Summary
الهجرة الخلية أمر ضروري لتطوير وصيانة الأنسجة وإصلاح، توموريجينيسيس، ويخضع لعوامل النمو والمستقطبات السيتوكينات. ويصف هذا البروتوكول المقايسة دوت، مقايسة هجرة ثنائية الأبعاد، وغير المقيد لتقييم النمط الظاهري المهاجرة من أوراق خلية المرفقة، متماسك استجابة لمنبهات ميكرونفيرونمينتال.
Abstract
على الرغم من أن الكائنات الحية معقدة تبدو ثابتة، أنسجتها تحت دوران مستمر. كما خلايا العمر، يموت، وهي الاستعاضة عن خلايا جديدة، الخلايا تتحرك داخل الأنسجة بطريقة مدبرة محكم. أثناء تطوير الورم، تشعر بالانزعاج هذا التوازن، وترك ورم خلايا ظهارة المنشأ لغزو المكروية المحلية، بالسفر إلى مواقع بعيدة، وتشكل في نهاية المطاف الأورام المنتشر في مواقع بعيدة. المقايسة دوت مقايسة هجرة غير مقيدة بسيطة، ثنائي الأبعاد، لتقييم صافي حركة أوراق الخلية إلى منطقة خالية من الخلية، وتحليل معلمات الهجرة الخلية باستخدام التصوير بمرور الزمن. وهنا يتضح المقايسة دوت استخدام الإنسان الغازية، ومستعمرة الرئة تشكيل خط خلية سرطان الثدي، MCF10CA1a، لتحليل استجابة للخلايا المهاجرة لعامل نمو البشرة (لو)، الذي يعرف بزيادة إمكانات خبيث لخلايا سرطان الثدي و لتغيير النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا.
Introduction
فحوصات الهجرة تستخدم على نطاق واسع لتقييم الإمكانات الغازية والمنتشر لورم الخلايا في المختبر. الأكثر شيوعاً، يستخدم بالجرح أو المقايسة الصفر لتقييم هجرة أوراق الظهارية في خلية بمسح منطقة1،2،3. لإجراء فحص الصفر، يتم مطلي الخلايا إلى أحادي الطبقة و "الصفر" أو منطقة خالية من خلية تم إنشاؤه باستخدام تلميح ماصة. مقايسة الصفر من السهل إعداد مع الإمدادات المتاحة عادة زراعة الأنسجة، ويمكن أن يؤديها في لوحات متعددة جيدا، مما يسمح لتجهيز عينات متعددة. ومع ذلك، كما هو الصفر، الخلايا يتم إزالتها فعلياً من أحادي الطبقة وغالباً الخضوع لموت الخلايا. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تلف المصفوفة خارج الخلية التي تعلق على اللوحة خلال عملية الخدش. وبالمثل، إدراج استخدام السليكون (مثل الدوائر عبدي4) أو من الاستنسل5،،من67 يمكن أن يؤدي إلى اضطراب الميكانيكي للخلايا وإزالة جزئية من البروتينات المصفوفة تستخدم لطلاء لوحات. وثمة عيب آخر من فحوصات رصد إقفال الجروح أو الخدوش هو دورتهم الوقت المحدود، كما يمكن فقط تحليل الهجرة الخلية حتى يتم إغلاق الصفر.
في إجراء المقايسة دوت، هي مطلي الخلايا كمستعمرة تعميم على لوحة مغلفة أو غير المصقول8. والأساس المنطقي لهذه الاستراتيجية والطلاء هو الحصول على أوراق الخلية مع حواف محددة، يمكن ترحيل أو غزو في المناطق المحيطة بها خالية من الخلية دون الإخلال الثقافة بإزالة خلايا أو إدراج. والهدف العام للمقايسة دوت مراقبة الهجرة صحائف خلية مقاسا بحافة التشرد أو القطر مستعمرة، فضلا عن القيام بتصوير مرور الزمن لتحليل النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا في أعلى القرار الزمانية.
