Summary
कोशिका प्रवास विकास के लिए आवश्यक है, ऊतक रखरखाव और मरंमत, और tumorigenesis, और विकास कारकों द्वारा विनियमित है, chemokines, और साइटोकिंस । इस प्रोटोकॉल का वर्णन डॉट परख, एक दो आयामी, स्वैच्छिक प्रवास परख के प्रवासी phenotype का आकलन करने के लिए संलग्न, microenvironmental cues के जवाब में एकजुट सेल चादरें ।
Abstract
हालांकि जटिल जीवों स्थिर दिखाई देते हैं, उनके ऊतकों एक सतत कारोबार के तहत कर रहे हैं । कोशिकाओं के रूप में उंर, मरो, और नई कोशिकाओं द्वारा प्रतिस्थापित कर रहे हैं, कोशिकाओं को एक कसकर आर्केस्ट्रा तरीके से ऊतकों के भीतर ले जाते हैं । ट्यूमर के विकास के दौरान, इस संतुलन परेशान है, और ट्यूमर कोशिकाओं के मूल उपकला छोड़ स्थानीय microenvironment आक्रमण करने के लिए, सुदूर स्थलों की यात्रा करने के लिए, और अंत में दूर साइटों पर मेटास्टेटिक ट्यूमर फार्म । डॉट परख एक सरल, दो आयामी स्वैच्छिक प्रवास परख है, के लिए एक सेल में सेल शीट्स के नेट आंदोलन मुक्त क्षेत्र का आकलन है, और सेल प्रवास के मापदंडों का विश्लेषण समय चूक इमेजिंग का उपयोग कर । यहां, डॉट परख एक मानव इनवेसिव, फेफड़े के स्तन कैंसर सेल लाइन, MCF10CA1a, बनाने के लिए ' कोशिकाओं प्रवासी एपिडर्मल वृद्धि फैक्टर (EGF) है, जो स्तन कैंसर की कोशिकाओं के घातक क्षमता बढ़ाने के लिए जाना जाता है प्रतिक्रिया का विश्लेषण कालोनी का उपयोग कर प्रदर्शन किया है और कोशिकाओं के प्रवासी phenotype को झूमने पर मजबूर कर दिया ।
Introduction
प्रवास परख व्यापक रूप से इन विट्रो मेंट्यूमर कोशिकाओं के आक्रामक और मेटास्टेटिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है । सबसे अधिक, घाव या खरोंच परख एक सेल में उपकला चादरें के प्रवास का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है क्षेत्र को मंजूरी दे दी1,2,3। करने के लिए खरोंच परख प्रदर्शन, कोशिकाओं को एक monolayer में चढ़ाया जाता है और एक "खरोंच" या सेल मुक्त क्षेत्र एक पिपेट टिप के साथ बनाया जाता है । खरोंच परख के लिए सामांयतः उपलब्ध ऊतक संस्कृति की आपूर्ति के साथ स्थापित आसान है और बहु में प्रदर्शन किया जा सकता है अच्छी तरह से प्लेटें, कई नमूनों के प्रसंस्करण के लिए अनुमति दी । हालांकि, खरोंच के रूप में किया जाता है, कोशिकाओं को शारीरिक रूप से monolayer से हटा दिया जाता है और अक्सर कोशिका मृत्यु से गुजरना । इसके अलावा, extracellular मैट्रिक्स प्लेट से जुड़ी अक्सर scratching प्रक्रिया के दौरान क्षतिग्रस्त है । इसी तरह, सिलिकॉन आवेषण का उपयोग (जैसे Ibidi चेंबर्स4के रूप में) या stencils5,6,7 कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन और मैट्रिक्स के आंशिक हटाने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं प्रोटीन कोटिंग के लिए इस्तेमाल किया प्लेट. एक और नुकसान की परख की निगरानी बंद करने के घावों या खरोंच उनके सीमित समय पाठ्यक्रम है, के रूप में सेल प्रवास ही विश्लेषण किया जा सकता है जब तक खरोंच बंद है ।
डॉट परख प्रदर्शन में, कोशिकाओं एक लेपित या unकोट प्लेट8पर एक परिपत्र कॉलोनी के रूप में चढ़ाया जाता है । इस चढ़ाना रणनीति के लिए तर्क को परिभाषित किनारों के साथ सेल शीट प्राप्त है, कि पलायन या कोशिकाओं या आवेषण के हटाने से संस्कृति परेशान बिना आसपास के सेल मुक्त क्षेत्रों में आक्रमण कर सकते हैं । डॉट परख के समग्र लक्ष्य को सेल शीट के प्रवास के रूप में बढ़त विस्थापन या कॉलोनी व्यास, के रूप में अच्छी तरह के रूप में समय-चूक इमेजिंग करने के लिए उच्च spatio-लौकिक संकल्प में कोशिकाओं के प्रवासी phenotype का विश्लेषण करने के लिए मापा निरीक्षण है ।
