung nicht wuchernden Zellen gezielt zu beobachten. Darüber hinaus kann die Zellproliferation durch (i) Serum Hunger wie hier getan und/oder (Ii) Hemmung der Mitose durch Zugabe von Mitomycin oder andere Verbreitung Inhibitoren4,16reduziert werden. Um Zellproliferation zu reduzieren, muss jedoch darauf nicht Schaden die Zellen in einem Maße geachtet werden, die sie nicht mehr migrieren können. Interessanterweise fanden wir in einer ähnlichen ungezwungene Migration assay, dass Zellproliferation nicht mit Rand Hubraum korreliert ist, obwohl es beteiligt ist, bei der Aufrechterhaltung der Integrität der epithelialen Blatt während der Migration4,5, 17. Es öffnet sich eine interessante Frage: ist Zellproliferation ein notwendiger Bestandteil der Migration von einer Zelle Blatt? Es wird erwartet, dass Migration der Zelle Blätter mit starken Zellezelle Verwachsungen in die Umgebung negativ beeinflusst wird, wenn Vermehrung völlig blockiert ist, da das Blatt schließlich nicht mehr in der Lage, zu erweitern und die Wanderung von Zellen zu unterstützen. An dieser Stelle die Zellen sollten entweder langsam oder nicht mehr Migration, oder das Blatt sollte stören. Im Gegensatz dazu die Migration aus Blättern mit niedrigen Zellezelle Verwachsungen möglicherweise weniger betroffenen Zellen das Blatt, um unabhängig, wie Streuung an den Rand des Blattes epithelialen Migration verlassen können. Damit die Zellwanderung und Zellproliferation bedingen, und jeder Versuch der Sperrung Zellproliferation, Blatt Migration zu studieren muss sorgfältig geprüft werden. Somit sind Assays analysiert Blatt Migration meist unter Serum verhungern die reduziert, aber nicht abzuschaffen Zellwanderung durchgeführt.
Anderen Migration-Assays, Blatt Migration auf zweidimensionalen Flächen zu studieren gehören der Kratzer oder Wunde Assay, und vieles mehr vor kurzem, ungezwungene Migration-Assays mit Silikon oder PDMS Kammern und Schablonen, die Beschichtung von Zellen in bestimmten Bereichen zu ermöglichen und ungezwungene Wanderung von Zellen in den zellfreien Bereich nach der Entfernung der Kammer oder Schablone1,3,4,5,6,7,16. Diese letztere Assays und der Dot-Test bieten hohen Reproduzierbarkeit in der Hand des erfahrenen als auch unerfahrene Anwender die Zelle Beschichtung der Form und Größe der Kolonie bestimmt. Im Gegensatz dazu kratzen der zellulären Monolayer in Scratch Tests erfordert Übung, und selbst in den Händen von Experten teilen des Blattes kann werden abgerissen fälschlicherweise wenn Zelllinien, die enge Monolagen bilden verwendet werden. Dieses Problem wird verbessert, wenn Silikon Kammern oder Schablonen für die Beschichtung der Zellen verwendet werden, obwohl wir fehlerhafte Verwundung der Zelle Blätter nach Entfernung der Ibidi Kammern beobachtet. Dot-Assay vermeidet dieses Problem, da die Zellen sind in eine Kolonie vergoldet und durfte frei wachsen. Aus den gleichen Gründen ermöglicht der Dot-Test auch die Zellen migrieren auf die unveränderte Beschichtung, die leicht durch Kratzen oder Entfernung der Kammer/Schablone in anderen Migration Assays gestört ist. Darüber hinaus, wie Zellen nicht durch Kratzen oder Entfernung der Kammern/Schablonen, verletzt Zelltod und die zugehörigen Freisetzung von Zytokinen, die Verbindung mit dem Abbau von Kammern/Schablonen hat keine Auswirkungen auf Migration in der Dot-Test. Zu guter Letzt sind Zellen oft übermäßig plattiert in Scratch Assays und Tests mit Kammern oder Schablonen. So, nachdem clearing Zellen durch sie abkratzen oder die physische Barrieren, die Zellwanderung behindern, die Zelle Monolage entspannen wird und Zelle geschoben, verbreiten in den zellfreien Bereich ohne aktiv zu migrieren. Im Gegensatz dazu können in der Dot-Assay Zelle Blätter über Nacht etablieren bevor Migration beobachtet und Zellwanderung statt Entspannung des Blattes Zelle beobachtet werden.
Die Dot-Test, die ohne spezielle Ausrüstung durchgeführt werden kann, eignet sich für eine Reihe von nachfolgenden Tests, einschließlich Färbung der Zellen zur Bewertung Brutto Kolonie Morphologie und Zelle Streuung8, Immunostaining8, Zeitraffer Bildgebung und anschließende Datenanalyse mit ImageJ, Matlab oder anderen Bild-Analyse-Software-13. Zusätzliche Parameter beschreiben wie Korrelation der benachbarten Vektoren oder ihre Trennung Flugbahnen mehr genau beurteilt werden können, die Kohärenz der Zellbewegung innerhalb Blätter13. Time-Lapse Bildgebung kombinierbar mit Immunostaining und ImageJ unterstützt Handy Tracking um weitere Einblick in Zellwanderung. Zum Beispiel können Punkte Immunostained für Zellskelett Proteine nach dem Time-Lapse Imaging, und Zellen können dann mit ImageJ um zu analysieren, wie die Expression dieser Proteine den wandernden Phänotyp der Zellen beeinflusst nachverfolgt werden. Eine weitere zukünftige Verwendung ist Einzelzelle Tracking von Zellen, die nukleare fluoreszierende Proteine zum Ausdruck bringen. Allem der Dot-Test kann in Multi-well-Platten durchgeführt werden und ist so geeignet für mittlere bis hohe Durchsatz imaging, so dass es leicht zugänglich und sehr günstigen Instrument die Wirkung von Drogen oder ShRNAs auf Blatt Migration auf den Bildschirm.
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Disclosures
Der Autor hat nichts preisgeben.
Acknowledgments
Der Autor bedankt sich bei Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo und Carole Parent fürs Lesen und kommentieren auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Intramurale Research Program des National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
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