Summary
Celle migrasjon er avgjørende for utvikling, vev vedlikehold og reparasjon og tumorigenesis, og er regulert av vekstfaktorer, chemokines og cytokiner. Denne protokollen beskriver dot analysen, en to-dimensjonal, ubegrenset overføring analysen å vurdere vandrende fenotypen tilknyttede cellen til sammenhengende ark som svar på microenvironmental stikkordene.
Abstract
Selv om komplekse organismer vises statisk, er deres vev under en kontinuerlig omsetning. Som celler alder, flytte dø, og er erstattet av nye celler, celler i vev i et godt orkestrert måte. Under tumor utvikling, denne likevekten blir forstyrret, og kreftceller forlate epitel i opprinnelse å invadere den lokale microenvironment, å reise til fjerntliggende områder, og til slutt metastatisk svulster i fjerntliggende områder. Dot analysen er en enkel, todimensjonal ubegrenset overføring analysen, å vurdere netto bevegelsen av cellen ark i en celle uten område, og analysere parametere av celle migrasjon bruker tidsinnstilt bildebehandling. Her, punkt analysen er demonstrert ved hjelp av et menneske invasiv, lunge kolonien danner bryst kreft cellen linje, MCF10CA1a, analysere cellenes vandrende svar epidermal vekstfaktor (EGF), som er kjent for å øke ondartet potensialet i brystkreft celler og endre vandrende fenotypen av celler.
Introduction
Migrasjon analyser brukes til å evaluere invasiv og metastatisk potensial til tumor celler i vitro. Oftest brukes sår eller scratch analysen til å vurdere overføringen epithelial ark i en celle ryddet område1,2,3. For å utføre scratch analysen, celler er belagt i en monolayer og en "scratch" eller cellen fritt område opprettes med Pipetter tips. Scratch analysen er lett å sette opp med vanlig vev kultur forsyninger og kan utføres i flere bra plater, tillater for behandling av flere eksempler. Men som scratch er laget, celler er fjernet fra monolayer og ofte gjennomgår celledød. Videre er ekstracellulær matrix knyttet til platen ofte skadet under avlysning prosessen. Tilsvarende bruk av silisium setter inn (for eksempel Ibidi chambers4) eller av sjablonger5,6,7 kan føre til mekanisk avbrudd av cellene og delvis fjerning av matrix proteiner brukes for belegg på plater. En annen ulempe av analyser overvåking nedleggelsen av sår eller riper er deres begrenset tid selvfølgelig som celle migrasjon kan bare analyseres til scratch lukkes.
I å utføre dot analysen, er celler belagt som en sirkulær koloni på bestrøket eller ubestrøket platen8. Begrunnelsen for dette plating strategi er å skaffe celle ark med definerte kanter, som kan overføre eller invadere i celle-fri omegn uten å forstyrre kulturen av fjerning av celler eller setter inn. Det overordnede målet med punkt analysen er å observere migrering av cellen ark målt ved kanten forskyvning eller koloni diameter, samt å utføre time-lapse imaging å analysere vandrende fenotypen av celler i høyere spatio-temporale oppløsning.
Celle migrasjon kan påvirkes av en rekke microenvironmental signaler som chemokines, cytokiner og vekstfaktorer som EGF. EGF er en vekst faktor som utøver sin biologiske effekter via binding til sin reseptoren, EGF reseptor9, og øker invasiv og metastatisk oppførsel av tumor celler4,9,10. Her, punkt analysen brukes til å studere EGF stimulert celle migrasjon i en menneskelig invasiv, lunge koloni danner bryst kreft cellen linje (MCF10CA1a)8,11,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. coating av retter (dag 1)
Merk: Sørg for ikke å forlate fingeravtrykk eller støv på bunnen av platen når du håndterer den.
- Tine musen kollagen IV på is, og fortynn den med 50 mM HCl (pH 1.3) for å forberede 3 mL en 10 µg/mL kollagen IV løsning.
Merk: Kollagen fremskynde på 37 ° C. Derfor er det viktig å holde kollagen løsningen på en lav temperatur mens tining og arbeide med den. Unngå gjentatte fryse-Tin sykluser ved å forberede riktig størrelse dele og lagre dem på-80 ° C. - Legge til 250 µL kollagen IV løsning i hver brønn av 12-vel glass bunnplater og plassere dem i en passende størrelse, tett-avsluttende plasteske. Plass wet papirhåndkle over og rundt platene å produsere en fuktig kammer og lukke. Inkuber platene over natten i romtemperatur.