सेल प्रवासन chemokines, साइटोकिंस जैसे microenvironmental cues की एक किस्म से प्रभावित हो सकते हैं, और EGF जैसे विकास कारकों । EGF एक वृद्धि कारक है कि इसकी रिसेप्टर, EGF रिसेप्टर9के लिए बाध्यकारी के माध्यम से अपने जैविक प्रभाव डालती है, और ट्यूमर कोशिकाओं के4,9,10के आक्रामक और मेटास्टेटिक व्यवहार बढ़ जाती है. यहां, डॉट परख एक मानव इनवेसिव में सेल प्रवास उत्तेजित EGF अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, फेफड़ों स्तन कैंसर सेल लाइन (MCF10CA1a)8,11,12बनाने कॉलोनी ।
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Protocol
1. व्यंजन की कोटिंग (Day 1)
नोट: जब यह हैंडलिंग प्लेट के नीचे पर उंगलियों के निशान या गंदगी छोड़ने के लिए नहीं सुनिश्चित करें ।
- गल माउस कोलेजन पर चतुर्थ बर्फ, और यह ५० mM एचसीएल (पीएच १.३) के साथ पतला करने के लिए तैयार करने के लिए 3 मिलीलीटर की एक 10 µ g/एमएल कोलेजन iv समाधान ।
नोट: कोलेजन ३७ डिग्री सेल्सियस पर वेग होगा । यह इसलिए एक कम तापमान पर कोलेजन समाधान रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि गल और इसके साथ काम कर रहे । उचित आकार aliquots तैयार करने और उन्हें-८० डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के द्वारा दोहराया फ्रीज-गल चक्र से बचें । - 12 की एक अच्छी तरह से गिलास नीचे प्लेटें के लिए २५० µ एल कोलेजन IV समाधान जोड़ें और उंहें एक उचित आकार, तंग बंद प्लास्टिक बॉक्स में जगह है । गीला कागज तौलिया पर और प्लेटों के आसपास जगह के लिए एक आर्द्र चैंबर का निर्माण और बॉक्स बंद करो । कमरे के तापमान पर रात भर प्लेटें ।
नोट: के रूप में केवल विकास के क्षेत्र के लिए लेपित की जरूरत है, यह केवल कवर पर्ची, जो थाली के नीचे से जुड़ा हुआ है कवर करने के लिए पर्याप्त है कोलेजन समाधान के साथ ( चित्रा 1ए, प्लेट की एक योजनाबद्ध के लिए बी देखें) । - अगली सुबह, दो बार गैर अवशोषित कोलेजन और बफर को दूर करने के लिए2हे के साथ प्लेट कुल्ला । प्लेट के किनारे के लिए पानी को अच्छी तरह से प्रत्यक्ष, प्लेट नीचे और coverslip द्वारा गठित बढ़त के लिए नहीं (यदि पानी इस क्षेत्र में pipetted है यह छप जाएगा) । हवा-लामिना फ्लो हुड में प्लेटें सूखी । प्लेटों का तुरंत उपयोग करें या 5 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कर दें ।
नोट: अलग सेल लाइनों ऐसे fibronectin या कोलेजन के रूप में विभिंन कोटिंग, की आवश्यकता हो सकती है ।
2. चढ़ाना बिंदी परख (2 दिवस)
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सेल सस्पेंशन की तैयारी
- सेल निलंबन तैयार करने के लिए, DMEM/F12 मध्यम में एक ६० मिमी ऊतक संस्कृति डिश में उगाया गया है कि कोशिकाओं का उपयोग करें 5% हार्स सीरम के लिए ८०% संगम के साथ पूरक
- कैल्शियम के साथ कोशिकाओं कुल्ला-और मैग्नीशियम मुक्त है Dulbecco फॉस्फेट खारा (DPBS) एक बार, जोड़ें ५०० µ l trypsin-EDTA (कमरे के तापमान), और एक मशीन में ३७ ° c, 5% CO2, humidified वातावरण में 3-5 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन ।
- trypsin गतिविधि रोकने के लिए ४.५ एमएल कल्चरल मीडियम में रेग्युलेटर सेल को सस्पेंड करें और एक hemocytometer में सेल सस्पेंशन के 20 µ l aliquot को गिनने दें ।
- 3 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में शेष कोशिकाओं गोली, supernatant महाप्राण, और संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को reसस्पैंड 3 एक्स 106 कोशिकाओं/एमएल/
नोट: अंय कोटिंग सब्सट्रेट और/या सेल लाइनों के लिए, इष्टतम कोशिका घनत्व एक कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला में स्थापित किया जाना चाहिए । 3 x 106 सेल/एमएल एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में सिफारिश की है ।
