Summary
셀 마이그레이션 개발, 조직 유지 보수 및 수리, 및 tumorigenesis, 필수적 이며, 성장 요인, 발산, 및 cytokines에 의해 규제 됩니다. 이 프로토콜 점 분석 결과를, microenvironmental 신호에 연결 된, 응집력 있는 셀 시트의 철새 형을 평가 하기 위해 2 차원, 무제한 마이그레이션 분석 결과 설명 합니다.
Abstract
복잡 한 유기 체 정적 표시, 그들의 조직의 지속적인 매출을 받고 있다. 세포 나이, 다이, 그리고 새로운 세포로 대체 셀 이동 조직 내의 긴밀 하 게 조율 된 방식. 종양 개발 하는 동안이 균형을 방해 하 고 종양 세포 두고 침공 지역 microenvironment, 먼 사이트에 여행 하 고 궁극적으로 먼 사이트에서 전이성 종양을 형성 하는 근원의 상피. 점 분석 결과 간단 하 고, 2 차원 무제한 마이그레이션 분석 결과, 셀 무료 영역에 셀 시트의 net 움직임을 평가 하 고 셀 마이그레이션 시간 경과 화상 진 찰을 사용 하 여 매개 변수를 분석 하는. 여기, 점 분석 결과 셀 표 피 성장 인자 (EGF), 유방암 세포의 악성 가능성을 높이기 위해 알려진 철새 응답을 분석 하는 인간의 침략, 유 방 암 세포 선, MCF10CA1a, 형성 하는 폐 식민지를 사용 하 여 증명 되 고 변경 셀의 철새 형 하.
Introduction
마이그레이션 분석 널리 종양 세포에서 생체 외에서의 침략과 전이성 잠재력을 평가 하는 데 사용 됩니다. 가장 일반적으로, 상처 또는 스크래치 분석 결과 상피 시트의 셀 허가 지역1,2,3로 마이그레이션 평가 하는 데 사용 됩니다. 스크래치 시험을 수행 하기 위해 세포는 단층으로는 도금 고 "처음" 또는 셀 자유로운 지역 피 펫 팁으로 만들어집니다. 스크래치 분석 결과 일반적으로 사용 가능한 조직 문화 공급 설정 쉽게 이며 여러 샘플의 처리에 대 한 수 다 잘 접시에서 수행할 수 있습니다. 그러나, 스크래치로 세포는 단층에서 물리적으로 제거 되 고 종종 세포의 죽음을 받 다. 또한, 접시에 부착 된 세포 외 기질 자주 긁 과정에서 손상 되었습니다. 마찬가지로, 실리콘의 사용 (예: Ibidi 챔버4) 삽입 또는 스텐실의5,,67 이어질 수 있는 세포의 기계적 파괴 및 코팅에 사용 되는 매트릭스 단백질의 부분적인 제거는 접시입니다. 다른 상처 나 긁힌의 폐쇄를 모니터링 분석 실험의 단점은 그들의 한정 된 시간 코스 스크래치 닫힐 때까지 셀 마이그레이션 분석만 수 있습니다.
수행 점 분석 결과, 세포는 코팅 또는 코팅 접시8에 원형 식민지로 도금. 이 도금 전략에 대 한 근거는 셀 이나 삽입의 제거로 문화를 방해 하지 않고 주변 셀 자유로운 지역으로 침공 하거나 마이그레이션할 수 있는 정의 된 가장자리와 셀 시트를 얻을 것입니다. 점 분석 결과의 전반적인 목표 셀 시트 지 변위 또는 식민지, 뿐만 시간 경과 영상 spatio 시간적 해상도에 셀의 철새 표현 형 분석을 수행 하 여 측정으로의 마이그레이션을 관찰 하는 것입니다.
셀 마이그레이션 microenvironmental 신호 발산, cytokines, EGF 등 성장 요인 등의 다양 한 영향을 받을 수 있습니다. EGF는 그것의 수용 체, EGF 수용 체9, 바인딩을 통해 그것의 생물학적 효과 행사 하 고 침략과 전이성 종양 세포4,,910의 행동을 증가 하는 성장 인자. 점 분석 결과 사용 하 여 공부 하는 여기, EGF 셀 마이그레이션 인간의 침략, 폐 식민지 형성 유 방 암 세포 선 (MCF10CA1a)8,,1112에 자극.