يمكن أن تتأثر الهجرة الخلية بالعديد من الإشارات ميكرونفيرونمينتال مثل المستقطبات، السيتوكينات، وعوامل النمو مثل مماثلة. لو هو عامل النمو التي تمارس إثارة البيولوجية عن طريق ربط لمستقبلات لها، لو مستقبلات9، ويزيد من السلوك الغازية والمنتشر من ورم الخلايا4،،من910. هنا، يتم استخدام المقايسة دوت لدراسة مماثلة وحفز الهجرة الخلية في مستعمرة الرئة بشرية الغازية، تشكيل الثدي سرطان الخلية خط (MCF10CA1a)8،،من1112.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-طلاء أطباق (1 يوم)
ملاحظة: تأكد من عدم ترك بصمات الأصابع أو الاوساخ على الجزء السفلي من اللوحة عند التعامل مع الأمر.
- ذوبان الجليد الماوس الكولاجين الرابع على الجليد، وتمييع مع 50 ملم HCl (pH 1.3) لإعداد 3 مل من 10 ميكروغرام/مل الكولاجين الحل الرابع.
ملاحظة: سوف يعجل بالكولاجين عند 37 درجة مئوية. ولذلك من المهم أن تبقى الحل الكولاجين عند درجة حرارة منخفضة بينما ذوبان الجليد والعمل معها. تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة بإعداد مختبرين حجم مناسب وتخزينها في-80 درجة مئوية. - إضافة 250 ميليلتر الكولاجين الرابع الحل لكل بئر من لوحات أسفل الزجاج 12-جيدا ووضعها في علبة بلاستيكية حجم مناسب، ومحكم الإغلاق. ضع منشفة ورقية رطبة أكثر وحول لوحات لتصنيع دائرة رطبة وإغلاق المربع. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: فقط منطقة النمو يجب أن تكون مغلفة, أنها كافية لتغطي فقط بكشف الغطاء، الذي هو تعلق على الجزء السفلي من اللوحة، مع حل الكولاجين (انظر الشكل 1أ وب لتخطيطي للوحة). - صباح اليوم التالي، شطف اللوحات مع منزوع ح2س مرتين لإزالة عدم استيعاب الكولاجين والمخزن المؤقت. توجيه الماء إلى حافة اللوحة جيدا، لا إلى الحافة التي شكلتها أسفل اللوحة وساترة (إذا كان هو بيبيتيد المياه في هذا المجال سوف دفقة). أيردري اللوحات في هود الاندفاق الصفحي. استخدام لوحات فورا أو تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام.
ملاحظة: قد تتطلب خطوط الخلايا مختلفة مختلفة طلاء، مثل فيبرونيكتين أو الكولاجين أنا.
2-طلاء المقايسة دوت (اليوم 2)
-
إعداد تعليق خلية
- لإعداد تعليق خلية، استخدم الخلايا التي قد نمت في طبق استنبات الأنسجة 60 ملم في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع مصل الحصان 5% إلى 80% التقاء
- شطف الخلايا مع دولبيكو خالية من الكالسيوم والمغنيزيوم الفوسفات مخزنة المالحة (دببس) مرة واحدة وإضافة 500 ميليلتر التربسين-يدتا (درجة حرارة الغرفة)، واحتضان الخلايا لمدة 3-5 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO2، جو هوميديفيد.
- تعليق الخلايا المنفصلة في 4.5 مل الثقافة المتوسطة لوقف نشاط التربسين والتعويل 20 قاسمة ميليلتر من تعليق خلية في هيموسيتوميتير.
- بيليه الخلايا المتبقية في أنبوب مخروطي 15 مل بالطرد المركزي في 200 غ س لمدة 3 دقائق ونضح المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في المتوسط 3 × 106 خلايا/مل والثقافة.
ملاحظة: لطلاء ركائز أخرى و/أو خطوط الخلايا، يجب إنشاء كثافة الخلية المثلى في سلسلة تمييع. ويوصي 3 × 106 خلية/مل كنقطة انطلاق.