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चढ़ाना कोशिकाओं
- एक 10 µ एल सेल निलंबन की एक कवर पर्ची के केंद्र पर प्लेस कोलेजन IV लेपित 12-अच्छी तरह से शीशे के नीचे प्लेट बिना छुए या कोटिंग scratching (चित्रा 1ए, बी) । ३७ डिग्री सेल्सियस, humidified वातावरण में 30 मिनट के लिए थाली मशीन, संलग्न करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति देने के लिए । एक औंधा माइक्रोस्कोप कि कोशिकाओं संलग्न कर रहे हैं में जाँच करें ।
नोट: यह सबसे अच्छा ड्रॉप, जहां एक monolayer के गठन मनाया जा सकता है के किनारे पर देखा जा सकता है (चित्रा 1सी) । यदि आवश्यक हो, प्लेट मशीन 3 ज. सुनिश्चित करें कि मशीन में नमी काफी उच्च है के रूप में बूंदें बाहर जल्दी सूख सकता है । यदि इस चरण के दौरान ड्रॉप की मात्रा में कमी देखी जाती है, तो आर्द्रता बढ़ाने के लिए पंजाबियों को कुओं के बीच रिक्तियों को जोड़ें. - धीरे से 1 मिलीलीटर संस्कृति मध्यम दो बार के साथ धो गैर संलग्न कोशिकाओं को हटाने के लिए । एक अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर संस्कृति माध्यम जोड़ें । एक उल्टे सूक्ष्मदर्शी में जाँच लें कि कोई तैरते हुए कोशिकाएँ रह जाएँ, अन्यथा कुएँ फिर से धो लें. ३७ ° c, 5% CO2, humidified वातावरण में, अच्छी तरह से परिभाषित कक्ष पत्रकों को प्राप्त करने के लिए कक्ष बनाना ।
नोट: अस्थायी कोशिकाओं प्लेट को फिर से संलग्न करने के लिए और अवांछित सेल कॉलोनियों के रूप में होने की संभावना है.
- एक 10 µ एल सेल निलंबन की एक कवर पर्ची के केंद्र पर प्लेस कोलेजन IV लेपित 12-अच्छी तरह से शीशे के नीचे प्लेट बिना छुए या कोटिंग scratching (चित्रा 1ए, बी) । ३७ डिग्री सेल्सियस, humidified वातावरण में 30 मिनट के लिए थाली मशीन, संलग्न करने के लिए कोशिकाओं की अनुमति देने के लिए । एक औंधा माइक्रोस्कोप कि कोशिकाओं संलग्न कर रहे हैं में जाँच करें ।
3. उत्तेजक कोशिकाओं (दिवस 3)
- सभी कुओं की जांच एक व्युत्क्रम माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि सेल कालोनियों ठीक हो गए हैं । यदि आवश्यक हो, चिह्नित अनुपयुक्त कुओं और उंहें इस्तेमाल नहीं करते ।
- हर हालत की जांच के लिए उचित रूप से प्लेट की एक अच्छी तरह से लेबल । डुप्लिकेट या तपसिल में प्रत्येक शर्त चलाएं ।
- DMEM/F12 में कोशिकाओं को भूखा करने के लिए माध्यम बदलें ०.१% घोड़े सीरम (मध्यम भूखे) 3 एच से पहले कोशिकाओं को उत्तेजित कर रहे हैं ।
- EGF के अलावा कोशिकाओं को उत्तेजित (5 एनजी/एमएल अंतिम एकाग्रता) या अंय वांछित मध्यस्थों और धीरे से एक 1 मिलीलीटर micropipettor का उपयोग कर या थाली घूमता द्वारा मध्यम मिश्रण ।
- 1-4 दिनों के लिए थाली मशीन धार विस्थापन और धार समोच्च ४.१ धारा में वर्णित के रूप में निरीक्षण करने के लिए या धारा ४.२ में वर्णित के रूप में समय चूक इमेजिंग प्रदर्शन करते हैं ।
4. सेल कालोनियों और सेल माइग्रेशन के दृश्य
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Hematoxylin-eosin (वह) को मापने कॉलोनी विकास धुंधला (4-7 दिवस)
- फिक्स कोशिकाओं में ७०% इथेनॉल के लिए (1 मिलीलीटर/
- hematoxylin के साथ दाग नाभिक (1 मिलीलीटर/), ~ 2 मिनट ।
- नल के पानी के साथ कोशिकाओं को धो (1 मिलीलीटर/जब तक नाभिक नीले, 5-10 मिनट हैं ।
- eosin के साथ दाग कोशिका (1 मिलीलीटर/), ~ 2 मिनट ।
- पानी के साथ कुल्ला (1 मिलीलीटर/
नोट: Hematoxylin और eosin समाधान एकत्र किया जा सकता है और कई बार इस्तेमाल किया जब तक धुंधला हो जाता है बेहोश हो जाता है । - हवा सूखी थाली ।