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Protocol
1. 코팅의 요리 (1 일)
참고: 그것을 처리할 때 접시의 바닥에 지 문이나 먼지를 놓지 있는지 확인 합니다.
- Thaw 마우스 콜라겐 얼음, IV 하 고 3 mL 10 µ g/mL 콜라겐 IV 솔루션의 준비 50 m m HCl (pH 1.3)와 희석.
참고: 콜라겐 37 ° c.에 침전 한다 그것은 그러므로 녹고 그것으로 작업 하는 동안 낮은 온도에서 콜라겐 솔루션을 유지 하는 것이 중요입니다. 적절 한 크기의 aliquots를 준비 하 여 반복된 freeze-thaw 주기를 방지-80 ° c.에서 그들을 저장 하 고 - 12 잘 유리 하단 접시의 각 음에 250 µ L 콜라겐 IV 솔루션을 추가 하 고 적절 한 크기의 꽉 닫는 플라스틱 상자에 넣어. 젖은 종이 수건 및 습기 챔버는 상자를 접시 주위를 배치 합니다. 하룻밤 실 온에서 번호판을 품 어.
참고:만 성장 지역 코팅 필요, 그것은 콜라겐 솔루션 접시의 바닥에 붙어 있는 커버 슬립 커버 하기에 충분 한 ( 그림 1A, B 플레이트의 회로도 대 한 참조). - 다음날 아침 씻어 접시 이온 H2O 비 흡수 콜라겐 및 버퍼 제거를 두 번. (해당 되는 경우 물이 튀기는이 지역에 pipetted) 접시 바닥에 coverslip에 의해 형성 된 지 않기로 잘 접시의 가장자리에 물을 직접. 층 류 흐름 후드에서 접시 건조 접시를 즉시 사용 하거나 4 ° C에서 최대 5 일 동안 저장 합니다.
참고: 다른 셀 라인 다른 코팅, fibronectin 또는 콜라겐 같은 내가 필요할 수 있습니다.
2. 도금 점 분석 결과 (주 2)
-
세포 현 탁 액 준비
- 세포 현 탁 액을 준비, 5% 말 혈 청 80% 합류 보충 DMEM/F12 매체에 60-m m 조직 문화 접시에 재배 하 고 있는 셀을 사용
- 칼슘 및 마그네슘 무료 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS) 셀을 한 번 린스 500 µ L 트립 신-EDTA (실내 온도), 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2, 습도 분위기에서 인큐베이터에서 3-5 분에 대 한 셀을 품 어.
- 4.5 mL 문화 중간 트립 신 활동을 중지 하 고 20 세에 분리 된 세포를 일시 중단 한 hemocytometer에 세포 현 탁 액의 µ L 약 수.
- 3 분 x g 200에서 원심 분리 하 여 15 mL 원뿔 튜브에 남아 있는 세포를 작은, 상쾌한, 발음 그리고 3 x 106 셀/mL을 문화 매체에 셀 resuspend.
참고: 다른 코팅 기판 / 셀 라인, 최적의 셀 밀도 희석 시리즈에서 설정할 수 있어야 합니다. 3 x 106 셀/mL 출발점으로 것이 좋습니다.
-
셀을 도금
- 장소는 10 µ L 드롭 콜라겐 IV의 각 커버 슬립의 중심에 세포 현 탁 액의 만지거나 긁는 (그림 1A, B) 코팅 없이 12 잘 유리 하단 플레이트 코팅. 37 ° C, 연결할 셀 수 있도록 습도 분위기에서 30 분 동안 접시를 품 어. 거꾸로 현미경 셀 연결 되어 있는지 확인 합니다.
참고:이 볼 수 있습니다 최고의 드롭의 가장자리에 형성 된 단층의는 (그림 1C) 관찰 될 수 있다. 필요한 경우, 접시를 최대 품 어 3 h. 반드시 인큐베이터에 습도 충분히 높이 신속 하 게 밖으로 건조 하실 수 있습니다. 이 단계 동안 드롭 볼륨의 감소를 관찰 하는 경우 습도 높이기 위해 우물 사이 공간에 PBS를 추가 합니다. - 부드럽게 연결 되지 않은 세포를 제거 하는 두 번 문화 매체의 1 mL와 웰 스 워시. 각 잘을 1 mL 문화 매체를 추가 합니다. 체크는 거꾸로 한 현미경 인 부동 셀 유지, 그렇지 않으면 다시 우물을 씻어. 37 ° C, 5% CO2, 잘 정의 된 셀 시트를 습도 분위기에서 하룻밤 셀을 품 어.