-
طلاء الخلايا
- مكان قطره 10 ميليلتر من تعليق خلية في مركز كل كشف الغطاء الكولاجين الرابع مغلفة بالزجاج 12-جيدا أسفل لوحة دون لمس أو خدش الطلاء (الشكل 1أ، ب). احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، جو هوميديفيد، للسماح للخلايا إرفاق. تحقق في مجهر مقلوب أن الخلايا موصولة.
ملاحظة: هذا يمكن أفضل رؤية عند الحافة من الانخفاض، حيث يمكن ملاحظة تشكيل أحادي الطبقة (الشكل 1ج). إذا لزم الأمر، احتضان اللوحة يصل إلى حاء 3 يجب التأكد من أن نسبة الرطوبة في الحاضنة عالية بما يكفي كما القطرات يمكن أن تجف بسرعة. إذا لوحظ انخفاضا في حجم قطره أثناء هذه الخطوة، إضافة برنامج تلفزيوني للمسافات بين الآبار زيادة الرطوبة. - غسل الآبار مع 1 مل من الثقافة المتوسطة مرتين لإزالة الخلايا غير مرفقة بلطف. أضف 1 مل الثقافة المتوسطة لكل بئر. تحقق في مجهر مقلوب أن الخلايا العائمة لا تبقى، إلا تغسل الآبار مرة أخرى. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، جو هوميديفيد، للحصول على أوراق خلية محددة تحديداً جيدا.
ملاحظة: من المحتمل إعادة إرفاق إلى اللوحة وتشكل مستعمرات الخلايا غير المرغوب فيها الخلايا العائمة.
- مكان قطره 10 ميليلتر من تعليق خلية في مركز كل كشف الغطاء الكولاجين الرابع مغلفة بالزجاج 12-جيدا أسفل لوحة دون لمس أو خدش الطلاء (الشكل 1أ، ب). احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، جو هوميديفيد، للسماح للخلايا إرفاق. تحقق في مجهر مقلوب أن الخلايا موصولة.
3-تحفيز الخلايا (اليوم الثالث)
- التحقق من جميع الآبار باستخدام مجهر معكوس للتأكد من أن الخلية المستعمرات قد نمت بشكل صحيح. إذا لزم الأمر، وضع علامة على الآبار غير مناسب ولا يستخدمونها.
- قم بتسمية كل من لوحة على نحو ملائم لكل شرط التحقيق جيدا. قم بتشغيل كل شرط في تكرار أو ثلاث نسخ.
- تغيير على المديين المتوسط وتجويع الخلايا في DMEM/F12 المحتوية على مصل الحصان 0.1% (متوسط يتضورون جوعاً) ح 3 قبل أن يتم تحفيز الخلايا.
- حفز الخلايا بالإضافة لمماثلة (تركيز النهائي 5 نانوغرام/مل) أو الوسطاء الآخرين المطلوب وتخلط بلطف المتوسطة استخدام ميكروبيبيتور 1 مل أو بواسطة يحوم اللوحة.
- احتضان بلايت 1-4 أيام لمراقبة حافة التشرد وكفاف الحافة كما هو موضح في القسم 4.1 أو إجراء تصوير مرور الزمن كما هو موضح في الجزء 4-2.
4-التصور مستعمرات الخلايا والهجرة الخلية
-
الهيماتوكسيلين-ويوزين (أنه) تلطيخ لقياس نمو مستعمرة (يوم 4-7)
- إصلاح الخلايا في الإيثانول 70% (1 مل/جيد) ~ 2 دقيقة.
- وصمة عار الأنوية مع الهيماتوكسيلين (1 مل/جيد)، ~ 2 دقيقة.
- خلايا أغسل بماء الصنبور (1 مل/جيد) حتى الأنوية الأزرق، 5-10 دقيقة.
- السيتوبلازم وصمة عار مع ويوزين (1 مل/جيد)، ~ 2 دقيقة.
- شطف بالمياه (1 مل/جيد).
ملاحظة: يمكن جمع حلول الهيماتوكسيلين ويوزين واستخدامه عدة مرات إلى تلطيخ تصبح باهتة. - لوحة أيردري.
- الوجه اللوحة وقياس قطر دوت مع مسطرة. وبدلاً من ذلك، التقاط صور اللوحة مع كاميرا، وتحليل قطر دوت في إيماجيج.