- थाली फ्लिप और एक शासक के साथ डॉट व्यास उपाय । वैकल्पिक रूप से, एक कैमरा के साथ प्लेट की तस्वीरें ले लो, और ImageJ में डॉट व्यास का विश्लेषण ।
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समय चूक माइक्रोस्कोपी (दिवस 3)
- मशीन माइक्रोस्कोप पर स्विच और ३७ डिग्री सेल्सियस के तापमान को समायोजित । humidifier को डीएच2ओ के साथ भरें ।2 को 5% समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि मशीन चैंबर humidified और मोटर चालित चरण स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकते हैं । मशीन चैंबर बंद करो और माइक्रोस्कोप ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए समायोजित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
नोट: माइक्रोस्कोप (सामग्री की तालिका देखें) यहां इस्तेमाल किया ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए गर्म किया जाना चाहिए से पहले कोशिकाओं के लिए ध्यान के बहाव से बचने के लिए imaged कर रहे हैं । - मशीन माइक्रोस्कोप के मंच पर थाली प्लेस और मंच की सूची की स्थापना की । छवि दो का विरोध किनारों और प्रत्येक कोशिका के केंद्र डॉट (चित्रा 1ए) ।
- हर 3 मिनट छवियों ले लो, 15-24 एच के लिए 10x उद्देश्य का उपयोग कर । डेटा डाउनलोड करें और पसंद के किसी प्रोग्राम में छवि विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें, उदा, ImageJ या Matlab ।
- मशीन माइक्रोस्कोप पर स्विच और ३७ डिग्री सेल्सियस के तापमान को समायोजित । humidifier को डीएच2ओ के साथ भरें ।2 को 5% समायोजित करें । सुनिश्चित करें कि मशीन चैंबर humidified और मोटर चालित चरण स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित कर सकते हैं । मशीन चैंबर बंद करो और माइक्रोस्कोप ३७ डिग्री सेल्सियस के लिए समायोजित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
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Representative Results
डॉट परख यहां प्रस्तुत (चित्रा 1) आक्रामक का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया था, फेफड़ों के एक मॉडल प्रणाली के रूप में स्तन कैंसर की कोशिकाओं (MCF10CA1a) बनाने कॉलोनी । डॉट परख पैदावार अत्यधिक प्रतिलिपि सेल डॉट्स भी beginners के हाथ में, यह एक सुविधाजनक और आसान परख निष्पादित (चित्रा 1डी) बना रही है । डॉट वह धुंधला के साथ संयुक्त परख, या समय चूक इमेजिंग और बाद में कण छवि velocimetry (PIV) उपकला किनारों के विस्थापन सहित विभिन्न माइग्रेशन मापदंडों के अध्ययन की अनुमति देता है, कोशिका की गति, और सेल दिशात्मकता किनारों पर कोशिकाओं के रूप में एक उपकला पत्रक के एक सेल मुक्त क्षेत्र में स्थानांतरित. शुरू में, कोशिका डॉट्स के चरण कंट्रास्ट इमेजिंग से पता चला कि आक्रामक, फेफड़े कॉलोनी बनाने स्तन कैंसर कोशिकाओं (MCF10CA1a) EGF के साथ उत्तेजना के बाद एक mesenchymal phenotype बनाए रखने के । हालांकि, एकल कक्ष छोड़ने पत्रक EGF-उत्तेजित कक्ष डॉट्स (चित्र 2, तीर) में अधिक बार देखा गया है । EGF को MCF10CA1a कोशिकाओं की प्रतिक्रिया आगे वह संस्कृतियों कि 4 दिनों के लिए EGF के साथ उत्तेजित थे की धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया । दरअसल, EGF-उत्तेजना एक बढ़ी हुई कॉलोनी व्यास (चित्रा 3) में हुई । इन टिप्पणियों से संकेत मिलता है कि EGF उत्तेजित कोशिकाओं के प्रवास बदल सकता है ।
