Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Cancer Research

Использование Dot пробирного анализа миграции клеток листов

doi: 10.3791/56451 Published: December 5, 2017

Summary

Миграции клеток имеет важное значение для развития, ткани технического обслуживания и ремонта и tumorigenesis и регулируется chemokines факторов роста и цитокинов. Этот протокол описывает точка assay, двухмерный, неограниченной миграции пробирного для оценки миграционных фенотип вложения, сплоченной ячеек листов в ответ на microenvironmental подсказки.

Abstract

Хотя статические сложных организмов, их тканей находятся под непрерывный оборот. Как клетки возраст, умирают и они заменены новых клеток, клеток в тканях плотно организовали способом перемещать. Во время развития опухоли это равновесие нарушается, и оставить опухолевых клеток эпителия происхождения вторгнуться местные микроокружения, поездки в отдаленные места и в конечном счете формируют метастатические опухоли на удаленных объектах. Assay точка относится простой, двумерные неограниченной миграции, для оценки чистого движения ячеек листов в зоне клеток и проанализировать параметры миграции клеток с использованием промежуток времени визуализации. Здесь, точка assay демонстрируется с использованием человека инвазивные, легких колонии, образуя линию клеток рака молочной железы, MCF10CA1a, анализ миграционных ответ клетки на эпидермального фактора роста (EGF), который известен увеличить потенциал злокачественных клеток рака молочной железы и для изменения миграционных фенотипа клетки.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Анализов миграции широко используются для оценки инвазивных и метастатического потенциала опухоли клетки в пробирке. Чаще всего раны или скретч анализа используется для оценки миграции эпителиальных листов в ячейки очистили площадь1,2,3. Чтобы выполнить скретч assay, клетки покрыты в монослое и «нуля» или ячейки свободно OBLASTь создается с кончиком пипетки. Царапины легко настроить с общедоступными культуры ткани поставок и может осуществляться в нескольких хорошо пластины, позволяя для обработки нескольких образцов. Однако как царапины, клетки физически удаляются из монослоя и часто проходят смерти клетки. Кроме того внеклеточного матрикса, прикреплены к плите часто повреждены во время процесса царапин. Аналогично, использование кремния вставляет (например, Ibidi камер4) или трафаретов5,6,7 может привести к механическое разрушение клеток и частичное удаление матрицы белков используется для покрытия плиты. Еще одним недостатком анализов, мониторинг закрытие раны или царапин является их ограниченного времени курс, как миграции клеток могут быть проанализрованы лишь до нуля закрыт.

При выполнении точка assay, клетки покрыты как круговой колонии на пластины с покрытием или без покрытия8. Обоснование этой стратегии покрытия является получение ячеек листов с определенными краями, которые можно перенести или вторгнуться в прилегающих районах, свободных клеток не нарушая культуры путем удаления клеток или вставки. Общая цель пробирного точка является соблюдать миграции клеток листов как измеряется края перемещения или диаметр колонии, а также выполнять покадровый визуализации для анализа миграционных фенотипа клетки в пространственно временным разрешением.

Миграции клеток могут быть затронуты различные microenvironmental подсказки как chemokines, цитокинов и факторы роста, такие как EGF. EGF-это фактор роста, что оказывает его биологические эффекты через привязку к своим рецептором, EGF рецептор9и увеличивает инвазивных и метастатические поведение опухоли клетки4,9,10. Здесь, пробирного точка используется для изучения EGF стимулировали миграции клеток колонии человека инвазивные, легкого формирования груди рак клеток линии (MCF10CA1a)8,11,12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. покрытие блюд (1 день)

Примечание: Не забудьте оставить отпечатки пальцев или грязь на нижней части пластины при обращении с ней.

