Summary
Migrazione delle cellule è essenziale per lo sviluppo, manutenzione dei tessuti e riparazione e tumorigenesi ed è regolata da fattori di crescita, chemochine e citochine. Questo protocollo descrive il dosaggio di dot, un'analisi bidimensionale, senza vincoli di migrazione per valutare il fenotipo migratore di strati delle cellule allegata, coesa in risposta a stimoli microambientali.
Abstract
Anche se gli organismi complessi appaiono statici, i loro tessuti sono sotto un continuo turnover. Come cellule età, muoiono e sono sostituite da nuove cellule, cellule spostano all'interno dei tessuti in maniera ben orchestrata. Durante lo sviluppo del tumore, questo equilibrio è disturbato, e lasciano le cellule del tumore dell'epitelio di origine per invadere il microambiente locale, viaggiare in luoghi distanti e in definitiva formare tumori metastatici ai luoghi distanti. Il metodo di dot è un semplice, bidimensionale migrazione senza vincoli, per valutare il movimento netto di strati delle cellule in una zona senza cellula e per analizzare i parametri della migrazione cellulare usando la formazione immagine di time-lapse. Qui, il dosaggio di dot è dimostrato utilizzando un umani dilaganti, la linea cellulare del cancro al seno, MCF10CA1a, di formazione di colonie di polmone per analizzare la risposta migratoria delle cellule di fattore di crescita epidermico (EGF), che è noto per aumentare il potenziale maligno delle cellule di cancro al seno e per modificare il fenotipo migratorio delle cellule.
Introduction
Saggi di migrazione sono ampiamente utilizzati per valutare il potenziale invasivo e metastatico delle cellule del tumore in vitro. Più comunemente, la ferita o dosaggio zero viene utilizzato per valutare la migrazione epiteliale fogli in una cella deselezionata zona1,2,3. Per eseguire l'analisi di gratta e Vinci, le cellule sono placcate in un monostrato e un "graffio" o zona senza cellula viene creato con un puntale. Il dosaggio zero è facile da configurare con i rifornimenti di coltura del tessuto comunemente disponibili e possa essere eseguito in piastre multi-pozzetto, permettendo per la lavorazione dei campioni multipli. Tuttavia, come è fatto il graffio, cellule sono fisicamente da strato monomolecolare e spesso subiscono la morte delle cellule. Inoltre, fissato alla piastra di tabella extracellulare è spesso danneggiata durante il processo di graffio. Allo stesso modo, l'uso di silicone inserti (ad esempio Ibidi chambers4) o degli stampini5,6,7 può portare alla rottura meccanica delle cellule e la parziale rimozione delle proteine della matrice utilizzato per il rivestimento del piatti. Un altro svantaggio delle analisi monitoraggio della chiusura delle ferite o graffi è loro corso di tempo limitato, come la migrazione delle cellule può essere analizzata solo fino a quando il graffio è chiuso.
Nell'esecuzione del saggio di dot, le cellule sono placcate come Colonia circolare su una piastra con o senza rivestimento8. La spiegazione razionale per questa strategia di placcatura è di ottenere strati delle cellule con bordi definiti, che possono migrare o invadere nelle zone circostanti senza cellula senza disturbare la cultura tramite rimozione di cellule o inserti. L'obiettivo generale del dosaggio dot è di osservare la migrazione degli strati delle cellule misurata dal bordo spostamento o diametro di Colonia, nonché eseguire imaging time-lapse per analizzare il fenotipo migratorio delle cellule in alta risoluzione spazio-temporale.
Migrazione delle cellule può essere influenzata da una varietà di stimoli microambientali come chemochine, citochine e fattori di crescita come EGF. L'EGF è un fattore di crescita che esercita i suoi effetti biologici attraverso il legame al suo recettore, il recettore di EGF9e aumenta il comportamento invasivo e metastatico del tumore le cellule4,9,10. Qui, il dosaggio di dot è usato per studiare EGF stimolata migrazione cellulare in una colonia umana di polmone per il dilagante, formando al seno cancro cella linea (MCF10CA1a)8,11,12.