इसलिए, डॉट परख MCF10CA1a कक्ष पत्रकों की डायनेमिक माइग्रेशन phenotype का एक अधिक विस्तृत विश्लेषण करने के लिए अगला उपयोग किया गया था । शीट किनारों पर कोशिकाओं EGF (वीडियो 1 और वीडियो 2) के साथ कोशिकाओं की उत्तेजना के बाद 9 एच के लिए imaged थे और छवियां तो Matlab4,13,14में PIV द्वारा विश्लेषण किया गया । PIV से पता चला कि EGF सेल की गति बढ़ाता है (चित्रा 4ए) ०.६३ µm/मिनट से ०.४५ µm/ एक ही समय में, EGF कोशिकाओं की दिशात्मकता में वृद्धि हुई है, और यह सेल दिशात्मकता की परिवर्तनशीलता की कमी से संकेत दिया है (कोणीय प्रसार) ०.९५ से नियंत्रण संस्कृतियों में ०.७९ को EGF-उत्तेजित संस्कृतियों (चित्रा 4बी) । EGF २५७ µm से ३५६ µm (चित्रा 4) के लिए 9 से अधिक उपकला बढ़त के रेडियल विस्थापन वृद्धि हुई है, के रूप में भी वह 4 दिनों के बाद धुंधला (चित्रा 3) द्वारा मनाया गया था । इस प्रकार, विभिंन अनुवर्ती परख के साथ संयोजन में डॉट परख के उपयोग से पता चलता है कि EGF MCF10CA1a कोशिकाओं शीट के किनारों पर प्रवास बदल ऐसे है कि सेल की गति और दिशात्मकता बढ़ रहे हैं, एक वृद्धि हुई कॉलोनी त्रिज्या में जिसके परिणामस्वरूप ।
चित्र 1: इमेजिंग डॉट परख । (A, B) कक्ष ग्लास नीचे प्लेट कुओं के केंद्र में एक परिपत्र कॉलोनी के रूप में चढ़ाया जाता है । माइग्रेशन विश्लेषण के लिए, छवियों को दो विरोध किनारों के साथ-साथ कॉलोनी के केंद्र (A) में ले जाया जाता है । (ग) चढ़ाना के दौरान सेल डॉट की डार्क फील्ड छवि (बाएं), और उच्च आवर्धन (चरण कंट्रास्ट) में ड्रॉप के किनारे दिखा और कक्ष (केंद्र) से जुड़ी कोशिकाओं के बाद कोशिका के किनारे डॉट । अनुलग्न कक्ष सपाट और बहुभुजीय होते हैं, जबकि गैर-अनुलग्न कक्ष गोल (दाएं) होते हैं । (D) डॉट्स का व्यास अत्यधिक प्रतिलिपि है । डॉट्स चढ़ाना के बाद तुरंत imaged थे और पहले कोशिकाओं को उत्तेजित और व्यास ImageJ का उपयोग कर निर्धारित किया गया । डॉट आकार एक प्रयोग के भीतर अत्यधिक प्रतिलिपि है और साथ ही विभिंन उपयोगकर्ताओं और छोटे प्रशिक्षण के बीच सेल डॉट्स चढ़ाना में प्रवीणता हासिल करने की आवश्यकता है (ई = ऊतक संस्कृति में अनुभव के 10 से अधिक वर्षों, मैं = कम से 4 ऊतक में अनुभव के सप्ताह सी ulture) । n = प्रति समूह 12 डॉट्स । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: EGF MCF10CA1a कोशिकाओं के रूपात्मक phenotype को ढा रहा है । MCF10CA1a कोशिकाओं के लिए भूखे थे 3 DMEM/F12 के साथ पूरक ०.१% घोड़ा सीरम से पहले वे EGF के साथ उत्तेजित (5 एनजी/ EGF के किनारे पर उत्तेजित कालोनियों एकल कोशिकाओं को चादर (तीर) से बाहर पलायन करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3 : EGF सेल कालोनियों की शुद्ध वृद्धि बढ़ जाती है । MCF10CA1a कोशिकाओं के लिए भूखे थे 3 DMEM/F12 मध्यम में एच ०.१% हार्स सीरम के साथ पूरक इससे पहले कि वे EGF के साथ उत्तेजित (5 एनजी/ 4 दिन बाद, कोशिकाओं को स्थिर और Hematoxylin और Eosin के साथ दाग इथेनॉल थे । EGF-उत्तेजित डॉट्स 4 दिनों के बाद एक उच्च व्यास है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 4 : EGF MCF10CA1a कोशिकाओं के प्रवासी phenotype को ढा रहा है । MCF10CA1a कोशिकाओं के लिए भूखे थे 3 DMEM/F12 मध्यम में एच ०.१% हार्स सीरम के साथ पूरक इससे पहले कि वे EGF के साथ उत्तेजित (5 एनजी/ कोशिकाओं को 9 h. बाद कण छवि velocimetry विश्लेषण के लिए हर 3 मिनट imaged थे Matlab13में प्रदर्शन किया गया । गति मान प्रत्येक फ़ील्ड के लिए समय के साथ औसत गति का प्रतिनिधित्व करते हैं । वेग वैक्टर के कोणीय प्रसार के रूप में गणना की गई:
जहां, और 0 से पर्वतमाला (उच्च दिशात्मकता) के लिए (कम दिशात्मकता) । 