  1. Размораживание мыши коллаген IV на льду и разбавить 50 мм HCl (рН 1.3) подготовить 3 мл раствора 10 мкг/мл коллаген IV.
    Примечание: Коллаген будет выпадать в осадок при 37 ° C. Поэтому важно, чтобы коллагена раствор при низкой температуре во время работы с ним и оттаивания. Избегать повторного замораживания оттаивания циклы подготовки соответствующего размера аликвоты и хранение их в-80 ° C.
  2. Добавить 250 мкл коллаген IV решение в каждой скважине 12-ну стекла дно и поместите их в соответствующего размера, плотно закрывающиеся пластиковой коробке. Место влажной салфеткой над и вокруг пластин для производства влажных камеры и закрыть окно. Инкубируйте пластины на ночь при комнатной температуре.
    Примечание: Как только области роста должна быть покрыты, это достаточно, чтобы охватывать только крышка выскальзования, который прикреплен к нижней части пластины, с коллагена раствор (см. Рисунок 1A, B для схема плиты).
  3. Следующее утро промойте пластины с дейонизированной H2O дважды, чтобы удалить не поглощается коллагена и буфера. Направляйте воду до края плиты, хорошо, не к краю образованного нижней пластины и coverslip (если вода накапаны в этой области, которую он будет плескаться). Просушите и пластины в Ламинарный шкаф. Сразу использовать плиты или хранить при 4 ° C на срок до 5 дней.
    Примечание: Может потребоваться различных клеточных линий, различных покрытий, например фибронектин или коллагена я.

2. покрытие Assay Dot (день 2)

  1. Подготовка суспензию клеток
    1. Для приготовления суспензии клеток, используйте клетки, которые были выросли в культуре ткани 60-мм блюдо в среде DMEM/F12 дополнена сыворотки крови лошади 5% до 80% слияния
    2. Один раз ополосните клетки с свободного кальция и магния Дульбекко фосфатный буфер (DPBS), добавить 500 мкл трипсина ЭДТА (комнатной температуры) и инкубации клеток для 3-5 мин в инкубаторе при 37 ° C, 5% CO2, увлажненные атмосферу.
    3. Приостановить отдельные ячейки в 4,5 мл питательной среды для остановки активности трипсина и рассчитывать 20 мкл Алиготе суспензию клеток в Горяева.
    4. Пелле оставшиеся ячейки в 15 мл Конические трубки центрифугированием при 200 g x 3 мин, аспирационная супернатант и Ресуспензируйте клетки в культуре средне-3 х 106 клеток/мл.
      Примечание: Для других покрытие подложек и/или клеточных линий, плотность оптимальной клеток должны создаваться в серии разрежения. в качестве отправной точки рекомендуется 3 х 106 клеток/мл.
  2. Покрытие клетки
    1. Место падение 10 мкл суспензии клеток в центре каждого крышка выскальзования коллаген IV покрытием стекла 12-ну нижней плиты без прикосновения или царапин покрытие (рис. 1A, B). Инкубируйте пластину на 30 минут при 37 ° C, увлажненные атмосферу, чтобы позволить клетки для присоединения. Проверьте в инвертированным микроскопом клетки прилагаются.
      Примечание: Это лучше всего видно на крае падения, где формирование монослоя может наблюдаться (рис. 1C). При необходимости, инкубировать пластины до 3 ч. Будьте уверены, что влажность воздуха в инкубаторе является достаточно высоким, как капли могут высыхать быстро. Если наблюдается сокращение объема падение во время этого шага, добавьте PBS в промежутках между скважин для увеличения влажности воздуха.
    2. Осторожно промойте лунки с 1 мл питательной среды дважды, чтобы удалить не придает клетки. Добавьте 1 мл питательной среды в каждой скважине. Регистрация инвертированным микроскопом, что нет плавающей клетки остаются, иначе снова помойте скважин. Инкубируйте клетки на ночь при 37 ° C, 5% CO2, увлажненные атмосферу, чтобы получить четко определенных ячеек листов.
      Примечание: Плавающие клетки, вероятно, чтобы повторно присоединить к пластине и сформировать нежелательных клеток колонии.