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Protocol
1. rivestimento di piatti (giorno 1)
Nota: Assicurarsi di non lasciare impronte digitali o sporcizia sul fondo della piastra nel maneggiarlo.
- Scongelare il collagene del mouse IV sul ghiaccio e diluirlo con 50mm HCl (pH 1.3) per preparare 3 mL di 10 µ g/mL collagene IV soluzione.
Nota: Collagene precipiterà a 37 ° C. Pertanto è importante mantenere la soluzione di collagene a bassa temperatura durante lo scongelamento e lavorare con esso. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento di preparare aliquote di dimensioni appropriate e la loro conservazione a-80 ° C. - Aggiungere 250 µ l di soluzione di collagene IV ad ogni pozzetto 12-pozzetti inferiore delle lastre di vetro e metterli in una scatola di plastica di dimensione appropriate, chiusura ermetica. Posizionare il tovagliolo di carta bagnato sopra e intorno ai piatti del produrre una camera umida e chiudere la finestra. Incubare le piastre durante la notte a temperatura ambiente.
Nota: Come solo l'area di crescita deve essere rivestito, è sufficiente coprire solo il coprioggetto, che è attaccato al fondo della piastra, con soluzione di collagene (Vedi Figura 1A, B per una schematica della piastra). - Mattina successiva, sciacquare piastre con deionizzata di H2O due volte per rimuovere il tampone e collagene non assorbito. Dirigere l'acqua verso il bordo della piastra ben, non al bordo formato sul fondo del piatto e il vetrino coprioggetti (se acqua è pipettato in questa zona che esso verrà spruzzata). Asciugare le piastre nella cappa a flusso laminare. Utilizzare piastre immediatamente o conservare a 4 ° C fino a 5 giorni.
Nota: Diverse linee cellulari potrebbero richiedere diversi rivestimento, quali fibronectina o collagene I.
2. placcatura del dosaggio di Dot (giorno 2)
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Preparare la sospensione cellulare
- Per preparare la sospensione cellulare, utilizzare le cellule che sono state coltivate in un piatto di coltura del tessuto-60mm in DMEM/F12 supplementato con 5% di siero equino alla confluenza di 80%
- Sciacquare le cellule con la soluzione salina tamponata con fosfato di calcio e magnesio-free Dulbecco (DPBS) una volta, aggiungere 500 µ l tripsina-EDTA (temperatura ambiente) e incubare le cellule per 3-5 min in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata.
- Sospendere le cellule indipendente in 4,5 mL di coltura per arrestare l'attività della tripsina e contare 20 aliquota µ l della sospensione delle cellule in un emocitometro.
- Appallottolare le celle rimanenti in una provetta conica da 15 mL mediante centrifugazione a 200 x g per 3 min, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in coltura per 3 x 106 cellule/mL.
Nota: Per altri substrati di rivestimento e/o linee cellulari, la densità cellulare ottimale deve essere stabilita in una serie di diluizioni. 3 x 106 cellule/mL è consigliato come punto di partenza.
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Cellule di placcatura
- Posto una goccia di 10 µ l di sospensione cellulare al centro di ogni vetrino coprioggetto del collagene IV rivestito vetro 12-pozzetti piastra inferiore senza toccare o graffiare il rivestimento (Figura 1A, B). Incubare la piastra per 30 min a 37 ° C, atmosfera umidificata, per consentire le celle da collegare. Check-in un microscopio invertito che le cellule siano collegate.
Nota: Questo può essere meglio visto al bordo della goccia, dove la formazione di un monostrato possa essere osservati (Figura 1C). Se necessario, incubare la piastra fino a 3 h. Assicurarsi che l'umidità nell'incubatrice è abbastanza alto come le gocce possono asciugare rapidamente. Se si osserva una riduzione del volume goccia durante questo passaggio, è possibile aggiungere PBS negli spazi tra i pozzetti per aumentare l'umidità. - Lavare delicatamente i pozzetti con 1 mL di terreno di coltura due volte per rimuovere le cellule non iscritti. Aggiungere 1 mL terreno di coltura ad ogni pozzetto. Il check-in un microscopio invertito che nessuna cellula galleggiante rimangono, in caso contrario lavare i pozzetti nuovamente. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO2, atmosfera umidificata, per ottenere strati delle cellule ben definito.