참고: 부동 셀 플레이트에 재연결 하 고 원치 않는 셀 식민지를 형성 하는.
- 장소는 10 µ L 드롭 콜라겐 IV의 각 커버 슬립의 중심에 세포 현 탁 액의 만지거나 긁는 (그림 1A, B) 코팅 없이 12 잘 유리 하단 플레이트 코팅. 37 ° C, 연결할 셀 수 있도록 습도 분위기에서 30 분 동안 접시를 품 어. 거꾸로 현미경 셀 연결 되어 있는지 확인 합니다.
3. 자극 세포 (3 일)
- 모든 우물 식민지 제대로 성장 하는 셀을 위해 역 현미경을 사용 하 여 확인 합니다. 필요 하다 면, 부적 절 한 우물을 표시 하 고 그들을 사용 하지 마십시오.
- 레이블을 적절 하 게 각 조건에 대해 조사 플레이트의 각 잘. 또는 3 중에서 각 상태를 실행 합니다.
- DMEM/F12 0.1% 말 혈 청 (굶주린 중간)를 포함 하는 셀을 굶 어 매체 변경 3 h 세포 자극 하기 전에.
- EGF (최종 농도 5 ng/mL)의 추가 또는 다른 원하는 중재자에 의해 세포를 자극 하 고 부드럽게 1 mL micropipettor를 사용 하 여 매체를 혼합 하거나 접시를 소용돌이.
- 4.1 섹션에 설명 된 대로 가장자리 변위 및 가장자리 윤곽을 관찰 하는 것 1-4 일 동안 접시를 품 어 또는 시간 경과 영상 섹션 4.2에에서 설명 된 대로 수행.
4. 셀 식민지 및 셀의 시각화
-
Hematoxylin-오신 (그) 얼룩 식민지 성장 (하루 4-7)를 측정 하
- ~ 2 분 동안 70% 에탄올 (1 mL/음)에서 셀을 수정 합니다.
- 되며 (1 mL/음), ~ 2 분으로 핵을 얼룩.
- 핵까지 수돗물 (1 mL/잘) 세척 셀은 파란색, 5-10 분.
- 세포질 오신 (1 mL/음), ~ 2 분으로 얼룩.
- 이온을 제거 된 물 (1 mL/음)로 씻어.
참고: Hematoxylin 및 오신 솔루션 수집 고 희미 한 되는 얼룩 때까지 여러 번 사용 될 수 있습니다. - 공기가 건조 플레이트입니다.
- 접시를 플립 하 고 통치자를 가진 점 직경을 측정 한다. 또는, 카메라, 접시의 사진을 찍어 고 ImageJ에 점 직경을 분석 합니다.
-
시간 경과 현미경 (3 일)
- 인큐베이터 현미경에 전환 하 고 37 ° c 온도 조정 DH2O. 조정 5% CO2 는 가습기를 채우십시오. 인큐베이터 챔버 습도 전동된 스테이지를 자유롭게 이동할 수 확인 하십시오. 인큐베이터 챔버를 닫고 37 ° c.를 조정 하는 현미경을 허용
참고: 현미경 사용 (재료의 표 참조) 여기 한다가 열 될 적어도 3 h 동안 37 ° C에 셀 초점의 표류를 방지 하는 몇 군데는 전에. - 인큐베이터 현미경의 스테이지에 접시를 놓고 무대 목록을 설정 합니다. 이미지 두 반대 가장자리 그리고 각 셀 점 (그림 1A)의 센터.
- 걸릴 이미지 10 X 목표를 사용 하 여 15-24 h에 대 한 모든 3 분. 데이터를 다운로드 하 고 프로그램 선택, 이미지 분석 진행 예, ImageJ 또는 Matlab.