-
الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (3 اليوم)
- التبديل في المجهر حاضنة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ملء المرطب مع dH2ضبط O. CO2 إلى 5%. تأكد من أن الدائرة الحاضنة هو هوميديفيد وأن المرحلة الآلية التي يمكن أن تتحرك بحرية. إغلاق الدائرة الحاضنة والسماح بالمجهر لضبط إلى 37 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدام المجهر (انظر الجدول للمواد) هنا يجب تسخينها إلى 37 درجة مئوية على الأقل 3 ح قبل الخلايا يتم تصويرها لتجنب الانجراف من التركيز. - ضع اللوحة في مرحلة المجهر حاضنة وقم بإعداد قائمة بالمرحلة. حواف الصورة المتعارضة اثنين ومركز كل خلية نقطة (الشكل 1أ).
- التقاط صور كل 3 دقائق، ح 15-24 باستخدام هدف X 10. تنزيل البيانات والمضي قدما في تحليل الصورة في برنامج للاختيار، مثلاً، إيماجيج أو مطلب.
- التبديل في المجهر حاضنة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ملء المرطب مع dH2ضبط O. CO2 إلى 5%. تأكد من أن الدائرة الحاضنة هو هوميديفيد وأن المرحلة الآلية التي يمكن أن تتحرك بحرية. إغلاق الدائرة الحاضنة والسماح بالمجهر لضبط إلى 37 درجة مئوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء المقايسة دوت المعروضة هنا (الشكل 1) باستخدام الغازية، مستعمرة الرئة تشكيل خلايا سرطان الثدي (MCF10CA1a) كنظام نموذجي. المقايسة دوت غلة النقاط خلية استنساخه بشدة حتى في اليد للمبتدئين، يجعلها مريحة وسهلة لتنفيذ المقايسة (الشكل 1د). المقايسة دوت جنبا إلى جنب مع أنه يلطخ، أو الوقت الفاصل بين التصوير والجسيمات اللاحقة صورة فيلوسيميتري (PIV) يسمح لدراسة مختلف البارامترات الهجرة بما في ذلك التشرد حواف الظهارية، وسرعة الخلية واتجاهية الخلايا كخلايا في الحواف من ورقة الظهارية تهاجر إلى منطقة خالية من الخلية. في البداية، كشف مرحلة التباين التصوير من النقاط الخلية الغازية، الرئة مستعمرة تشكيل خلايا سرطان الثدي (MCF10CA1a) احتفاظ النمط الظاهري الوسيطة بعد التحفيز مع مماثلة. ومع ذلك، لوحظت خلايا مفردة ترك الورقة أكثر تواترا في النقاط لو حفز الخلية (الشكل 2، الأسهم). كذلك كان تقييم استجابة الخلايا MCF10CA1a لو أنه يلطخ من الثقافات التي كانت تحفز مع مماثلة لمدة 4 أيام. في الواقع، أدى التحفيز لو مستعمرة زيادة قطر (الشكل 3). وتشير هذه الملاحظات إلى أن هجرة مماثلة قد يكون تغيير خلايا حفز.
ولذلك، استخدمت المقايسة دوت التالية لإجراء تحليل أكثر تفصيلاً للنمط الظاهري الهجرة دينامية من أوراق خلية MCF10CA1a. الخلايا على حواف الورقة تم تصويرها ح 9 بعد تنشيط الخلايا مع مماثلة (فيديو 1 و فيديو 2) والصور ثم حللت قبل PIV في Matlab4،،من1314. وكشفت PIV أنه لو يزيد من سرعة الخلية (الشكل 4أ) إلى 0.63 ميكرومتر/دقيقة من 0.45 ميكرومتر/دقيقة في خلايا عنصر التحكم. في الوقت نفسه، لو زاد اتجاهية للخلايا، ويدل على ذلك الحد من تباين اتجاه الخلية (انتشار الزاوي) من 0.95 في الثقافات عنصر التحكم إلى 0.79 في الثقافات التي حفزت مماثلة (الشكل 4ب). لو زاد تشريد شعاعي من حافة الظهارية ما يزيد على 9 ح من 257 ميكرومتر إلى 356 ميكرومتر (الشكل 4)، كما لوحظ أيضا بأنه يلطخ بعد 4 أيام (الشكل 3). وهكذا، يظهر استخدام المقايسة دوت في تركيبة مع مختلف الاختبارات اللاحقة أن لو يغير الهجرة عند الحواف الأوراق خلايا MCF10CA1a أن يتم زيادة سرعة الخلية واتجاهية، أدى مستعمرة زيادة دائرة نصف قطرها.