3. стимулирование клеток (день 3)

  1. Проверьте все скважины с использованием инвертированный микроскоп для обеспечения этой ячейки, которую колоний выросли должным образом. При необходимости, Марк неподобающе скважин и не использовать их.
  2. Этикетке каждой скважины пластины надлежащим образом для каждого условия расследование. Запустите каждое условие в двух экземплярах или в трех экземплярах.
  3. Изменение среднего голодать клеток в среде DMEM/F12, содержащие 0,1% лошадь сыворотки (голодающую средний) 3 ч до стимулируются клетки.
  4. Стимулируют клетки с добавлением EGF (конечная концентрация 5 нг/мл) или других желаемых посредников и осторожно перемешать носитель, с помощью micropipettor 1 мл или закрученной пластину.
  5. Инкубировать пластину для 1-4 дней наблюдать смещение кромки и края контура, как описано в разделе 4.1 или выполнять покадровый изображений, как описано в разделе 4.2.

4. Визуализация колоний клеток и клеток миграции

  1. Гематоксилином эозином, (он) пятная для измерения роста колонии (4-7 день)
    1. Исправьте клетки в 70% этанола (1 мл/хорошо) ~ 2 мин.
    2. Пятно ядер с гематоксилином (1 мл/а), ~ 2 мин.
    3. Вымыть клетки с водопроводной водой (1 мл/хорошо) до ядра являются синий, 5-10 мин.
    4. Цитоплазма пятно с эозином (1 мл/а), ~ 2 мин.
    5. Ополосните деионизированной водой (1 мл/хорошо).
      Примечание: Гематоксилином и эозином решения могут быть собраны и использованы несколько раз до тех пор, пока окрашивание становится слабым.
    6. Воздушно-сухой плиты.
    7. Флип пластину и измерить диаметр точка с правителем. Кроме того принимать фотографии пластины с камерой и анализировать точка диаметра в ImageJ.
  2. Покадровой микроскопии (день 3)
    1. Переключитесь на микроскопе инкубатора и отрегулировать температуру до 37 ° C. Заполните увлажнитель с dH2O. Adjust CO2 до 5%. Убедитесь, что палата инкубатор увлажняется и что моторизованного столика можно свободно перемещать. Закрыть камеру инкубатора и позволяют Микроскоп, чтобы приспособиться к 37 ° C.
      Примечание: Микроскоп (см. таблицу материалы) используется здесь должна быть нагрета до 37 ° C, по крайней мере 3 часа, прежде чем клетки отражаются во избежание Дрифтинг Фокус.
    2. Установите пластину на сцене в инкубатор микроскоп и настройте стадии список. Центр каждой ячейки точки (рис. 1A) и два противоположных краев изображения.
    3. Возьмите изображения каждые 3 минуты, 15-24 часа с помощью 10 X цель. Загрузка данных и продолжить анализ изображений в программе выбора, например, ImageJ или Matlab.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Assay точка, представленные здесь (рис. 1) была выполнена с помощью инвазивных, легких колонии, формирование клеток рака молочной железы (MCF10CA1a) в качестве модели системы. Assay точка дает высокую воспроизводимость ячейки точки даже в руки новичков, что делает его удобным и легко выполнить пробирного (рис. 1D). Assay точка в сочетании с он окрашивание, или промежуток времени обработки изображений и последующих частиц изображения Велосиметрия (PIV) позволяет изучение различных параметров миграции, включая перемещение эпителиальными края, скорость клеток и клеток направленность как клетки на краях Эпителиальный листа мигрируют в зоне клеток. Первоначально фаза контраст изображения точек клеток показало, что инвазивными, легких колонии формируя клеток рака молочной железы (MCF10CA1a) поддерживать мезенхимальных фенотип после стимуляции с EGF. Однако отдельные клетки, оставляя листа наблюдаются чаще в EGF-стимулирует клетки точек (рис. 2, стрелок). Он далее оценивали ответ MCF10CA1a клеток на EGF окрашивания культур, которые были стимулировали с EGF на 4 дня. Действительно EGF-стимуляции привели к увеличению колонии диаметр (рис. 3). Эти наблюдения показывают, что миграция EGF стимулируется клетки может быть изменено.