- 인큐베이터 현미경에 전환 하 고 37 ° c 온도 조정 DH2O. 조정 5% CO2 는 가습기를 채우십시오. 인큐베이터 챔버 습도 전동된 스테이지를 자유롭게 이동할 수 확인 하십시오. 인큐베이터 챔버를 닫고 37 ° c.를 조정 하는 현미경을 허용
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Representative Results
(그림 1)을 여기에 제시 된 점 분석 결과 침략를 사용 하 여 수행한 모델 시스템으로 유방암 세포 (MCF10CA1a)를 형성 하는 폐 식민지. 점 분석 결과 수익률 편리는 초보자의 손에 에서도 높은 재현성 셀 점 분석 결과 (그림 1D) 실행 하기 쉬운. 점 분석 결과 그 얼룩, 또는 시간 경과 영상 결합 및 후속 입자 이미지 velocimetry (PIV) 수의 상피 가장자리, 셀 속도 및 가장자리에 셀으로 셀 방향 변위를 포함 하 여 다양 한 마이그레이션 매개 변수 연구 상피 시트의 셀 자유로운 지역으로 마이그레이션하십시오. 처음, 셀 점 들의 위상 대비 영상 그 침략, 폐 식민지 형성 유방암 세포 (MCF10CA1a) 유지 엽 형 EGF와 자극 후 공개 했다. 그러나, 단일 셀 시트를 떠나는 자극 하는 EGF 셀 점 (그림 2, 화살표)에서 더 자주 관찰 된다. EGF MCF10CA1a 세포의 응답 더 그가 의해 평가 되었다 EGF와 함께 4 일 동안 자극 했다 문화의 얼룩. 실제로, EGF 자극 증가 식민지 직경 (그림 3)에서 결과. 이러한 관측 나타냅니다 해당 마이그레이션 EGF의 자극된 셀 변경 될 수 있습니다.
따라서, 점 분석 결과 다음 MCF10CA1a 셀 시트의 동적 마이그레이션 표현 형에 대 한 자세한 분석을 수행 하기 위해 이용 되었다. 시트 가장자리에 셀 9 h 다음 EGF (비디오 1 및 비디오 2) 셀의 자극에 대 한 촬영 했다 고 이미지 다음 Matlab4,,1314PIV에 의해 분석 되었다. PIV는 EGF 컨트롤 셀에 0.45 μ m/min에서 0.63 µ m/min을 셀 속도(그림 4)증가 밝혔다. 동시에 EGF 셀, 방향을 증가 하 고 EGF 자극 문화 (그림 4B)에 0.79 제어 문화에서 0.95에서 셀 방향 (각도 확산)의 다양성의 감소에 의해 표시 됩니다. 또한 그는 4 일 (그림 3) 후 얼룩에 의해 관찰 되었다 EGF 상피 가장자리 356 µ m (그림 4), 257 µ m에서 9 h 이상의 방사형 변위 증가. 따라서, 조합 점 분석 결과 다른 후속 분석 실험을 사용은 EGF 변경 MCF10CA1a 셀 시트의 가장자리에서 마이그레이션 셀 속도 방향, 증가 그런 증가 식민지 반경에 결과 보여 줍니다.
그림 1: 도트 분석 결과 이미징. (A, B) 세포는 유리 바닥 격판덮개 우물의 센터에서 원형 식민지로 도금. 마이그레이션 분석을 위해 이미지 두 반대 가장자리 서식 지 (A)의 센터에서 찍은 있습니다. (C) 셀 점 (왼쪽), 도금 중 고 셀 접시 (센터)에 연결 된 후 드롭의 가장자리와 셀 도트의 가장자리를 보여주는 높은 확대 (단계 대조)에서 어두운 필드 이미지. 연결 된 셀은 평평 하 고 다각형, 동안 연결 되지 않은 세포는 원형 (오른쪽). (D) 점의 직경은 높은 재현성. 점 했다 몇 군데 도금 후 즉시 세포 자극 했다 직경 ImageJ를 사용 하 여 결정 하기 전에. 도트 크기가 다른 사용자 사이 뿐만 아니라 1 개의 실험에서 높은 재현성 및 작은 훈련 셀 점 도금에 능력을 얻을 하는 데 필요한 (전자의 조직 문화, 경험 10 년 이상 = 나 = 조직 c에 있는 경험의 4 주 미만 자신)입니다. n = 그룹 당 12 점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: EGF MCF10CA1a 세포의 형태학 적 표현 형을 조절 한다. MCF10CA1a 셀 3 h DMEM/F12 EGF와 자극 기 전에 0.1% 말 혈 청으로 보충에 굶 주 려 했다 (5 ng/mL). EGF 자극 하는 식민지의 가장자리에서 단일 셀 시트 (화살표) 마이그레이션할 경향이 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : EGF 셀 식민지의 net 성장을 증가. MCF10CA1a 셀 DMEM/F12 매체 들은 EGF와 자극 하기 전에 0.1% 말 혈 청으로 보충에 3 h에 대 한 굶 어 했다 (5 ng/mL). 4 일 후, 셀 고정 하 고 오신 Hematoxylin와 스테인드 에탄올 했다. EGF 자극 점 4 일 후 높은 직경에 있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : EGF는 MCF10CA1a 셀의 철새 형을 조절 한다. MCF10CA1a 셀 DMEM/F12 매체 들은 EGF와 자극 하기 전에 0.1% 말 혈 청으로 보충에 3 h에 대 한 굶 어 했다 (5 ng/mL). 셀은 Matlab139 h. 후속 입자 이미지 velocimetry 분석 수행에 대 한 모든 3 분을 몇 군데 있었다. 속도 값은 각 필드에 대 한 시간별 평균 속도를 나타냅니다. 속도 벡터의 각도 확산은 다음과 같이 계산 됩니다.