رقم 1: التصوير المقايسة دوت. (أ، ب) يتم مطلي الخلايا كمستعمرة دائرية في وسط الزجاج أسفل لوحة الآبار. لتحليل الهجرة، يتم أخذ صور على حواف المتعارضة اثنين، فضلا عن مركز المستعمرة (A). (ج) مجال الظلام صورة دوت الخلية أثناء الطلاء (يسار)، وفي أعلى التكبير (مرحلة التباين) يبين حافة الهبوط وحافة دوت الخلية بعد الخلايا التي تعلق على اللوحة (في الوسط). الخلايا المرفقة مسطحة ومضلعة، بينما تكون الخلايا غير المرفقة بجولة (يمين). (د) قطر النقاط يتم استنساخه بدرجة عالية. النقاط تم تصويرها فورا بعد الطلاء وقبل حفز الخلايا وتحديد القطر باستخدام إيماجيج. حجم دوت عاليا استنساخه في تجربة واحدة، وكذلك بين مختلف المستخدمين ومطلوب القليل من التدريب لاكتساب الكفاءة في الطلاء النقاط الخلية (E = أكثر من 10 سنوات خبرة في مجال زراعة الأنسجة، أنا = أقل من 4 أسابيع تجربة في الأنسجة ج الطور). n = عدد النقاط 12 لكل مجموعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: لو ينظم النمط الظاهري المورفولوجية للخلايا MCF10CA1a- خلايا MCF10CA1a كانت جوعاً ح 3 في DMEM/F12 تستكمل مع مصل الحصان 0.1% قبل أن تحفز مع مماثلة (5 نانوغرام/مل). عند الحافة من المستعمرات لو حفز الخلايا المفردة تميل إلى الهجرة من الورقة (الأسهم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : لو يزيد صافي نمو مستعمرات الخلايا. خلايا MCF10CA1a كانت جوعاً ح 3 في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع مصل الحصان 0.1% قبل أن تحفز مع لو (5 نانوغرام/مل). 4 أيام في وقت لاحق، وكانت الزنزانات الإيثانول ثابتة والملون مع الهيماتوكسيلين & ويوزين. وقد حفزت لو النقاط قطر أعلى بعد 4 أيام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : لو ينظم النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا MCF10CA1a. خلايا MCF10CA1a كانت جوعاً ح 3 في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع مصل الحصان 0.1% قبل أن تحفز مع لو (5 نانوغرام/مل). خلايا تم تصويرها كل 3 دقائق لاجري حاء 9 اللاحقة الجسيمات الصورة فيلوسيميتري التحليل في Matlab13. وتمثل القيم سرعة معدل السرعة على مر الزمن لكل حقل. وحسبت كانتشار نواقل السرعة الزاوي:
حيث 
، ويتراوح بين 0 (اتجاهية عالية) إلى 
(منخفض اتجاهية). ويعتبر انخفاض في انتشار الزاوي زيادة في اتجاه. حسبت التشرد شعاعي بطرح قيمة radius مستعمرة في تي = 0 ح من دائرة نصف قطرها مستعمرة في t = 9 h. التحفيز لو من MCF10CA1a النقاط الخلية أدت إلى سرعة زيادة خلية (A; اللوحة العلوية)، انخفض انتشار الزاوي أو زادت اتجاهية (ب؛ الأوسط لوحة)، ومستعمرة زيادة نصف القطر (ج؛ اللوحة السفلية). وتمثل البيانات يعني ± ووزارة شؤون المرأة من n = 3 تجارب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيديو 1: تصوير الوقت الفاصل بين الخلايا MCF10CA1a أونستيمولاتيد. تم أخذ صور كل 3 دقائق ل 9 h. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
الفيديو 2: الوقت الفاصل بين التصوير من الخلايا MCF10CA1a وحفز مع مماثلة (5 نانوغرام/مل). تم أخذ صور كل 3 دقائق ل 9 h. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أثناء تطور الخلايا السرطانية يهاجر بعيداً عن الأنسجة الأصلية غزو الأنسجة المحيطة والسرطاني إلى مواقع بعيدة15. ويمكن ملاحظة هجرة خلايا بعيداً عن مستعمرة خلية في المقايسة دوت. ويتجلى المقايسة دوت هنا، تحليل النمط الظاهري المهاجرة من خلايا سرطان الثدي البشرية استجابة لمماثلة.
للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار في العديد من الخطوات في إنشاء النقطة فحوصات الحاسمة. أولاً، تحدد طلاء اللوحة إذا وكيف الخلايا قوية يمكن أن تنضم إلى اللوحة وكان ترحيل الخلايا. ينبغي الحرص أن طلاء اللوحة مع الكولاجين الرابع أو غيرها المصفوفة خارج الخلية متجانس للحد من تقلب التجريبية. وعلاوة على ذلك، فإنه يجب ضمان أن الخلايا التحقيق إرفاق وترحيل على لوحة المغلفة، وتجارب متعددة مع المصفوفات المختلفة في تركيزات عدة قد تكون ضرورية لتحسين شروط طلاء خط خلية مختارة. ثانيا، أمر حاسم لإمكانية تكرار نتائج التصفيحات دقيقة من الخلايا. بصمة إسقاط خلية يحدد حجم النقطة الخلية، فضلا عن شكله. ومن الناحية المثالية، يتم وضع القطرة دون تلميح ماصة لمس السطح. شكل الانخفاض ثم تتحدد معظمها بالتوتر السطحي لسطح اللوحة، أسفر عن بصمة دائرية قطرها استنساخه. ونتيجة لذلك، يمكن تغيير قطر دوت الخلية عن طريق تغيير حجم الخلية تعليق مطلي.
وهكذا، تكون عدة نقاط ينبغي أخذها في الاعتبار عند إجراء المقايسة دوت. أولاً، يحتاج كثافة الخلية تعليق خلية يمكن تعديلها للطلاء وكذلك لنوع الخلية المستخدمة. وبصفة عامة، إذا كان الانخفاض ينتشر أوسع، أعلى الخلية كثافة هناك حاجة لخلايا لوحة في مونولاييرس المتلاقية. وعلاوة على ذلك، يلزم المزيد من الخلايا يكون مطلي بالحصول على أحادي الطبقة المتلاقية إذا كانت خلايا صغيرة ولا تنتشر بقدر ما مقارنة بالخلايا الكبيرة، ونشر. ثانيا، يمكن اعتماد المقايسة دوت للوحة مختلفة الأشكال، وهذا، حجم النقطة يمكن تكييفها لأصغر الآبار بتقليل حجم النقطة مطلي، وإذا رغبت في ذلك، يمكن أن يكون مطلي بالنقاط أكبر باستخدام أعلى انخفاض أحجام. ثالثا، يمكن توسيع الخلية بعض خطوط سوف لا نعلق على اللوحة خلال 30 دقيقة، في هذه الحالة الوقت الطلاء ما يصل إلى 3 س. وبالمثل، طلاء اللوحة يجب أن تكون مناسبة للخلايا لترحيل على وينبغي الحرص لا إلى نقطة الصفر للطلاء عند طلاء الخلايا. إذا كانت الخلايا لا نعلق أو ترحيل في المصفوفة الذي تم اختياره، يمكن استكشاف أنواع أخرى من الطلاء، الكولاجين 1 أو فيبرونيكتين، على سبيل المثال، أو تغيير تركيزات البروتينات مصفوفة وأوقات الاحتضان ودرجات حرارة الاحتضان أثناء طلاء لوحات. ويمكن إيجاد المصفوفة خارج الخلية المناسبة لخطوط الخلايا المحددة في الأدب.