Таким образом точка assay далее использовался для выполнения более подробный анализ динамической миграции фенотипа MCF10CA1a ячеек листов. Клетки на краях листа были образы для 9 h после стимуляции клеток с EGF (видео 1 и видео 2) и изображения затем были проанализированы PIV в Matlab4,,1314. PIV показали, что EGF увеличивает скорость клеток (рис. 4A) 0,63 мкм/мин от 0,45 мкм/мин в ячейках элемента управления. В то же время EGF увеличилась направленность клеток, и это обозначается снижение изменчивости направленность (угловой спред) клеток от 0,95 в культурах управления до 0,79 EGF-стимулирует культур (рис. 4B). EGF увеличилась радиального перемещения эпителиальных края более 9 h от 257 мкм до 356 мкм (рис. 4), как было также отмечено, он пятная после 4 дней (рис. 3). Таким образом использование assay точка в сочетании с различными последующие анализы показывает, что EGF изменяет миграции на краях листов MCF10CA1a клеток, таким образом, что ячейки скорость и направление увеличиваются, что приводит к увеличению колонии радиус.

Figure 1
Рисунок 1: Imaging точка assay. (A, B) Клетки покрыты как круговой колонии в центре стекла Нижняя тарелка скважин. Для анализа миграции изображения взяты на два противоположных краев, а также центр колонии (A). (C) темное поле изображение клетки точка во время покрытия (слева) и увеличение (Фазовый контраст) показаны края падение и краем ячейки точка после клетки, прилагается к пластине (в центре). Прилагаемый клетки плоские и прямолинейное, в то время, как не вложенные клетки круглые (справа). (D) Диаметр точек высокую воспроизводимость. Точки были образы сразу же после покрытия и прежде были стимулировал клетки и диаметр определяется с помощью ImageJ. Размер точки очень воспроизводимые в рамках одного эксперимента, а также между различными пользователями и мало подготовка требуется для получения квалификации в покрытие ячейки точки (E = более чем 10 лет опыта в культуре ткани, я = менее 4 недель опыта в ткани c ulture). n = 12 точек на группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: EGF модулирует морфологических фенотипа клетки MCF10CA1a. MCF10CA1a клетки были голодали на 3 ч в среде DMEM/F12 дополнена 0,1% лошадь сыворотки, прежде чем они стимулировали с EGF (5 нг/мл). На краю EGF-стимулирует колоний отдельные клетки, как правило, мигрируют из листа (стрелки). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : EGF увеличивает чистый рост колоний клеток. MCF10CA1a клетки были голоду для 3 h в среде DMEM/F12 дополнена 0,1% лошадь сыворотки, прежде чем они стимулировали с EGF (5 нг/мл). 4 дней, клетки были этанол фиксированной и окрашивали гематоксилином и эозином. EGF-стимулирует точки имеют высокий диаметр после 4 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : EGF модулирует мигрирующих фенотипа MCF10CA1a клеток. MCF10CA1a клетки были голоду для 3 h в среде DMEM/F12 дополнена 0,1% лошадь сыворотки, прежде чем они стимулировали с EGF (5 нг/мл). Клетки были образы каждые 3 мин для 9 h. последующие частицы изображение Велосиметрия анализ проводился в Matlab13. Значения скорости представляют средняя скорость со временем для каждого поля. Угловые распространения векторов скорости была рассчитана как:
Equation 1где Equation 2 и варьируется от 0 (высокая направленность) Equation 3 (низкая направленность). Уменьшение в угловых распространения считается увеличение в направленности. Радиальные перемещения была рассчитана путем вычитания колонии радиус при t = 0 h от колонии радиус в t = 9 h. EGF-стимуляции MCF10CA1a ячейки точки привели к увеличению клеток скорость (A; верхней панели), уменьшилось угловой распространения или увеличение направленность (B; средний Группа) и увеличение колонии радиус (C; нижней панели). Данные представляют собой среднее ± SEM n = 3 экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Movie 1
Видео 1: Промежуток времени изображений кератоз клеток MCF10CA1a. Изображения были взяты каждые 3 мин для 9 h. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Movie 2
Видео 2: Промежуток времени визуализации MCF10CA1a клеток стимулируется с EGF (5 нг/мл). Изображения были взяты каждые 3 мин для 9 h. пожалуйста нажмите здесь для просмотра этого видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Во время прогрессии опухоли клетки мигрируют от ткани происхождения вторгнуться в окружающие ткани и метастазировать в отдаленные участки15. Миграции клеток от колонии клеток может наблюдаться в assay точка. Здесь точка assay свидетельствует анализ миграционных фенотипа клетки рака молочной железы человека в ответ на EGF.