어디 
, 및 범위를 0 (높은 방향)에서 
(낮은 방향). 각도 확산 감소 방향에서 증가 간주 됩니다. 방사형 변위 t 식민지 반지름을 빼서 계산 했다 t 식민지 반경에서 0 h = = MCF10CA1a 셀 점 증가 셀 속도 (A, 위 패널) 결과, 각도 확산을 감소 또는 증가 하는 방향 (B, 중간의 9 h. EGF 자극 패널), 그리고 증가 식민지 반경 (C; 하단 패널). 데이터를 나타내는 n의 평균 ± SEM = 3 실험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: Unstimulated MCF10CA1a 셀의 시간 경과 영상. 이미지 찍은 9 h. 에 대 한 모든 3 분 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
비디오 2: EGF와 함께 자극 하는 MCF10CA1a 세포의 이미징 시간 경과 (5 ng/mL). 이미지 찍은 9 h. 에 대 한 모든 3 분 하시기 바랍니다 여기를 클릭이이 비디오를 볼. (다운로드 오른쪽 클릭.)
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Discussion
종양 진행 셀 동안 주변 조직 침입 하 고 먼 사이트15전이 기원의 조직에서 마이그레이션하십시오. 셀 서식에서 셀의 마이그레이션 점 분석 결과에서 관찰할 수 있습니다. 여기, 점 분석 결과에 EGF 인간 유방암 세포의 철새 형을 분석 하 여 그림입니다.
결과 얻기 위해 정확 하 고 복제할 도트의 설정에서 몇 가지 단계 분석 실험은 중요 합니다. 첫째, 접시의 코팅 방법 강한 세포 플레이트에 고착 할 수 있다 고 셀 마이그레이션할 경우 결정 합니다. 케어는 콜라겐 IV 또는 다른 기질을 가진 격판덮개의 코팅은 실험적인 변화를 최소화 하기 위해 균질 성 취해야 한다. 또한, 그것을 조사 하는 세포를 연결 하 고 코팅된 접시에 마이그레이션 여러 농도에 다른 매트릭스와 함께 여러 실험 선택한 셀 라인의 코팅 조건을 최적화 해야 할 수 있습니다 보장 되어야 합니다. 둘째, 세포의 정확한 도금은 재현성에 대 한 중요 합니다. 셀 드롭의 발자국 모양을 셀 도트의 크기를 결정합니다. 이상적으로, 드롭은 표면을 피 펫 팁 없이 배치 됩니다. 드롭의 형태는 주로 재현할 수 직경의 원형 발자국 인 플레이트 표면의 표면 장력에 의해 결정 됩니다. 따라서, 세포 현 탁 액 도금의 볼륨을 변경 하 여 셀 도트의 직경을 변경할 수 있습니다.