Nota: Le cellule galleggianti sono probabili di ri-collegare alla piastra e per formare le colonie delle cellule indesiderate.
- Posto una goccia di 10 µ l di sospensione cellulare al centro di ogni vetrino coprioggetto del collagene IV rivestito vetro 12-pozzetti piastra inferiore senza toccare o graffiare il rivestimento (Figura 1A, B). Incubare la piastra per 30 min a 37 ° C, atmosfera umidificata, per consentire le celle da collegare. Check-in un microscopio invertito che le cellule siano collegate.
3. stimolare le cellule (giorno 3)
- Controllare tutti i pozzetti utilizzando un microscopio inverso per garantire tale cella colonie sono cresciuti correttamente. Se necessario, contrassegnare pozzi inadatti e non li uso.
- Etichettare ogni pozzetto della piastra in modo appropriato per ogni condizione di indagato. Eseguire ogni condizione in doppio o triplice copia.
- Modificare il mezzo per morire di fame le cellule in DMEM/F12 contenente 0,1% di siero equino (media affamato) 3 h prima che le cellule sono stimolate.
- Stimolano le cellule mediante aggiunta di EGF (concentrazione finale di 5 ng/mL) o altri mediatori desiderate e mescolare delicatamente il mezzo usando una micropipetta di 1 mL o agitando la piastra.
- Incubare la piastra per 1-4 giorni per osservare lo spostamento del bordo e bordo contorno come descritto nella sezione 4.1 o eseguire time-lapse imaging come descritto nel paragrafo 4.2.
4. visualizzazione delle colonie delle cellule e migrazione cellulare
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Ematossilina-eosina (lui) per misurare la crescita di Colonia (giorno 4-7)
- Difficoltà cellule in etanolo al 70% (1 mL/pozzetto) per ~ 2 min.
- Macchia i nuclei con ematossilina (1 mL/pozzetto), ~ 2 min.
- Cellule di lavare con acqua di rubinetto (1 mL/pozzetto) fino a quando i nuclei sono blue, 5-10 min.
- Macchia di citoplasma con eosina (1 mL/pozzetto), ~ 2 min.
- Risciacquare con acqua deionizzata (1 mL/pozzetto).
Nota: Soluzioni di ematossilina ed eosina possono essere raccolti e utilizzati più volte fino a quando la colorazione diventa debole. - Asciugare la piastra.
- Capovolgere la piastra e misurare il diametro del puntino con un righello. In alternativa, prendere le immagini della piastra con una macchina fotografica e analizzare il diametro del puntino in ImageJ.
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Time-lapse microscopia (giorno 3)
- Accendere il microscopio di incubatrice e regolare la temperatura a 37 ° C. Riempire l'umidificatore con dH2O. Adjust la CO2 al 5%. Assicurarsi che la camera dell'incubatore è umidificata e che il tavolino motorizzato può muoversi liberamente. Chiudere la camera incubatrice e consentire il microscopio regolare a 37 ° C.
Nota: Il microscopio (Vedi la tabella materiali) utilizzato qui deve essere riscaldato a 37 ° C per almeno 3 ore prima che le cellule sono Imaging per evitare alla deriva della messa a fuoco. - Posizionare la piastra sul palco del microscopio incubatrice e impostare l'elenco di fase. Due bordi opposti immagine e al centro di ogni punto della cella (Figura 1A).
- Prendere immagini ogni 3 min, per 15-24 h utilizzando l'obiettivo 10x. Scaricare i dati e procedere con l'analisi di immagine in un programma di scelta, ad esempio, ImageJ o Matlab.