एक कोणीय प्रसार में कमी दिशात्मकता में वृद्धि माना जाता है । रेडियल विस्थापन टी = 9 एच में कॉलोनी त्रिज्या से टी = 0 एच पर कॉलोनी त्रिज्या घटाकर द्वारा गणना की गई । MCF10CA1a सेल डॉट्स की EGF-उत्तेजना कोशिका की गति में वृद्धि हुई (A; ऊपरी पैनल), कोणीय प्रसार या वृद्धि की दिशात्मकता में कमी आई (B; मध्य पैनल), और बढ़ी हुई कॉलोनी त्रिज्या (C; नीचे पैनल) । डेटा का प्रतिनिधित्व मतलब ± SEM n = 3 प्रयोगों की । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
वीडियो 1: उत्तेजित MCF10CA1a कोशिकाओं की समय-चूक इमेजिंग । छवियां 9 घंटे के लिए हर 3 मिनट ले जाया गया कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
वीडियो 2: MCF10CA1a कोशिकाओं की समय-चूक इमेजिंग EGF के साथ उत्तेजित (5 एनजी/ छवियां 9 घंटे के लिए हर 3 मिनट ले जाया गया कृपया यहां क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
ट्यूमर प्रगति कोशिकाओं के दौरान आसपास के ऊतकों और metastasize दूर साइटों के लिए आक्रमण करने के लिए मूल के ऊतक से दूर पलायन15. सेल कॉलोनी से दूर कोशिकाओं के प्रवास को डॉट परख में देखा जा सकता है । इधर, डॉट परख EGF के जवाब में मानव स्तन कैंसर कोशिकाओं के प्रवासी phenotype का विश्लेषण करके सचित्र है ।
सटीक और replicable परिणाम प्राप्त करने के लिए सेट-अप डॉट की परख में कई कदम महत्वपूर्ण हैं । सबसे पहले, थाली की कोटिंग निर्धारित करता है कि और कैसे मजबूत कोशिकाओं थाली का पालन कर सकते हैं और यदि कोशिकाओं को माइग्रेट. ध्यान रखा जाना चाहिए कि कोलेजन चतुर्थ या अन्य extracellular मैट्रिक्स के साथ प्लेट की कोटिंग प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए समरूप है. इसके अलावा, यह सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि कोशिकाओं की जांच करने के लिए देते है और लेपित प्लेट पर माइग्रेट, और कई सांद्रता में विभिंन मैट्रिक्स के साथ कई प्रयोगों के लिए एक चुना सेल लाइन के लिए कोटिंग शर्तों का अनुकूलन आवश्यक हो सकता है । दूसरा, कोशिकाओं के सटीक चढ़ाना reproducibility के लिए महत्वपूर्ण है । सेल ड्रॉप के पदचिह्न सेल डॉट के आकार के साथ ही इसके आकार को निर्धारित करता है । आदर्श रूप में, ड्रॉप पिपेट टिप सतह को छूने के बिना रखा जाता है । ड्रॉप के आकार तो ज्यादातर प्लेट की सतह की सतह तनाव से निर्धारित होता है, प्रतिलिपि व्यास के एक परिपत्र पदचिह्न में जिसके परिणामस्वरूप । नतीजतन, कोशिका डॉट का व्यास सेल निलंबन मढ़वाया की मात्रा बदलकर बदला जा सकता है ।
इस प्रकार, कई बिंदुओं पर विचार किया जा करने के लिए जब डॉट परख प्रदर्शन कर रहे हैं । सबसे पहले, सेल निलंबन के सेल घनत्व के लिए कोटिंग के रूप में के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया सेल प्रकार के लिए समायोजित किया जाना चाहिए । सामांय में, यदि ड्रॉप व्यापक फैलता है, उच्च कोशिका घनत्व को धाराप्रवाह monolayers में प्लेट कोशिकाओं की जरूरत है । इसके अलावा, और अधिक कोशिकाओं को एक धाराप्रवाह monolayer प्राप्त करने के लिए चढ़ाया जा करने की जरूरत है अगर कोशिकाओं को छोटे होते है और ज्यादा प्रसार नहीं के रूप में बड़े, कोशिकाओं के प्रसार की तुलना में । दूसरे, डॉट परख अलग प्लेट प्रारूपों के लिए अपनाया जा सकता है, और इस के लिए, डॉट आकार की मात्रा को कम करके छोटे कुओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और यदि वांछित, बड़े डॉट्स उच्च ड्रॉप संस्करणों का उपयोग करके चढ़ाया जा सकता है । तीसरे, कुछ सेल लाइनों 30 मिनट है, जो मामले में चढ़ाना समय 3 एच तक बढ़ाया जा सकता है के भीतर थाली में संलग्न नहीं होगा । इसी प्रकार, प्लेट की कोटिंग कोशिकाओं पर माइग्रेट करने के लिए और देखभाल करने के लिए कोटिंग खरोंच जब कोशिकाओं चढ़ाना नहीं लिया जाना चाहिए करने के लिए उपयुक्त होना चाहिए । यदि कोशिकाओं या संलग्न नहीं चुना मैट्रिक्स, कोटिंग के अंय प्रकार पर माइग्रेट, उदाहरण के लिए कोलेजन 1 या fibronectin, पता लगाया जा सकता है, या मैट्रिक्स प्रोटीन की सांद्रता, गर्मी बार, और प्लेटों की कोटिंग के दौरान गर्मी तापमान बदल दिया । विशिष्ट सेल लाइनों के लिए उपयुक्त extracellular मैट्रिक्स साहित्य में पाया जा सकता है ।