따라서, 몇 가지 포인트 점 분석을 수행할 때 고려할 수 있습니다. 첫째, 세포 현 탁 액의 셀 밀도 코팅 뿐만 아니라 사용 하는 셀 형식을 조정 될 필요가 있다. 일반적으로 드롭 넓은 확산, 더 높은 세포 밀도 필요 접시 셀에 confluent monolayers로 합니다. 또한, 더 많은 셀 셀 작은 만큼 큰, 퍼지는 셀에 비해 확산 되지 않습니다 경우 confluent 단층을 얻기 위해 도금 될 필요가 있다. 둘째, 점 분석 결과 다른 플레이트 형식으로 채택 될 수 있다 그리고 점 크기 도금, 도트의 볼륨을 줄여 작은 우물을 적용할 수 있습니다, 필요한 경우 더 큰 점 높은 드롭 볼륨을 사용 하 여 도금 될 수 있다. 셋째, 일부 셀 라인은 첨부 하지 30 분 이내 접시에 경우 도금 시간 3 h까지 확장할 수 있습니다. 마찬가지로, 접시의 코팅에 마이그레이션할 셀에 적합 해야 하며 해야 주의 하지 때 셀 도금 코팅 스크래치. 셀 연결 또는 선택한 행렬에 이동 하지 않는 경우 다른 종류의 코팅, 콜라겐 1 또는 fibronectin, 탐험 하실 수 있습니다, 또는 접시의 코팅 중 매트릭스 단백질, 보육 시간과 보육 온도 농도 변경. 특정 셀 라인에 대 한 적합 한 기질 문학에서 찾을 수 있습니다.
점 분석 결과 몇 가지 제한이 있습니다. 그러나 2 차원 마이그레이션 분석 결과 이며 따라서이 불리는,, 3 차원 분석에 비해 더 고려 될 수 있습니다 2 차원 분석 실험 보다 수행 하기 어려운. 주요 문제는 아마도 세포 증식 빠른 확산 세포 선을 사용 하 고 셀 마이그레이션 시간 오랜 동안 이루어졌다 여기 식민지 직경의 분석에 대 한 일 후로 평가 하는 경우에 특히 결과 좌우할 수 있다 이다. 마찬가지로, 스크래치 분석 실험에는 처음 상처의 폐쇄에 의해 영향을 셀 시트; 세포 증식 Boyden 챔버 분석 실험에서 혈 청 또는 셀 proliferations 유도 다른 중재자는 chemoattractant로 사용 하는 경우에 특히 아래쪽 챔버에 증가 세포 증식 수 결과 왜곡 하 고. 단일 셀 추적 특히 비 증식 세포의 움직임을 관찰 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또한, 세포 증식 미토마이신 또는 다른 증식 억제제4,16의 추가 의해 여기 다 (i) 혈 청 기아 및/또는 (ii) 유사 분열의 저해에 의해 줄일 수 있습니다. 그러나 세포 증식을 줄이기 위해,, 해야 합니다 기울여야 하지 손상에 그들은 더 이상 마이그레이션할 수 있는 정도로 셀. 흥미롭게도, 우리는 비슷한 무제한 마이그레이션 있는 마이그레이션4,5, 중 상피 시트 무결성 유지에 관여 하는 비록 세포 증식은 하지 지 변위, 연관 분석 결과 17. 이 재미 있는 질문을 엽니다: 세포 증식 셀 시트의 이동의 필요한 구성 요소는? 그것은 확산 시트 결국 더 이상 수를 확장 하 여 셀의 마이그레이션을 지원으로 완전히 차단 되 면 주변 환경에 강한 셀 유착 셀 시트의 마이그레이션 부정적인 영향 있을 것으로 예상 된다. 이 시점에서, 셀 해야 느리거나 중지 하거나 마이그레이션 또는 시트를 중단 한다. 반대로, 낮은 셀 유착으로 시트의 마이그레이션 영향을 적게 세포 상피 시트의 가장자리에 산란 등 독립적으로 마이그레이션할 시트를 떠날 수 있을 수도 있습니다. 따라서, 셀 마이그레이션 및 세포 증식은 상호 의존, 그리고 시트 마이그레이션 공부를 차단 하는 세포 증식의 어떤 시도 든 지 신중 하 게 고려 될 필요가 있다. 따라서, 분석 실험 분석 시트 마이그레이션 감소 하지만 셀 마이그레이션 폐지 되지 않는 혈 청 기아에서 주로 수행 됩니다.