- Accendere il microscopio di incubatrice e regolare la temperatura a 37 ° C. Riempire l'umidificatore con dH2O. Adjust la CO2 al 5%. Assicurarsi che la camera dell'incubatore è umidificata e che il tavolino motorizzato può muoversi liberamente. Chiudere la camera incubatrice e consentire il microscopio regolare a 37 ° C.
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Representative Results
Il dosaggio di puntino qui presentato (Figura 1) è stato effettuato usando dilagante, colonie del polmone cellule di cancro al seno (MCF10CA1a) come sistema modello. Il dosaggio di puntino produce punti di cellule altamente riproducibile anche in mano di principianti, che lo rende un comodo e facile da eseguire test (Figura 1D). Il dosaggio di dot combinato con lui la macchiatura, o l'imaging time-lapse e successive particle image velocimetry (PIV) permette lo studio dei vari parametri di migrazione tra cui spostamento dei bordi epiteliali, cellule velocità e direzionalità delle cellule come cellule ai bordi di un foglio epiteliale migrare in una zona senza cellula. Inizialmente, formazione immagine di contrasto di fase di punti delle cellule ha rivelato che invasivo, cellule tumorali del polmone Colonia formando al seno (MCF10CA1a) mantengano un fenotipo mesenchimale dopo stimolazione con EGF. Tuttavia, singole cellule lasciando il foglio sono osservate più frequentemente in puntini EGF-stimolata delle cellule (Figura 2, frecce). La risposta delle cellule MCF10CA1a di EGF è stata ulteriormente valutata da HE macchiatura delle culture che sono state stimolate con EGF per 4 giorni. Infatti, EGF-stimolazione è provocato da un diametro maggiore Colonia (Figura 3). Queste osservazioni indicano che la migrazione di EGF cellule stimolate potrebbero essere alterate.
Di conseguenza, l'analisi di dot successiva è stata utilizzata per eseguire un'analisi più dettagliata del fenotipo migrazione dinamica di strati delle cellule MCF10CA1a. Le cellule ai bordi del foglio erano imaged per 9 h dopo stimolazione delle cellule con EGF (Video 1 e Video 2) e immagini sono state poi analizzate da PIV in Matlab4,13,14. PIV ha rivelato che EGF aumenta la velocità delle cellule (Figura 4A) a 0,63 µm/min da 0,45 µm/min in cellule di controllo. Allo stesso tempo, EGF aumentato direzionalità delle cellule, e questo è indicato da una riduzione della variabilità di direzionalità delle cellule (angolare diffusione) da 0,95 nelle culture di controllo a 0,79 in culture EGF-stimolata (Figura 4B). EGF aumentato lo spostamento radiale del bordo epiteliale oltre 9 h da 257 µm a 356 µm (Figura 4), come è stato osservato anche da lui colorazione dopo 4 giorni (Figura 3). Così, l'uso del dosaggio dot in combinazione con differenti dosaggi successivi dimostra che EGF altera migrazione ai bordi dei fogli di cellule MCF10CA1a tale che aumentano la velocità delle cellule e la direzionalità, risultante in un raggio maggiore Colonia.