Чтобы получить точные и воспроизводимые результаты несколько шагов в настройке точки анализов являются критическими. Во-первых покрытие плиты определяет, если и как сильные клетки может присоединиться к пластине, и если клетки мигрируют. Следует позаботиться что покрытие плиты с коллаген IV или других внеклеточная матрица однородных к минимуму экспериментальной изменчивости. Кроме того необходимо обеспечить, что расследование клетки придают и мигрируют на пластину с покрытием, и несколько экспериментов с различными матрицами в нескольких концентрациях могут быть необходимы для оптимизации условий покрытия для строки выбранной ячейки. Во-вторых Точные обшивкой клеток имеет решающее значение для воспроизводимости. След падения ячейки определяет размер ячейки dot, а также его форма. В идеале падение помещается без наконечник пипетки, касаясь поверхности. Затем форма капли главным образом определяется поверхностное натяжение поверхности пластины, что приводит к круговой след воспроизводимых диаметра. Следовательно диаметр ячейки точка может быть изменено путем изменения объема суспензию клеток покрытием.

Таким образом несколько точек должны учитывать при выполнении точка assay. Во-первых плотность клеток суспензию клеток необходимо скорректировать покрытия, а также используется тип ячейки. В общем если падение распространяется шире, более высокой плотности клетки необходимы для плиты клетки в вырожденная монослои. Кроме того больше клеток необходимо покрытие для получения вырожденная монослоя, если клетки являются небольшими и не распространился как по сравнению с большой, распространяя клетки. Во-вторых точка assay может быть принят в форматах разные плиты и для этого, точка размер может быть адаптирована для мелких скважин путем уменьшения объема точка покрытием, и при желании больше точек можно покрытием с использованием выше падение объемов. В-третьих некоторые клетки, что линии не присоединит к пластине в течение 30 мин, в этом случае время покрытие может быть продлен до 3 ч. Аналогичным образом покрытие плиты должны быть подходящими для клетки мигрировать на и следует позаботиться о том, чтобы не поцарапать покрытие, когда покрытие клетки. Если ячейки не прикрепить или мигрируют на выбранной матрицы, другие виды покрытий, например коллагена 1 или фибронектин, могут быть изучены, или концентрации белков матрицы, инкубации раз и температуры инкубации во время покрытие пластин изменен. В литературе можно найти подходящие внеклеточная матрица для конкретных клеточных линий.