Merk: Som bare vekst området må være belagt, er det tilstrekkelig å bare dekke cover slip, som er festet til bunnen av platen, med kollagen løsning (se figur 1A, B for en skjematisk av plate). - Neste morgen, skyll plater med deionisert H2O å fjerne ikke-absorbert kollagen og buffer. Direkte vannet til kanten av platen godt, ikke til kanten dannet av plate nederst og til dekkglassvæske (hvis vann er pipetted i dette området det vil sprute). Air-Dry plater i laminær strømning panseret. Bruke plater umiddelbart eller lagrer på 4 ° C i opptil 5 dager.
Merk: Forskjellige linjer kan kreve ulike belegg, som fibronectin eller kollagen jeg.
2. plating Dot analysen (dag 2)
-
Forbereder celle suspensjon
- For å forberede celle suspensjon, bruke celler som har blitt dyrket i 60 mm vev kultur parabol i DMEM/F12 medium med 5% hest serum til 80% samløpet
- Skyll cellene med kalsium og magnesium-gratis Dulbecco fosfat bufret saltvann (DPBS) en gang legge 500 µL trypsin-EDTA (romtemperatur) og ruge celler for 3-5 minutter i en inkubator på 37 ° C, 5% CO2, fuktet atmosfære.
- Suspendere frittliggende cellene i 4,5 mL kultur medium å stoppe trypsin aktivitet og telle en 20 µL aliquot av cellen suspensjon i en hemocytometer.
- Pellets gjenværende cellene i en 15 mL konisk tube med sentrifugering 200 x g for 3 min, Sug opp nedbryting og resuspend cellene i kultur medium til 3 x 106 celler/mL.
Merk: For andre belegg underlag og/eller linjer, optimal celle tetthet må opprettes i en fortynning serie. 3 x 106 celle/mL anbefales som utgangspunkt.
-
Plating celler
- Sted en 10 µL dråpe celle suspensjon i midten av hver cover slip av kollagen IV belagt 12-vel glass bunnplaten uten å berøre eller skrape belegget (figur 1A, B). Inkuber platen i 30 min ved 37 ° C, fuktet atmosfære at cellene å feste. Kontroller i en invertert mikroskop som cellene er knyttet.
Merk: Dette kan best sees ved slipp, der dannelsen av en monolayer kan observeres (figur 1C). Eventuelt ruge platen opptil 3 h. Pass på at luftfuktigheten i inkubatoren er høy nok som dråper kan tørke ut fort. Hvis en reduksjon av slipp volumet i dette trinnet er observert, legge PBS til mellomrommene mellom brønnene øke fuktighet. - Forsiktig vaske brønner med 1 mL av kultur medium å fjerne ikke-tilknyttede celler. Tilsett 1 mL kultur medium hver brønn. Sjekk i en invertert mikroskop at ingen flytende celler forblir, ellers vaske brønnene igjen. Inkuber celler overnatting på 37 ° C, 5% CO2, fuktet atmosfære, å få veldefinerte celle ark.
Merk: Flytende celler er sannsynlig å knytte til platen og til uønskede celle kolonier.
- Sted en 10 µL dråpe celle suspensjon i midten av hver cover slip av kollagen IV belagt 12-vel glass bunnplaten uten å berøre eller skrape belegget (figur 1A, B). Inkuber platen i 30 min ved 37 ° C, fuktet atmosfære at cellene å feste. Kontroller i en invertert mikroskop som cellene er knyttet.
3. stimulere cellene (3. dag)
- Sjekk alle brønner med en omvendt mikroskopet slik at celle kolonier har vokst riktig. Om nødvendig merker uegnet brønner og ikke bruker dem.
- Label hver brønn av platen riktig for hver betingelse undersøkt. Kjør hver betingelse i to og tre eksemplarer.
- Endre mediet sulte cellene i DMEM/F12 med 0,1% hest serum (sultende medium) 3 h før celler blir stimulert.
- Stimulere cellene med tillegg av EGF (5 ng/mL siste konsentrasjon) eller andre ønskede meglere og bland forsiktig mediet bruker en 1 mL micropipettor eller av virvlende platen.
- Inkuber platen i 1-4 dager å observere kanten fortrengning og kanten kontur som beskrevet i kapittel 4.1 eller utføre tidsinnstilt bildebehandling som beskrevet i delen 4.2.