2 차원 표면에 시트 마이그레이션 공부 다른 마이그레이션 분석 실험 등의 스크래치 또는 상처 분석 결과, 최근, 실리콘 또는 PDMS 챔버 및 도금의 정의 된 영역에 있는 셀 수 있는 스텐실을 사용 하 여 무제한 마이그레이션 분석 및 무제한 마이그레이션 셀의 셀 자유로운 지역으로 챔버 또는 스텐실1,3,,45,6,7,16제거 후. 이러한 후자의 분석 실험과 점 분석 결과 셀 도금 결정 모양 그리고 크기는 식민지의 경험 뿐만 아니라, 미 경 험의 사용자의 손에서 높은 재현성을 제공 합니다. 반대로, 스크래치 분석 실험에서 세포 단층의 긁힘 연습를 요구 하 고 시트의 전문가 들은 부품의 손에 수 수 표 절 잘못 꽉 monolayers를 형성 하는 세포 선을 사용 하는 경우. 이 문제는 사용 될 때 실리콘 챔버 또는 스텐실 도금 셀, 비록 우리가 관찰 하는 Ibidi 챔버의 제거 후 셀 시트의 잘못 된 부상 향상 됩니다. 셀 식민지로 도금 고 자유롭게 성장할 수 점 분석 결과이 문제를 방지 합니다. 같은 이유로 점 분석 결과 또한 셀을 긁힘 또는 다른 마이그레이션 분석 실험에서 챔버/스텐실의 제거에 의해 쉽게 교란 된다 불변된 코팅에 마이그레이션할 수 있습니다. 또한, 세포는 긁힘 또는 챔버/스텐실의 제거에 의해 부상을 하지 죽음 셀룰라와 챔버/스텐실의 제거와 관련 된 크린 시 토 킨의 관련된 자료 점 분석 결과에서 마이그레이션에 영향을 주지 않습니다. 마지막으로, 셀-스크래치 분석 실험 및 분석 실험 챔버 또는 스텐실을 사용 하 여 도금 많습니다. 따라서, 그들을 긁어 하거나 셀 마이그레이션을 방해 하는 물리적 장벽을 제거 하 여 셀을 지우면 셀 단층 휴식 것입니다 셀 적용 됩니다 후 확산 셀 무료 영역에 적극적으로 마이그레이션 하지 않고. 반면, 점 분석 결과에서 셀 시트 설정할 수 있습니다 스스로 하룻밤 전에 마이그레이션, 관찰 및 셀 마이그레이션 셀 시트의 이완 보다는 관찰 될 수 있다.
어떤 특수 장비 없이 쉽게 수행할 수 있습니다, 점 분석 결과 총 식민지 형태학 및 세포 비 산8, immunostaining8, 시간 경과 평가 하기 위해 셀의 얼룩을 포함 하 여 후속 분석 실험의 범위를 빌려준다 이미징, 그리고 ImageJ, Matlab, 또는 다른 이미지 분석 소프트웨어13를 사용 하 여 이후의 데이터 분석. 추가 매개 변수 이웃 벡터의 상관 관계 또는 그들의 분리 궤도 평가 될 수 있다 더 정확 하 게 같은 시트13내 셀 움직임의 일관성에 설명 합니다. 시간 경과 화상 진 찰 또한 immunostaining와 결합 될 수 있습니다 및 ImageJ 지원 셀 마이그레이션에 추가 통찰력을 얻기 위해 셀 추적. 예를 들어 점 후 시간 경과 영상, cytoskeletal 단백질에 대 한 immunostained 수 있으며 셀 다음 추적할 수 있습니다 ImageJ 어떻게이 단백질의 표정 셀의 철새 형 영향 분석을 사용 하 여. 또 다른 미래 사용은 핵 형광 단백질을 표현 하는 셀의 단일 셀 추적. 중요 한 것은, 점 분석 결과 다 잘 접시에서 수행할 수 있습니다 그리고 매체 높은 처리량 같은 적합 한 이미징, 화면 시트 마이그레이션에 마약 또는 shRNAs의 효과를 쉽게 접근할 수 있는 그리고 매우 저렴 한 도구를 만드는.
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Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
저자는 Bhagawat 수브라마니안, 이순신 (제이슨) 장 폴 란다 조, 그리고 캐롤 부모 읽기 및 원고에 대 한 코멘트에 대 한 감사를 기원 합니다. 이 작품은 국립 암 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 건강의 국가 학회.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
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