डॉट परख कुछ सीमाएं हैं । यह एक दो आयामी प्रवास परख है और इस प्रकार यह एक नुकसान के रूप में तीन आयामी परख, जो कर रहे है की तुलना में माना जा सकता है, तथापि, और अधिक करने के लिए दो आयामी परख प्रदर्शन मुश्किल है । एक प्रमुख समस्या शायद यह है कि सेल प्रसार परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं, विशेष रूप से यदि तेजी से proliferating सेल लाइनों का उपयोग किया जाता है और सेल माइग्रेशन अब समय अवधि पर मूल्यांकन के रूप में कॉलोनी व्यास के विश्लेषण के लिए यहां किया गया था 4 दिनों के बाद । इसी तरह, खरोंच परख में एक खरोंच घाव के बंद सेल शीट के भीतर सेल प्रसार से प्रभावित है; और Boyden चैंबर परख में, विशेष रूप से यदि सीरम या अंय मध्यस्थों कि कोशिका प्रसार प्रेरित एक chemoattractant के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, नीचे चैंबर में वृद्धि की कोशिका प्रसार परिणाम विषम कर सकते हैं । एकल सेल ट्रैकिंग विशेष रूप से गैर proliferating कोशिकाओं के आंदोलन का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इसके अलावा, सेल प्रसार द्वारा कम किया जा सकता है (i) सीरम भुखमरी के रूप में यहां किया और/या (ii) मीतोमयसीं या अंय प्रसार अवरोधकों के अलावा द्वारा बँटवारा के निषेध4,16. सेल प्रसार को कम करने के लिए, तथापि, देखभाल के लिए एक हद तक है कि वे अब माइग्रेट कर सकते है कोशिकाओं को नुकसान नहीं लिया जाना चाहिए । दिलचस्प है, हम एक समान स्वैच्छिक प्रवास परख में पाया कि कोशिका प्रसार बढ़त विस्थापन के साथ संबंधित नहीं है, हालांकि यह प्रवास के दौरान उपकला शीट अखंडता को बनाए रखने में शामिल है4,5, 17. यह एक दिलचस्प सवाल खुलता है: सेल जखीरे एक सेल शीट के प्रवास का एक आवश्यक घटक है? यह आशा की जाती है कि सेल शीट के मजबूत सेल-सेल आसंजन के साथ आसपास के वातावरण में, यदि प्रसार पूरी तरह से अवरुद्ध हो जाता है, तो पत्रक अंततः कक्षों के माइग्रेशन का विस्तार और समर्थन करने में सक्षम नहीं होगा । इस बिंदु पर, कक्ष या तो धीमा या माइग्रेशन बंद करना चाहिए, या पत्रक को बाधित करना चाहिए । इसके विपरीत, कम सेल-सेल आसंजन के साथ पत्रकों का माइग्रेशन कम प्रभावित हो सकता है क्योंकि कक्ष स्वतंत्र रूप से माइग्रेट करने के लिए पत्रक को छोड़ सकते हैं, जैसे कि उपकला शीट के किनारे पर छितराना । इस प्रकार, सेल प्रवास और सेल प्रसार निर्भर हैं, और सेल प्रसार को रोकने के किसी भी प्रयास पत्रक माइग्रेशन अध्ययन करने के लिए सावधानी से विचार किया जाना चाहिए । इस प्रकार, परख पत्रक प्रवास का विश्लेषण ज्यादातर सीरम भुखमरी जो कम कर देता है के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन सेल प्रवास को समाप्त नहीं करता है ।
अंय प्रवास परख के लिए दो आयामी सतहों पर चादर प्रवास का अध्ययन खरोंच या घाव परख और, अधिक हाल ही में, स्वैच्छिक प्रवास सिलिकॉन या PDMS कक्षों और stencils जो परिभाषित क्षेत्रों में कोशिकाओं की चढ़ाना अनुमति का उपयोग कर परख शामिल है और कक्ष या स्टैंसिल1,3,4,5,6,7,16को हटाने के बाद सेल-मुक्त क्षेत्र में कक्षों का स्वैच्छिक माइग्रेशन । इन बाद परख और डॉट परख अनुभव के हाथ में उच्च reproducibility पेशकश के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अनुभवहीन उपयोगकर्ताओं के रूप में सेल चढ़ाना आकार और कॉलोनी के आकार निर्धारित करता है । इसके विपरीत, खरोंच परख में सेलुलर monolayer के scratching अभ्यास की आवश्यकता है, और यहां तक कि पत्रक के विशेषज्ञों के कुछ हिस्सों के हाथ में ग़लती से फट सकता है अगर कोशिका लाइनों कि फार्म तंग monolayers उपयोग किया जाता है । इस मुद्दे पर सुधार हुआ है जब सिलिकॉन कक्षों या stencils कोशिकाओं चढ़ाना के लिए उपयोग किया जाता है, हालांकि हम Ibidi कक्षों को हटाने के बाद सेल शीट की गलत घायल मनाया । डॉट परख इस मुद्दे को टाल के रूप में कोशिकाओं को एक कॉलोनी में चढ़ाया जाता है और स्वतंत्र रूप से विकसित करने की अनुमति दी । एक ही कारण के लिए, डॉट परख भी कोशिकाओं को अनछुए कोटिंग है, जो आसानी से खरोंच या अंय प्रवास परख में चैंबर/स्टैंसिल के हटाने से परेशान है पर विस्थापित करने की अनुमति देता है । इसके अलावा, के रूप में कोशिकाओं को खरोंच या कक्षों को हटाने से घायल नहीं कर रहे है/stencils, सेल मौत और चैंबरों के हटाने के साथ जुड़े साइटोकिंस के संबद्ध जारी/stencils डॉट परख में प्रवास पर कोई प्रभाव नहीं है । अंत में, कोशिकाओं को अक्सर खरोंच परख और कक्षों या stencils का उपयोग कर परख में चढ़ाया जाता है । इस प्रकार, उंहें खरोंच या शारीरिक बाधाओं है कि सेल प्रवास बाधा हटाने के द्वारा कोशिकाओं समाशोधन के बाद, सेल monolayer आराम करेंगे और सेल धक्का दिया, सक्रिय रूप से पलायन के बिना सेल मुक्त क्षेत्र में फैल जाएगा । इसके विपरीत में, डॉट परख में, सेल शीट खुद को स्थापित कर सकते है रातोंरात प्रवास से पहले मनाया जाता है, और कक्ष के बजाय कक्ष प्रवास की छूट को देखा जा सकता है ।
डॉट परख, जो किसी भी विशेष उपकरण के बिना आसानी से किया जा सकता है, बाद में परख की एक सीमा को उधार देता है, कोशिकाओं के दाग सहित सकल कॉलोनी आकृति विज्ञान और सेल का आकलन8, immunostaining8, समय चूक इमेजिंग, और अनुवर्ती डेटा ImageJ, Matlab, या अंय छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर13का उपयोग विश्लेषण । ऐसे पड़ोसी वैक्टर या उनके जुदाई पथ के सहसंबंध के रूप में अतिरिक्त मानकों को और अधिक ठीक13चादरें के भीतर सेल आंदोलन के जुटना वर्णन मूल्यांकन किया जा सकता है । टाइम-चूक इमेजिंग भी सेल माइग्रेशन में आगे की जानकारी हासिल करने के लिए immunostaining और ImageJ समर्थित सेल ट्रैकिंग के साथ जोड़ा जा सकता है । उदाहरण के लिए, डॉट्स समय-चूक इमेजिंग के बाद cytoskeletal प्रोटीन के लिए immunostained किया जा सकता है, और कोशिकाओं को तो ImageJ का उपयोग कर इन प्रोटीन की अभिव्यक्ति कैसे कोशिकाओं के प्रवासी phenotype प्रभावित का विश्लेषण करने के लिए ट्रैक किया जा सकता है । एक अंय भविष्य का उपयोग कोशिकाओं है कि परमाणु फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस के एकल सेल ट्रैकिंग है । महत्वपूर्ण बात, डॉट परख बहु में प्रदर्शन किया जा सकता है अच्छी तरह से प्लेटें और मध्यम करने वाली उच्च प्रवाह इमेजिंग के लिए इस तरह के उपयुक्त है, यह एक आसानी से सुलभ और बहुत सस्ती उपकरण के लिए दवाओं या shRNAs के प्रभाव पर चादर प्रवास स्क्रीन बना ।
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Disclosures
लेखक का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखक को पढ़ने और पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए Bhagawat सुब्रह्मण्यम, यी (जेसन) चांग, पॉल Randazzo, और Carole जनक शुक्रिया अदा करना चाहता है । इस काम को राष्ट्रीय कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों के अंदर रिसर्च प्रोग्राम ने समर्थन दिया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
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