4. visualisering av cellen kolonier og celle migrasjon
-
Hematoxylin-eosin (han) flekker for å måle kolonien vekst (dag 4-7)
- Ordne celler i 70% etanol (1 mL/vel) i ~ 2 min.
- Stain kjerner med hematoxylin (1 mL/vel), ~ 2 min.
- Vask celler med vann (1 mL/vel) til kjerner er blå, 5-10 min.
- Flekk cytoplasma med eosin (1 mL/vel), ~ 2 min.
- Skyll med deionisert vann (1 mL/vel).
Merk: Hematoxylin og eosin løsninger kan samles og brukes flere ganger til den flekker blir svak. - Air-Dry platen.
- Snu platen og måle dot diameter med en linjal. Alternativt ta bilder av platen med et kamera, og analysere dot diameter i ImageJ.
-
Time-lapse mikroskopi (dag 3)
- Slå på mikroskopet inkubator og justere temperaturen til 37 ° C. Fyll luftfukter med dH2O. Juster CO2 til 5%. Kontroller at inkubator kammeret er fuktet og at motorisert scenen kan bevege seg fritt. Lukk inkubator kammeret og tillate mikroskop for å justere til 37 ° C.
Merk: Mikroskopet (se tabell for materiale) brukes her skal være oppvarmet til 37 ° C i minst 3 h før cellene er fotografert for å unngå drivende i fokus. - Plasser platen på scenen av inkubator mikroskopet og definerer listen scenen. Bildet to motstridende kantene og midten av hver celle dot (figur 1A).
- Ta bilder hver 3 minutter, 15-24 h med 10 X målet. Laste ned data og fortsette med bildeanalyser i et program av valget, f.eksImageJ eller Matlab.
- Slå på mikroskopet inkubator og justere temperaturen til 37 ° C. Fyll luftfukter med dH2O. Juster CO2 til 5%. Kontroller at inkubator kammeret er fuktet og at motorisert scenen kan bevege seg fritt. Lukk inkubator kammeret og tillate mikroskop for å justere til 37 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dot analysen presenteres her (figur 1) ble utført ved hjelp av invasiv, lunge kolonien danner brystkreft celler (MCF10CA1a) som en modell. Dot analysen gir svært reproduserbar celle prikker i hånden til nybegynnere, gjør det en praktisk og lett å utføre analysen (figur 1D). Dot analysen kombinert med han flekker eller tidsinnstilt bildebehandling og påfølgende partikkel bilde velocimetry (PIV) lar studiet av ulike migrasjon parametere inkludert forskyvning av epitelial kanter, celle hastighet og celle retningen som celler i kantene en epithelial ark overføre til en celle fritt område. I utgangspunktet avslørte fase kontrast avbilding av cellen prikker at invasiv, lunge kolonien danner brystkreft celler (MCF10CA1a) opprettholde en mesenchymal fenotypen etter stimulering med EGF. Imidlertid er enkeltceller forlate arket observert oftere i EGF-stimulert celle punkter (figur 2, piler). Responsen av MCF10CA1a celler EGF ble ytterligere vurdert av han flekker av kulturer som ble stimulert med EGF for 4 dager. Faktisk resulterte EGF-stimulering i en økt kolonien diameter (Figur 3). Disse observasjonene angir at overføringen av EGF stimulert celler kan endres.
Derfor var dot analysen neste benyttes for å utføre en mer detaljert analyse av dynamisk migrering fenotypen MCF10CA1a celle ark. Celler på arket kantene ble fotografert 9 h etter stimulering av celler med EGF (Video 1 og Video 2) og bildene ble deretter analysert av PIV i Matlab4,13,14. PIV avslørte at EGF øker celle hastighet (Figur 4A) til 0.63 µm/min fra 0,45 µm/min i kontroll celler. Samtidig, EGF økt retningen av celler, og dette angis av en reduksjon av variasjon av cellen retningen (kantete oppslag) fra 0,95 i kontroll kulturer til 0,79 i EGF-stimulert kulturer (Figur 4B). EGF økt den radielle avviket epithelial kant over 9 h fra 257 µm til 356 µm (Figur 4), som ble også observert av han flekker etter 4 dager (Figur 3). Dermed viser bruk av dot analysen i kombinasjon med forskjellige påfølgende analyser at EGF endrer migrering på kantene av MCF10CA1a celler ark slik at celle hastigheten og retningen er økt, noe som resulterer i en økt kolonien radius.
Figur 1: Imaging dot analysen. (A, B) Celler er belagt som en sirkulær koloni i midten av glass bunn platen brønner. For migrasjon analyse, er bilder tatt på to motstridende kanter samt sentrum av kolonien (A). (C) mørke felt bilde av celle dot under plating (venstre) og i høyere forstørrelse (kontrast) viser kanten av drop og kanten av cellen punktum etter celler knyttet til plate (midten). Tilknyttede cellene er flatt og mangekantede, mens ikke-tilknyttede celler er runde (høyre). (D) Diameteren på prikkene er svært reproduserbare. Prikker ble fotografert umiddelbart etter plating og før celler ble stimulert og diameteren bestemmes ved hjelp av ImageJ. Prikk-størrelse er svært reproduserbar i et eksperiment også mellom forskjellige brukere og liten opplæring er nødvendig for å få ferdigheter i plating celle prikkene (E = mer enn 10 års erfaring i vev kultur, jeg = mindre enn 4 uker erfaring i vev c ulture). n = 12 punkt per gruppe. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: EGF modulerer morfologiske fenotypen av MCF10CA1a celler. MCF10CA1a celler var utsultet for 3t i DMEM/F12 supplert med 0,1% hest serum før de ble stimulert med EGF (5 ng/mL). Ytterst på EGF-stimulert kolonier enkeltceller tendens til å overføre av arket (piler). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : EGF øker netto veksten av cellen kolonier. MCF10CA1a celler var utsultet for 3t DMEM/F12 medium supplert med 0,1% hest serum før de ble stimulert med EGF (5 ng/mL). fire dager senere, var celler etanol fast og farget med Hematoxylin og Eosin. EGF-stimulert prikker har høyere diameter etter 4 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : EGF modulerer vandrende fenotypen av MCF10CA1a celler. MCF10CA1a celler var utsultet for 3t DMEM/F12 medium supplert med 0,1% hest serum før de ble stimulert med EGF (5 ng/mL). Cellene ble fotografert hver 3 minutter for 9 h. etterfølgende partikkel velocimetry bildeanalyser ble utført i Matlab13. Hastighet verdiene representerer gjennomsnittlig hastighet over tid for hvert felt. Kantete spredning av hastighet vektorer beregnet som:
hvor 
, og varierer fra 0 (høy retningen) 
(lav retningen). En nedgang i kantete oppslag regnes en økning i retningen. Radielle avviket ble beregnet ved å trekke kolonien radius på t = 0 h fra kolonien radius på t = 9 h. EGF-stimulering av MCF10CA1a celle prikkene resultert i økt celle hastighet (A; øvre panel), redusert kantete spredning eller økt retningen (B, midten panelet), og økt kolonien radius (C, nedre panelet). Dataene representerer gjennomsnittlig ± SEM n = 3 eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: Tidsinnstilt bildebehandling unstimulated MCF10CA1a celler. Bildene ble tatt hver 3 minutter for 9 h. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 2: Time-lapse imaging celleområde MCF10CA1a stimulert med EGF (5 ng/mL). Bildene ble tatt hver 3 minutter for 9 h. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under progresjon kreftceller migrere fra vev av opprinnelse å invadere de omkringliggende vev og metastase til fjerntliggende områder15. Migrering av celler fra en celle koloni kan observeres i punkt analysen. Her, er punkt analysen illustrert ved å analysere vandrende fenotypen av menneskelige brystkreft celler svar på EGF.
For å oppnå nøyaktig og replicable resultat flere trinn i oppsettet av dot er analyser avgjørende. Først bestemmer belegget på platen hvis og hvor sterk celler kan følge platen og hvis cellene overfører. Forsiktighet bør utvises at belegget på platen med kollagen IV eller andre ekstracellulær matrix er homogen å minimere eksperimentell variasjoner. Videre må det sikres at cellene undersøkt koble til og overføre på bestrøket plate, og flere eksperimenter med ulike matriser i flere konsentrasjoner kan være nødvendig å optimalisere belegg betingelsene for en valgt celle linje. Andre er den nøyaktige plating cellene avgjørende for reproduserbarhet. Fotavtrykk av cellen drop bestemmer størrelsen på cellen dot samt formen. Ideelt sett plasseres drop uten pipette spissen berøre overflaten. Figuren av drop er så avhengig av overflatespenning på tallerken overflaten, noe som resulterer i en sirkulær fotavtrykk av reproduserbar diameter. Følgelig kan diameteren på den celle prikken endres ved å endre volumet av cellen suspensjon belagt.
Dermed er flere punkter å vurdere når du utfører dot analysen. For det første må celle tettheten av cellen suspensjon justeres til belegget og samme celle type. Generelt, hvis miste sprer større, for høyere celle tettheter å plate celler i confluent monolayers. Videre må flere celler være belagt for å få en confluent monolayer hvis cellene er små og ikke spre mye i forhold til store, sprer celler. Dernest dot analysen kan bli vedtatt til forskjellige plate formater, og for dette dot størrelsen kan tilpasses til mindre brønner ved å redusere volumet av prikken belagt, og eventuelt større prikker kan være belagt ved hjelp av høyere slipp volumer. For det tredje kan noen cellen linjer ikke vil legge til platen innen 30 min, da plating tiden utvides opptil 3 h. Tilsvarende belegget på platen må være egnet for cellene å overføre på og bekymre burde være tatt ikke å klø belegget når plating cellene. Hvis celler ikke feste eller overføre på valgte matrisen, andre typer belegg, for eksempel kollagen 1 eller fibronectin, kan utforskes eller konsentrasjoner av matrix proteiner og inkubasjon ganger inkubasjon temperaturer under belegget på platene endret. Egnet ekstracellulær matrix for bestemte linjer kan bli funnet i litteraturen.
Dot analysen har noen begrensninger. Det er en todimensjonal migrasjon analysen og dermed dette kan anses som en ulempe i forhold til tredimensjonale analyser, som er imidlertid mer vanskelig å utføre enn todimensjonal analyser. Et stort problem kanskje er at celle spredning kan påvirke resultatene, spesielt hvis raskt voksende cellelinjer brukes og celle migrasjon vurderes over lengre perioder som ble gjort her for analyse av kolonien diameter etter 4 dager. Tilsvarende i scratch analyser påvirkes nedleggelsen av en ripe sår av celle spredning i cellen arket; og i Boyden kammeret analyser, spesielt hvis serum- eller andre meglere som induserer celle proliferations brukes som en chemoattractant, økt celle spredning i bunnen kammeret kan forskyve resultatene. Enkelt celle sporing kan brukes spesielt observere bevegelsen av ikke-voksende celler. Videre kan celle spredning reduseres av (i) serum sult som gjort her og/eller (ii) hemming av mitose ved tillegg av mitomycin eller andre spredning hemmere4,16. For å redusere celle spredning, men må utvises å ikke skade cellene i et omfang som de ikke lenger kan overføre. Interessant, fant vi i en lignende ubegrenset overføring analysen at celle spredning ikke er korrelert med kanten fortrengning, selv om det er involvert i å opprettholde epithelial ark integritet under overføring4,5, 17. Dette åpner et interessant spørsmål: er celle spredning en nødvendig komponent av migrasjon av cellen arket? Det forventes at overføringen av cellen ark med sterk celle-celle adhesjon i omgivelsene vil påvirkes negativt hvis spredning blokkeres helt, som arket til slutt vil ikke lenger kunne utvide og støtte overføring av celler. På dette punktet, cellene skal enten sen eller stopp overføring eller arket skal forstyrre. Omvendt, migrering av ark med lav celle-celle adhesjon kan bli mindre berørt som cellene kan forlate arket for å overføre uavhengig, som spredning på kanten av epitelial arket. Dermed celle migrasjon og celle spredning er avhengige av hverandre, og ethvert forsøk på å blokkere celle spredning å studere ark overføring må vurderes nøye. Analyser analysere ark overføringen utføres dermed det meste under serum sult som reduserer men ikke avskaffe celle migrasjon.
Andre migrasjon analyser å studere ark overføring på todimensjonale overflater inkluderer scratch eller såret analysen, og mer nylig, ubegrenset overføring analyser bruker silisium eller PDMS kamre og sjablonger som tillater plating av celler innenfor definerte områder og ubegrenset overføringen av celler i området celle-fri etter fjerning av kammeret eller sjablong1,3,4,5,6,7,16. Disse sistnevnte analyser og dot analysen tilbyr høy reproduserbarhet i hånden av erfarne samt uerfarne brukere som cellen plating bestemmer den formen og størrelsen av kolonien. Derimot avlysning av mobilnettet monolayer i scratch analyser krever praksis, og selv i hendene på eksperter deler av arket kan bli dratt ut feilaktig hvis linjer som tett monolayers brukes. Dette problemet er forbedret når silikon kamre eller sjablonger brukes for plating cellene, selv om vi observerte feilaktige såret celle ark etter fjerning av Ibidi kamre. Dot analysen unngår problemet som cellene er belagt i en koloni og lov til å vokse fritt. Av samme grunn kan punkt analysen også cellene overføre på uendret belegget, som er lett forstyrret av avlysning eller fjerning av kammer/sjablongen i andre migrasjon analyser. Videre, som celler ikke er skadet av avlysning eller fjerning av kammer/sjablonger, celle død og tilknyttede utgivelsen av cytokiner forbundet med fjerning av kammer/sjablonger har ingen innvirkning på migrasjon i punkt analysen. Til slutt, celler er ofte over tallerken scratch analyser og analyser kamre eller sjablonger. Dermed etter fjerne celler ved riper av eller fjerne fysiske barrierer som hindrer celle migrasjon, celle-monolayer vil slappe av og celle er presset, sprer inn i celle-fri området uten aktivt migrering. I kontrast i punkt analysen, kan celle ark etablere seg over natten før overføringen er observert, og celle migrasjon i stedet for avslapning i for cellen kan observeres.
Dot analysen, som kan utføres enkelt uten noen spesialisert utstyr, gir seg til en rekke etterfølgende analyser, inkludert flekker av celler å vurdere brutto kolonien morfologi og celle spredning8immunostai-8, time-lapse bildebehandling, og påfølgende dataanalyse bruker ImageJ, Matlab eller andre bildet analyse programvare13. Tilleggsparametere beskriver som sammenheng av nærliggende vektorer eller deres separasjon baner kan vurderes mer presist sammenhengen i cellen bevegelse innenfor ark13. Tidsinnstilt bildebehandling kan også kombineres med immunostaining og ImageJ støttes celle sporing for å få ytterligere innsikt i celle migrasjon. For eksempel prikker kan være immunostained for cellen cytoskjelett proteiner etter tidsinnstilt bildebehandling, og cellene kan deretter spores bruker ImageJ for å analysere hvordan uttrykket av disse proteinene påvirker vandrende fenotypen av celler. En annen fremtidig bruk er enkelt celle sporing av celler som uttrykker kjernefysiske fluorescerende proteiner. Viktigst, punkt analysen kan utføres i flere bra plater og er så egnet for middels til høy gjennomstrømming tenkelig, gjør det en lett tilgjengelig og rimelig verktøy til skjermen effekten av narkotika eller shRNAs på arket migrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Forfatteren ønsker å takke Bhagawat Subramanian, Yi (Jason) Chang, Paul Randazzo, og Carole Parent for leser og kommenterer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Intramural forskningsprogrammet av National Cancer Institute, National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MCF10CA1a cells | Karmanos Research Institute | N/A | cells used for assay |
| mouse collagen IV | BD Biosciences | 354233 | used to coat plates |
| trypsin / EDTA | Thermo Fisher | 25300054 | used to remove cells from tissue culture plates |
| DPBS | Mediatech | 21-031-CV | used to wash cells |
| DMEM / F12 | Thermo Fisher | 11320082 | used as culture medium |
| horse serum | Thermo Fisher | 26050088 | used to supplement culture medium |
| 12 well glass bottom plate | MatTek | P12G-1.5-14-F | used to grow cells for imaging |
| EGF (epidermal growth factor, human recombinant) | Peprotech | AF-100-15 | used to stimulate cells |
| fatty acid free BSA | Sigma | A8806-1G | used to make buffer for EGF |
| hematoxylin | Sigma | HHS32 | used to stain colonies |
| eosin | Electron Microscopy Sciences | 26051-10 | used to stain colonies |
| 37 °C, 5% CO2 incubator | Sanyo | model MCO-18AIC (UV) | |
| Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage | Zeiss | model Axio Observer.Z1 | used for time lapse imaging |
| ORCA Flash LT sCMOS camera | BioVision | C11440-42U-KIT | used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver |
| Metamorph | BioVision | MMACQMIC | software used for time lapse imaging |
| inverted microscope | Olympus | model IX70 | used to count cells and to check colonies in tissue culture |
| plastic box | Lock&Lock | N/A | used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used) |
References
- Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
- Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859 (2013).
- Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
- Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
- Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832 (2010).
- Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
- Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
- Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
- Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
- Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001 (2016).
- Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
- Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).