وقد المقايسة دوت قيود قليلة. مقايسة هجرة ثنائي الأبعاد وهكذا قد يعتبر هذا وضع غير مؤات مقارنة بفحوصات ثلاثي الأبعاد، و، مع ذلك، أكثر صعوبة في أداء من فحوصات ثنائي الأبعاد. ولعل مشكلة رئيسية أن انتشار الخلايا يمكن أن تؤثر على النتائج، خاصة إذا كان يتم استخدام خطوط الخلايا المتكاثرة بسرعة وتقييم الهجرة الخلية على مدى فترات زمنية أطول كما حدث هنا للتحليل للقطر مستعمرة بعد 4 أيام. وبالمثل، في فحوصات الصفر إغلاق الصفر الجرح يتأثر انتشار الخلايا ضمن ورقة الخلية؛ وفي فحوصات Boyden الدائرة، خاصة إذا استخدمت المصل أو الوسطاء الآخرين التي تحفز proliferations الخلية تشيمواتراكتانت، يمكن أن تحرف تكاثر الخلايا زيادة في قاعة أسفل النتائج. يمكن استخدام خلية واحدة تتبع لمراقبة حركة الخلايا غير المنتشرة على وجه التحديد. وعلاوة على ذلك، يمكن تقليل انتشار الخلايا بالمجاعة (ط) مصل كما فعلت هنا و/أو (ثانيا) تثبيط الانقسام بالإضافة ميتوميسين أو غيرها انتشار مثبطات4،16. للحد من انتشار الخلايا، ومع ذلك، يجب الحرص على عدم الأضرار الخلايا إلى حد لم يعد يمكن أن تهاجر. من المثير للاهتمام، وجدنا في ترحيل غير مقيد مماثلة الاعتداء أن تكاثر الخلايا لا يرتبط مع حافة التشرد، على الرغم من أنها تشارك في الحفاظ على سلامة ورقة الظهارية أثناء الهجرة4،5، 17. يؤدي هذا إلى فتح مسألة مثيرة لاهتمام: انتشار الخلايا عنصرا ضروريا لهجرة ورقة الخلية؟ ومن المتوقع أن هجرة أوراق الخلية مع قوي خلية-خلية الالتصاقات إلى البيئة المحيطة سوف تتأثر سلبا إذا تم حظر الانتشار الكامل، كما الورقة في نهاية المطاف لم يعد ستكون قادراً على توسيع ودعم هجرة خلايا. عند هذه النقطة، الخلايا ينبغي أما بطيئة أو وقف الهجرة، أو ينبغي تعطيل الورقة. على العكس من ذلك، قد تكون هجرة أوراق مع الالتصاقات منخفضة خلية-خلية أثرت أقل كما يمكن ترك خلايا الورقة إلى الهجرة بشكل مستقل، مثل نثر على حافة الورقة الظهارية. وهكذا، الهجرة الخلية وتكاثر الخلايا مترابطة، وأي محاولة لعرقلة انتشار الخلايا لدراسة الهجرة ورقة يحتاج إلى النظر بعناية. وهكذا، تجري فحوصات تحليل الهجرة ورقة معظمها تحت المجاعة المصل الذي يقلل ولكنها لا تلغي الهجرة الخلية.