Assay точка имеет несколько ограничений. Это пробирного двумерной миграции и таким образом это может рассматриваться как недостаток по сравнению с трехмерной анализов, которые, однако, более трудно чем двумерных анализов. Возможно, основной проблемой является, что пролиферации клеток может повлиять на результаты, особенно если быстро пролиферирующих клеток линии используются и миграции клеток оценивается в течение более длительных периодов времени, как это было сделано здесь для анализа диаметр колонии после 4 дней. Аналогичным образом в скретч анализов закрытие нуля раны зависит от пролиферации клеток в пределах ячейки листа; и в Бойден камеры анализов, особенно если сыворотки или других посредников, которые индуцируют разрастания клеток используются как хемотаксического, увеличению пролиферации в нижней камере может исказить результаты. Одна ячейка отслеживания может использоваться специально наблюдать движение-пролиферирующих клеток. Кроме того пролиферацию клеток может быть уменьшена (i) сыворотки голода, как это сделано здесь и/или (ii) ингибированию митоза добавлением митомицин или другие ингибиторы распространения4,16. Чтобы уменьшить пролиферации клеток, однако, необходимо позаботиться не повреждение клетки до такой степени, что они больше не могут мигрировать. Интересно, что мы нашли в аналогичных неограниченной миграции пробирного что пролиферации клеток не коррелируется с краю перемещения, хотя он участвует в поддержании целостности эпителиальных листа во время миграции4,5, 17. Это открывает интересный вопрос: пролиферации клеток является необходимым компонентом миграции клеток листа? Ожидается, что миграции клеток листов с сильным ячеек спайки в окружающей среде отрицательно отразится, если распространение заблокирован полностью, как лист в конечном итоге будет больше не сможет развернуть и поддерживать миграцию клеток. На данный момент клетки следует медленно или остановить миграции, или лист должен нарушить. И наоборот миграция листов с низкой ячеек спайки могут быть менее влияние, как клетки могут оставить лист мигрировать самостоятельно, например рассеяния на краю эпителиального покрова. Таким образом ячейка миграции и пролиферации клеток являются взаимозависимыми, и любые попытки блокирования пролиферации клеток для изучения листа миграции необходимо тщательно рассмотреть. Таким образом анализов, анализируя листа миграции главным образом выполняются под голода сыворотки, которая уменьшает, но не отменить миграцию клеток.

Другие анализы миграции для изучения миграции лист на двумерных поверхностей включают царапины или раны пробирного и, более недавно, неограниченной миграции анализов с использованием кремния или PDMS камер и трафаретов, которые позволяют обшивка ячеек в определенных областях и неограниченной миграции клеток в клетки свободно OBLASTь после удаления камеры или трафарет1,3,4,5,6,7,16. Эти последние анализы и точка assay предлагают высокую воспроизводимость в руке как опытных, так и неопытных пользователей, как покрытие ячейки определяет форму и размер колонии. В отличие от царапин сотовой монослоя в скретч анализов требует практики и даже в руках экспертов частей листа может быть сорванным ошибочно если клеточных линий, которые образуют плотный монослои используются. Эта проблема улучшается, когда силиконовые палат или трафаретов используются для гальванических клеток, хотя мы наблюдали ошибочных ранив ячеек листов после удаления Ibidi палат. Assay точка избегает этого вопроса как клетки покрытием в колонию и позволено расти свободно. По тем же причинам пробирного точка также позволяет клетки мигрировать на неизмененном покрытие, которое легко нарушается царапин или удаления камеры/трафаретов в других анализов миграции. Кроме того, как клетки не получают ранения в результате царапин или удаления камеры/трафареты, мобильный смерти и связанные релиз цитокинов, связанных с удалением камер/трафареты не влияет на миграцию в assay точка. И наконец клетки часто чрезмерно покрытием в скретч анализов и проб с помощью камеры или трафареты. Таким образом после того, как очистка клетки путем царапать их покинуть или устранение физических барьеров, которые препятствуют миграции клеток, монослой клеток будет расслабиться и передаются сотовый, распространяя в свободной ячейке области без активно мигрируют. Напротив в assay точка, ячеек листов может утвердиться на ночь до миграции наблюдается, и миграции клеток, вместо того, чтобы релаксация ячейки листа можно наблюдать.