Figura 1: Imaging il dosaggio di dot. (A, B) Le cellule sono placcate come Colonia circolare al centro del vetro pozzetti della piastra inferiore. Per l'analisi di migrazione, le immagini sono prese a due bordi opposti come pure il centro della Colonia (A). (C) immagine di campo scuro del puntino di cella durante placcatura (a sinistra) e a maggiore ingrandimento (contrasto di fase) che mostra il bordo della goccia e il bordo del punto delle cellule dopo cellule allegate alla piastra (centro). Cellule allegate sono piatte e poligonale, mentre le cellule non iscritti sono rotonde (a destra). (D) Il diametro dei puntini è altamente riproducibile. Punti erano imaged immediatamente dopo il placcaggio e prima che le cellule sono state stimolate e il diametro determinato usando ImageJ. Le dimensioni del punto è altamente riproducibile all'interno di un esperimento anche tra diversi utenti ed è richiesta una preparazione di acquisire competenza in placcatura i puntini delle cellule (E = più di 10 anni di esperienza nella coltura del tessuto, io = meno di 4 settimane di esperienza in tessuto c ulture). n = 12 punti per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: EGF modula il fenotipo morfologico delle cellule di MCF10CA1a. MCF10CA1a cellule erano affamate per 3 h in DMEM/F12 completati con 0,1% di siero equino prima sono stati stimolati con EGF (5 ng/mL). Al bordo del EGF-stimolata colonie singole cellule tendono a migrare fuori dal foglio (frecce). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : EGF aumenta la crescita netta delle colonie delle cellule. MCF10CA1a cellule erano affamate per 3 h in DMEM/F12 supplementato con 0,1% di siero equino, prima che fossero stimolati con EGF (5 ng/mL). 4 giorni più tardi, le cellule erano etanolo fissati e colorati con ematossilina ed eosina. EGF-stimolata puntini hanno un diametro superiore dopo 4 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : EGF modula il fenotipo migratorio delle cellule MCF10CA1a. MCF10CA1a cellule erano affamate per 3 h in DMEM/F12 supplementato con 0,1% di siero equino, prima che fossero stimolati con EGF (5 ng/mL). Le cellule erano imaged ogni 3 min per h. 9 successivi particella image velocimetry analisi è stata eseguita in Matlab13. Valori di velocità rappresentano la velocità media nel tempo per ogni campo. Angolare diffusione dei vettori di velocità è stata calcolata come:
dove 
e varia da 0 (alta direzionalità) a 
(bassa direzionalità). Una diminuzione della diffusione angolare è considerata un aumento nella direzionalità. Spostamento radiale è stato calcolato sottraendo il raggio di Colonia a t = 0 h dal raggio di Colonia a t = h. 9 EGF-stimolazione di MCF10CA1a cella punti velocità aumentata delle cellule (A; pannello superiore) ha provocato, in diminuzione di diffusione angolare o direzionalità (B; medio è aumentato pannello) e il raggio maggiore Colonia (C; pannello inferiore). I dati rappresentano la media ± SEM di n = 3 esperimenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Time-lapse imaging delle cellule non stimolate MCF10CA1a. Immagini sono state scattate ogni 3 min per 9 h. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Video 2: Time-lapse di imaging delle cellule MCF10CA1a stimolati con EGF (5 ng/mL). Immagini sono state scattate ogni 3 min per 9 h. per favore clicca qui per visualizzare questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Durante le cellule di progressione del tumore migrano dal tessuto di origine di invadere il tessuto circostante e riprodurrsi per metastasi ai siti distanti15. Migrazione delle cellule da una colonia di cellule può essere osservato nell'analisi della dot. Qui, il dosaggio di dot è illustrato analizzando il fenotipo migratorio delle cellule di cancro al seno umano in risposta a EGF.
Per ottenere risultati accurati e riproducibili diverse fasi d'impostazione del punto saggi sono critici. In primo luogo, il rivestimento della piastra determina se e come forti cellule possono aderire alla piastra e se le cellule migrano. Dovrebbe prestare attenzione che il rivestimento della piastra con collagene IV o altre matrice extracellulare è omogeneo per ridurre al minimo la variabilità sperimentale. Inoltre, è necessario accertarsi che le cellule studiate allegare a migrano sul piatto rivestito ed esperimenti multipli con differenti matrici in concentrazioni diverse potrebbero essere necessari ottimizzare le condizioni di rivestimento per una linea di cella scelta. In secondo luogo, la placcatura accurata delle cellule è cruciale per la riproducibilità. L'impronta della goccia cella determina la dimensione del puntino delle cellule come pure la sua forma. Idealmente, la goccia viene inserita senza la punta della pipetta toccando la superficie. La forma della goccia quindi è determinata prevalentemente dalla tensione superficiale della superficie della piastra, risultante in un'impronta circolare di diametro riproducibile. Di conseguenza, il diametro del punto delle cellule può essere modificato modificando il volume della sospensione cellulare placcato.
Così, alcuni punti sono da considerare quando si esegue il test del puntino. In primo luogo, la densità delle cellule della sospensione delle cellule deve essere regolata al rivestimento, così come per il tipo di cella utilizzato. In generale, se la goccia si diffonde più ampio, maggiore densità delle cellule sono necessari alle cellule di piastra in monostrati confluenti. Inoltre, più le cellule devono essere placcato per ottenere un monostrato confluente se le cellule sono piccole e non si diffondono tanto quanto confrontato alle cellule di grandi dimensioni, spalmare. In secondo luogo, il dosaggio di punto può essere adottato per piastra diversi formati e per questo, le dimensioni del punto può essere adattato ai più piccoli pozzi riducendo il volume del dot placcato, e se lo si desidera, più grandi punti possono essere placcati con maggiori volumi di goccia. In terzo luogo, alcune linee non verranno collegato alla piastra entro 30 min, nel qual caso il tempo di placcatura di cella può essere esteso fino a 3 h. Allo stesso modo, il rivestimento della piastra deve essere adatto per le cellule di migrare su e prestare attenzione a non graffiare il rivestimento quando le cellule di placcatura. Se le cellule non collegare o migrare sulla matrice selezionata, altri tipi di rivestimento, ad esempio collagene 1 o fibronectina, possono essere esplorati o cambiato le concentrazioni di proteine della matrice, tempi di incubazione e temperature di incubazione durante il rivestimento delle piastre. Matrice extracellulare adatta per linee cellulari specifici potrebbe essere trovata nella letteratura.
Il saggio di dot ha alcune limitazioni. È un'analisi di migrazione bidimensionale e quindi questo può essere considerato come uno svantaggio rispetto alle analisi tridimensionale, che, tuttavia, più difficile da eseguire rispetto le analisi bidimensionale. Un grave problema forse è che la proliferazione delle cellule possa influenzare i risultati, soprattutto se vengono utilizzate linee cellulari proliferanti veloce e migrazione cellulare è valutata per lunghi periodi di tempo come è stato fatto qui per l'analisi del diametro della Colonia dopo 4 giorni. Allo stesso modo, in saggi di gratta e Vinci la chiusura di un graffio ferita è influenzata da proliferazione delle cellule all'interno del foglio di cella; e nell'analisi della camera di Boyden, specialmente se siero o altri mediatori che inducono le proliferazioni delle cellule sono usati come un chemoattractant, proliferazione aumentata delle cellule nella camera inferiore può distorcere risultati. Singola cella di rilevamento consente di osservare in particolare il movimento delle cellule non proliferanti. Inoltre, la proliferazione delle cellule può essere ridotto da deprivazione di siero (i) come fatto qui e/o (ii) l'inibizione della mitosi mediante aggiunta di mitomicina o altri inibitori di proliferazione4,16. Per ridurre la proliferazione delle cellule, tuttavia, deve prestare attenzione a non danneggiare le cellule in una misura che essi non è più possibile eseguire la migrazione. È interessante notare, abbiamo trovato in una migrazione senza vincolata simile analisi che la proliferazione delle cellule non è correlata con lo spostamento del bordo, anche se è coinvolto nel mantenimento dell'integrità epiteliale foglio durante la migrazione4,5, 17. Questo apre una domanda interessante: È la proliferazione delle cellule una componente necessaria della migrazione di un foglio di cella? Si prevede che la migrazione di strati delle cellule con le adesioni cellula-cellula forte nell'ambiente circostante sarà influenzata negativamente se proliferazione è bloccato completamente, come il foglio alla fine non sarà in grado di ampliare e sostenere la migrazione delle cellule. A questo punto, le cellule dovrebbero migrazione sia rallentamento o l'arresto, o il foglio dovrebbe disturbare. Al contrario, la migrazione dei fogli con le adesioni cellula-cellula basso potrebbe essere meno incastrata come cellule possono lasciare il foglio per eseguire la migrazione in modo indipendente, come dispersione al bordo dello strato epiteliale. Così, la migrazione cellulare e la proliferazione delle cellule sono interdipendenti, e qualsiasi tentativo di bloccare la proliferazione delle cellule per studiare la migrazione del foglio deve essere attentamente considerato. Pertanto, saggi di analisi migrazione foglio sono principalmente condotte nelle deprivazione di siero che riduce ma non abolisce la migrazione cellulare.
Altri saggi di migrazione per studiare la migrazione di foglio su superfici bidimensionali includono il graffio o ferita saggio e, più recentemente, le analisi di migrazione senza vincoli usando silicio o PDMS chambers e stencil che consentono di placcatura delle cellule in aree definite e espansione senza vincoli delle cellule nella zona senza cellula dopo la rimozione del camera o stencil1,3,4,5,6,7,16. Questi saggi di quest'ultimi e il dosaggio di dot offrono elevata riproducibilità nella mano di esperti come pure inesperti utenti come la placcatura di cella determina la forma e le dimensioni della Colonia. Al contrario, graffiare il monostrato cellulare nelle analisi di gratta e Vinci richiede pratica e anche nelle mani delle parti di esperti del foglio può essere strappato via erroneamente se vengono utilizzate linee cellulari che formano monostrati stretti. Questo problema è migliorato quando gli alloggiamenti in silicone o stencil sono utilizzati per placcatura le cellule, anche se abbiamo osservato erronea ferimento di strati delle cellule dopo la rimozione di Ibidi chambers. Il dosaggio di dot evita questo problema come le cellule sono placcate in una Colonia e ha permesso di crescere liberamente. Per le stesse ragioni, il dosaggio di puntino inoltre permette alle cellule di migrare sul rivestimento inalterato, che è facilmente disturbato da graffiare o la rimozione di camera/stencil in altri saggi di migrazione. Inoltre, come le cellule non sono ferite da graffiature o rimozione di chambers/stencil, morte delle cellule e l'associato rilascio di citochine associati alla rimozione di chambers/stencil non ha alcun impatto sulla migrazione nell'analisi della dot. Infine, le cellule sono spesso sovra-placcate in saggi di gratta e Vinci e le analisi usando gli alloggiamenti o stencil. Così, dopo cancellare celle li grattando o rimuovendo le barriere che ostacolano la migrazione cellulare, strato monomolecolare della cellula si rilasseranno e cella sono spinti, diffondendo nell'area senza cellula senza attivamente la migrazione. Al contrario, nell'analisi della dot, strati delle cellule possono stabilirsi durante la notte prima migrazione è osservata, e migrazione cellulare piuttosto che rilassamento dello strato di cellule può essere osservato.
L'analisi di dot, che può essere facilmente eseguita senza alcuna attrezzatura specializzata, si presta ad una gamma di analisi successive, compreso la macchiatura delle cellule per valutare la morfologia di Colonia lordo e cella dispersione8, immunostaining8, time-lapse Imaging e l'analisi di dati successive usando ImageJ, Matlab o altri software di analisi immagine13. Parametri aggiuntivi come correlazione di vettori vicini o loro traiettorie di separazione possono essere valutate a più precisamente descrivono la coerenza del movimento delle cellule all'interno di fogli13. Time-lapse imaging possono essere combinati anche con immunostaining e ImageJ supportato rilevamento delle cellule per guadagnare ulteriore comprensione nella migrazione cellulare. Ad esempio, punti possono essere immunostained per proteine citoscheletriche dopo formazione immagine time-lapse, e cellule quindi possono essere monitorate utilizzando ImageJ per analizzare come espressione di queste proteine influenza il fenotipo migratorio delle cellule. Un altro uso futuro è unicellulare tracking delle cellule che esprimono le proteine fluorescenti nucleare. D'importanza, il dosaggio di punto può essere effettuato in piastre multi-pozzetto ed è così adatto a medio-alta velocità di trasmissione di imaging, rendendolo uno strumento facilmente accessibile e molto conveniente per l'effetto di droghe o shRNA su foglio migrazione a schermo.
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Disclosures
L'autore non ha nulla di divulgare.
Acknowledgments
L'autore desidera ringraziare Bhagawat Subramanian, Chang Yi (Jason), Paul Randazzo e Carole Parent per lettura e il commento sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
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