فحوصات الهجرة الأخرى دراسة الهجرة الورقة على السطوح ثنائية الأبعاد تشمل الصفر أو الجرح المقايسة، ومؤخرا، فحوصات الهجرة غير المقيدة باستخدام السليكون أو الدوائر PDMS وقوالب الاستنسل التي تسمح لطلاء خلايا في مناطق محددة و الهجرة غير المقيد من الخلايا إلى منطقة خالية من الخلية بعد إزالة الدائرة أو استنسل1،3،4،5،،من67،16. هذه الاختبارات الأخيرة والمقايسة دوت توفر إمكانية تكرار نتائج عالية في اليد للمستخدمين ذوي الخبرة فضلا عن مجرب كطلاء الخلية يحدد شكل وحجم المستعمرة. وفي المقابل، الخدش من أحادي الطبقة الخلوية في فحوصات الصفر يتطلب الممارسة، وحتى في أيدي الخبراء أجزاء من الورقة يمكن أن انفصل خطأ إذا استخدمت خطوط الخلايا التي تشكل مونولاييرس ضيق. تم تحسين هذه المسألة عند استخدام دوائر السيليكون أو قوالب الاستنسل لطلاء الخلايا، وعلى الرغم من أننا لاحظنا إصابة خاطئة من أوراق الخلية بعد إزالة الدوائر عبدي. ويتجنب المقايسة دوت هذه المسألة مطلي إلى مستعمرة الخلايا ويسمح لتنمو بحرية. لنفس الأسباب، يسمح المقايسة دوت أيضا في الخلايا لترحيل في طلاء غير معدلة، الذي منزعجة بسهولة للخدش أو إزالة الدائرة/الاستنسل في فحوصات الهجرة الأخرى. وعلاوة على ذلك، كما لا تتضرر خلايا من الخدش أو إزالة الدوائر/قوالب الاستنسل، خلية الموت وإطلاق السيتوكينات المرتبطة بإزالة الدوائر/قوالب الاستنسل المرتبطة بها ليس له أي تأثير على الهجرة في المقايسة دوت. وأخيراً، الخلايا غالباً ما تكون مطلي الإفراط في فحوصات الصفر وفحوصات باستخدام الدوائر أو قوالب الاستنسل. وهكذا، بعد تطهير الخلايا بخدش لهم إيقاف أو إزالة الحواجز المادية التي تعرقل الهجرة الخلية، وسوف الاسترخاء أحادي الطبقة الخلية ويتم دفع الخلية، ينتشر إلى منطقة خالية من الخلية دون ترحيل بنشاط. وفي المقابل، في المقايسة دوت، أوراق خلية يمكنك تأسيس أنفسهم بين عشية وضحاها قبل الهجرة ويلاحظ، ويمكن ملاحظة الهجرة الخلية بدلاً من الاسترخاء لخلية ورقة.
المقايسة دوت، التي يمكن أن يؤديها بسهولة دون أي معدات متخصصة، يفسح المجال لمجموعة من الاختبارات اللاحقة، بما في ذلك تلطيخ الخلايا لتقييم مورفولوجيا مستعمرة الإجمالي وخلية نثر8, إيمونوستينينج8, الوقت الفاصل بين التصوير، وتحليل البيانات اللاحقة باستخدام إيماجيج أو Matlab برمجيات تحليل الصورة الأخرى13. معلمات إضافية مثل يمكن تقييم العلاقة بين الموجهات المجاورة أو مساراتها الانفصال أكثر دقة تصف تماسك حركة خلايا ضمن أوراق13. يمكن أيضا الجمع بين الوقت الفاصل بين التصوير مع إيمونوستينينج وأيد إيماجيج خلية التتبع للحصول على مزيد من التبصر في الهجرة الخلية. على سبيل المثال، يمكن أن تكون النقاط إيمونوستينيد لبروتينات cytoskeletal بعد الوقت الفاصل بين التصوير، والخلايا يمكن أن تتبع ثم استخدام إيماجيج لتحليل كيفية التعبير عن هذه البروتينات تأثير النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا. استخدام آخر في المستقبل هو تعقب خلية واحدة من الخلايا التي تعبر عن البروتينات الفلورية النووية. الأهم من ذلك، يمكن إجراء المقايسة دوت في لوحات متعددة جيدا وهذه مناسبة للإنتاجية متوسطة إلى عالية التصوير، وجعله أداة الوصول إليها بسهولة وبأسعار معقولة جداً لفحص تأثير المخدرات أو شرناس على ورقة الهجرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.
Acknowledgments
المؤلف يود أن يشكر بهاجاوات سوبرامانيان، تشانغ يي (جايسون)، بول Randazzo، والأصل كارول للقراءة والتعليق على هذه المخطوطة. هذا العمل كان يدعمها برنامج البحوث الداخلية للمعهد الوطني للسرطان، "المعاهد الوطنية للصحة".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