Assay точка, которая может быть легко выполнена без какого-либо специализированного оборудования, одалживает к ряду последующих анализов, в том числе окрашивания клеток для оценки валового колонии морфологии и ячейки рассеяния8, иммуноокрашивания8, промежуток времени изображений и последующего анализа данных с использованием ImageJ, Matlab или другие изображения анализ программного обеспечения13. Дополнительные параметры такие как корреляции соседних векторов или их разделения траектории могут быть оценены более точно описывают согласованности клеточного движения в пределах13листов. Промежуток времени изображения также могут быть объединены с иммуноокрашивания и ImageJ поддерживает ячейки отслеживания, чтобы получить дальнейшее представление о миграции клеток. Например точки могут быть immunostained для белков цитоскелета после покадровой съемки, а затем клетки могут отслеживаться с помощью ImageJ для анализа влияния миграционных фенотипа клетки выражение этих белков. Другого будущего использования является одной ячейки отслеживания клеток, которые выражают ядерных флуоресцентных белков. Важно то, что точка assay может осуществляться в нескольких хорошо пластины и является такой подходит для средне высокой пропускной способности обработки изображений, что делает его легко доступны и очень доступный инструмент для экрана эффект наркотиков или процессируются листа миграции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Автор не имеет ничего, чтобы раскрыть.

Acknowledgments

Автор хотела бы поблагодарить Bhagawat Subramanian, Чжан Йи (Джейсон), Пол Randazzo и Кэрол родительской для чтения и комментируя рукопись. Эта работа была поддержана интрамуральных программа исследований Национального института рака, национальные институты здравоохранения.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MCF10CA1a cells Karmanos Research Institute N/A cells used for assay
mouse collagen IV BD Biosciences 354233 used to coat plates
trypsin / EDTA Thermo Fisher 25300054 used to remove cells from tissue culture plates
DPBS  Mediatech 21-031-CV used to wash cells
DMEM / F12 Thermo Fisher 11320082 used as culture medium
horse serum Thermo Fisher 26050088 used to supplement culture medium
12 well glass bottom plate MatTek P12G-1.5-14-F used to grow cells for imaging
EGF (epidermal growth factor, human recombinant) Peprotech AF-100-15 used to stimulate cells
fatty acid free BSA Sigma A8806-1G used to make buffer for EGF
hematoxylin Sigma HHS32 used to stain colonies
eosin Electron Microscopy Sciences 26051-10 used to stain colonies
37 °C, 5% CO2 incubator Sanyo model MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver with incubator chamber and motorized stage Zeiss model Axio Observer.Z1 used for time lapse imaging
ORCA Flash LT sCMOS camera BioVision C11440-42U-KIT used for timelapse imaging in combination with Zeiss AxioObserver
Metamorph BioVision MMACQMIC software used for time lapse imaging
inverted microscope Olympus model IX70 used to count cells and to check colonies in tissue culture
plastic box Lock&Lock N/A used as humid chamber (any tight closing plastic box that fits the plates can be used)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2, (2), 329-333 (2007).
  2. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62, (1), 1-21 (2013).
  3. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, (1), 107-124 (2011).
  4. Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8, (3), 58859 (2013).
  5. Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (41), 15988-15993 (2007).
  6. Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353, (6304), 1157-1161 (2016).
  7. Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17, (4), 409-420 (2015).
  8. Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5, (3), 9832 (2010).
  9. Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366, (1), 2-16 (2006).
  10. Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501 (2013).
  11. Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65, (2), 101-110 (2001).
  12. Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112, (7), 1116-1124 (2003).
  13. Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2, (2), 025001 (2016).
  14. Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15, (2), (2013).
  15. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, (5), 646-674 (2011).
  16. Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137, (2), 11-16 (2017).
  17. Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77, (8), 4760-4763 (1980).
Использование Dot пробирного анализа миграции клеток листов
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stuelten, C. H. Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets. J. Vis. Exp. (130), e56451, doi:10.3791/56451 (2017).More

Stuelten, C. H. Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets. J. Vis. Exp. (130), e56451, doi:10.3791/56451 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter