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Medicine

脉络细胞自体移植治疗老年性黄斑变性的再生疗法: 初步体内报告

doi: 10.3791/56469 Published: February 12, 2018

Summary

本研究的目的是评估脉络移植的脂肪干细胞是否包含在基质血管和血小板丰富的血浆 Limoli 视网膜恢复技术, 可以提高视力和老年黄斑变性患者眼内视网膜敏感反应的影响。

Abstract

本研究的目的是检查自体细胞脉络移植是否能提高最佳矫正视力 (BCVA) 和对 microperimetry (我) 的眼睛的反应, 在受干旱年龄相关的黄斑变性 (AMD) 期间通过生长因子 (GFs) 在周围组织的生产和分泌。患者随机分配给每个研究组。所有患者均确诊为干性 AMD, BCVA 等于或大于1对数的最小分辨率 (logMAR)。采用 Limoli 视网膜修复技术 (LRRT) 在 a 组脉络自体移植, 其中包括11例11眼。该技术是通过植入脂肪细胞, 从基质血管分数获得的脂肪干细胞, 以及富含血小板的血浆在脉络空间中的血小板进行的。相反, B 组, 包括14眼14例患者, 被用作对照组。对于每位患者, 通过共焦扫描激光检眼镜和光谱域光学相干层析成像 (SD OCT) 验证诊断。在 A 组, 术后 BCVA 改善0.581 至 0.504 90 天, 0.376 logMAR 180 天 (升 32.20%)。此外, 我的测试在180天内增加了11.44 分贝到12.59 分贝。脉络膜后接枝的不同细胞类型能够保证其在脉络流中的恒定分泌。结果表明, 在六月后, 嫁接组的视力 (VA) 可比对照组增加多。

Introduction

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细胞治疗, 包括全身或局部注射在受伤地区的茎/祖细胞治疗多种慢性疾病, 已引起密切注意在过去十年1。自二十世纪九十年代以来, 研究了生长因子 (GFs) 在视网膜萎缩症的潜在治疗作用2。事实上, 许多人类细胞可以生产 GFs, 这是特定的蛋白质, 能够阻止或减缓细胞凋亡,, 程序性死亡的细胞3

众所周知, 干燥年龄相关的黄斑变性 (AMD) 是一种萎缩性视网膜疾病, 其中渐进和不可逆转的细胞死亡涉及感光层损伤, 因此, 中央视觉功能丧失4。AMD 是发达国家55岁以上人群失明的主要原因, 占所有黄斑退化的 80%, 至今尚无有效治疗。

有数项研究显示, 有多种来源可供自体飞行情报队获得。这些构成不同的细胞类型, 包括来自眼眶脂肪的脂肪基质细胞, 富含血小板的血浆 (PRP) 的血小板, 以及脂肪来源的干细胞 (干细胞) 包括在脂肪组织的基质血管分数 (SVF) 中5 ,6,7。目前的 GF 集确保视网膜 neuroenhancement, 和菲拉托夫, Meduri, 佩洛斯和 Limoli 进行的研究表明, 自体脂肪移植 (尾部) 是有效的8,9,10

此外, 一项先前的研究显示, 在干燥的 AMD 受影响的眼睛中, 视网膜电图 (脉络) 的数据有显著的改善, 记录后的自体移植,11。脉络空间的手术移植组织调节视网膜细胞的分泌分泌, 延缓其凋亡6,7,12。考虑外核层厚度, 豚鼠视网膜组织学检查显示, GFs 对视网膜有营养作用。因此, 直接或间接使用 GFs 可以通过分子诱导剂和抑制剂之间的平衡关系带来治疗好处6,7,12

该方法的目的是评估脂肪细胞, 干细胞在 SVF 和 PRP 的脉络移植是否能提高最佳矫正视力 (BCVA) 和 microperimetry (我) 反应在干燥的 AMD 受影响的眼睛。本研究的目的是在其 GF 生产的基础上, 展示自体移植的治疗效果, 根据引用文献6,7,12,13

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Protocol

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该研究协议经低视力学院道德委员会批准, 所有受试者均按照《赫尔辛基宣言》签署书面同意书。本研究已获得拉夫博勒和谢菲尔德大学的伦理认同。

注: 在表 1中描述了与干燥年龄相关的黄斑变性患者接受脉络自体移植的 Limoli 视网膜修复技术 (LRRT) 的纳入和排除标准。

1. 干燥年龄相关黄斑变性患者的诊断

  1. 确定用共焦扫描激光检眼镜、SD OCT 和我的诊断。
  2. 评估每组 BCVA 的距离和远近。测量 VA 为近视觉 (特写) 在点 (临时)。测量 BCVA 在时间 0 (T0), 90 (T90) 和180天 (T180) 比较早期治疗糖尿病视网膜病变研究 (EDTRS) 图表在4米在 logMAR。
  3. 记录电子暗、中间和明细胞活动, 或闪光视网膜电, 根据国际视觉临床电生理 (ISCEV)112009年制定的标准。

2. 麻醉

注: LRRT 麻醉中的金标准为局部麻醉, 经亚榫麻醉和镇静剂的渗透增强。在特定情况下, 一般麻醉是首选。

  1. 应用局部麻醉药, 在4% 和罗哌卡因1% 时, 采用局部麻醉剂注入滴状 15-20 分钟, 获得角膜和结膜麻醉。
  2. 将麻醉直接渗入亚结膜和 subtenon 的空间。
  3. 使用局部浸润在腹部区域, 在脂肪组织被提取之前, 并且在亚结膜和子榫的空间, 12 毫米从角膜缘。采用局部麻醉 carbocaine 或 marcain 混合1200内肾上腺素。
  4. 通过麻醉提供术中镇静剂, 通过重复小的口服芬太尼作为麻醉镇痛剂, 可以正确的进行。用量一般为0.025 毫克芬太尼, 每丸1毫克咪达唑仑。

3. Limoli 视网膜修复技术的制备

注意: 此技术代表佩洛斯的一种变体, 在 subscleral 空间16712中移植了眼眶自体脂肪。经手术移植的细胞可在周围组织、脉络膜和视网膜上产生多种神经营养和 angiotrophic 特性的 GFs,18,19,20,21,22 ,23,24,25。在 LRRT 中, 移植自体细胞与脉络膜之间的距离通过深巩膜降低, 茎与脉络膜的接触面积扩大, 促进分泌自体细胞分泌进入脉络膜流9, 10,14

  1. 在脉络膜和巩膜之间进行细胞移植手术前, 对每只眼睛进行适当的消毒, 这一过程称为 Limoli 视网膜恢复技术 (LRRT)15,16,17
  2. 移植干细胞, 由科尔曼et 等和劳伦斯的技术 (图 1) 从腹部脂肪, 在 SVF 在 sovrachoroidal 空间15,16,17
  3. 通过以下步骤, 从 PRP 凝胶中提取血小板浸润脂肪蒂。
  4. 离心血液6,12和收集富含血小板的血浆 (PRP)。刺激血小板脱粒导致 GF 释放脂肪蒂6,12

4. 技术规格和战略

注: 根据劳伦斯和科尔曼技术17(材料表), 从患者腹部皮层收集和纯化脂肪组织。

  1. 根据劳伦斯和科尔曼技术17 (图 2 a/2 b), 从每个病人的腹部皮下手动收获10毫升脂肪组织, 使用3毫米钝套管连接到锁定注射器。
  2. 在20摄氏度 (图 2C) 上, 用离心法将脂肪组织从血液、脂肪、油和液体中分离出来, SVF 1500 x g 的5分钟。SVF 是非常丰富的干细胞17
  3. 收集8毫升的人外周血与22克针, 并在一个单独的管为 PRP 准备。
  4. 在20摄氏度 (图 2D) 上, 离心收集的血液在 1500 x g 处为5分钟。在 LRRT, 随后的变化导致更好的生存自体脂肪移植, ADSC 增殖, 这有利于增加脉络膜灌注, 并更全面的调节作用的那些因素, 只分泌脂肪7, 11,17
  5. 建立脉络口袋 (步骤4中的更多细节, 特别是4.4 和 4.5), 以容纳从眼眶脂肪获得的移植物和饱和的剩余体积的干细胞从 SVF 和 PRP, 获得根据劳伦斯和科尔曼技术17

5. LRRT 脉络自体移植 (Limoli 视网膜修复技术): 外科手术及技术细节

  1. 锚定巩膜与6-0 丝缝合, 近颞缘。
  2. 用 5.5 "保罗·韦斯科特 Tenetomy 弯剪刀" 将结膜和 subtenonian 空间从下颞缘处打开11毫米。
  3. 在这个空间插入 Limoli 巴西莱结膜牵引器, 做一个巩膜手术场。
  4. 用5毫米的新月形刀倾斜, 在8毫米的巩膜上, 从角膜缘处切开一侧的皮瓣。瓣铰链总是径向和在外科医生的左侧。
  5. 在下颞象限, 在8毫米从角膜缘, 打开一个深巩膜门大约5毫米在侧面由径向铰链用一把新月刀, 倾斜的斜角。在适当的深度进行巩膜, 以查看脉络膜的石板色。
  6. 通过去除皮瓣远端部分的小笼盖, 以促进脉络自体移植后的血液循环, 从而产生间隙。
  7. 用眼科钳提取从下斜肌上方间隙的眼眶脂肪。确保提取的脂肪有足够的血管化, 使其能够在植入后存活下来。
  8. 轻轻地将自体脂肪瓣放在脉络膜床上, 在门近端脉络膜 6/0 polyglactin 纤维缝合。
  9. 缝合巩膜瓣以避免在脂肪蒂或其营养血管上受压迫。
  10. 采用30克角 (30°) 套管, 渗透1毫升 PRP 凝胶 (通过血液材料的离心、组分分离和血小板脱粒26) 的脂肪蒂的基质。
  11. 准备的结膜两侧的缝合。然后, 取出结膜牵引器。
  12. 用 6/0 polyglactin 纤维缝合结膜。
  13. 在关闭前, 留出一个空间插入到 subscleral 的空间, 在皮瓣, 脉络膜和自体脉络膜之间, 一个小的灵活的塑料管与自身脂肪移植。
  14. 将自体脂肪移植、脉络膜和巩膜瓣与0.5 毫升的 SVF (丰富的干细胞) 的剩余空间饱和, 以前在步骤3.2 中制备, 由一个小的柔性塑料管插入巩膜口袋。
  15. 在将剩余空间饱和后, 关闭缝合线。
  16. 手术后, 用500毫克阿奇霉素进行三天的抗生素治疗。此外, 还提供了抗生素和类固醇结合, 如氯霉素和倍他米, 约 15-20 天滴眼疗法。
    注意: 由脂肪细胞、SVF 干细胞和 PRP 组成的自体移植现在已获得26。通过深巩膜降低移植自体细胞与脉络膜之间的距离, 刺激自体细胞分泌分泌进入脉络膜流。为了同样的目的, 扩大茎和脉络膜之间的接触区域。

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Representative Results

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使用这里提出的程序, 两组的干燥 AMD 受影响的病人, 与 BCVA 等于或大于1对数的最低分辨率 (logMAR), 被登记在该研究。a 组, 包括11眼11例, 接受脉络自体移植 Limoli 视网膜修复技术 (LRRT), 而 B 组, 包括14眼14例患者, 被用作对照组。

学生的 t 检验和卡方测试分别用于比较两个研究组之间的平均年龄和性别分布 (表 2)。LRRT 手术前后进行统计学分析和数据可视化。

魏氏-曼-惠特尼签署了等级测试, 以确定治疗前后差异是否显著。这种非参数统计假设检验用于比较两个依赖样本时, 不能假定人口通常分布, 如在这种情况下。在分析的每一步都测量 VA 值。统计意义在p<0.05 中设置。

本研究对11例 (7 男性和4名女性) 十一只眼 (6 右、5只左眼) 进行了临床诊断。患者年龄从62岁到84年不等, 平均年龄为71.5 岁 (3.8 SD)。

表 2概述了 LRRT 治疗患者的临床概况, 以及手术后 0 (T0)、90 (T90) 和 180 (T180) 天记录的平均值。不良反应总是报告, 以保证最大的安全。手术后 0 (T0)、90 (T90) 和 180 (T180) 天内眼压值均未记录任何显著变化。

结果术后 LRRT 手术如下:
在 A 组, BCVA 在90天 (T90) 前从 0.581 (T0) 改为 0.504, 0.376 logMAR 180 天 (T180), 显著增加 35.20% (p < 0.01)。对照组包括14只眼14例, 7 名男性和7名女性, 平均年龄为80.4 岁, SD @ 2.3, BCVA 从 0.573 (T0) 改为 0.587 (T90), 0.601 logMAR (T180) 具有非显著平均下降 4.72% (表 2) (图 3).在 A 组中, 我的测试从 11.44 db (T0) 到 12.59 db (T180) (升 9.58%) 显著增加。(图 4), 而 B 组的术后价值没有显著改善。

Figure 1
图 1: 脉络自体移植的表达式.由脂肪细胞、富含血小板的血浆 (PRP) 和脂肪源干细胞 (干细胞) 产生的生长因子通过视网膜色素上皮 (RPE) 到达脉络膜和视网膜组织。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 技术过程.套管和随后从腹部区域提取脂肪组织 (面板A)。套管通过吸入脂肪细胞进入自己的腔内 (面板B), 将皮下脂肪与轻度穿刺移动。离心后, 有三层脂肪组织: 油 (高层), 均质脂肪 (中间层) 和血液液 (下层) (面板C)。离心后立即用血观察管。有三层: 血小板不良血浆 (PPP), 血小板丰富血浆 (PRP) 和红细胞 (面板D)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 最佳矫正视力 (BCVA) 在干燥年龄相关黄斑变性 (AMD).脉络自体移植后 A 组的变化 Limoli 视网膜修复技术 (LRRT), 并在对照组 (检查), 测量时间 0 (T0), 90 (T90), 180 (T180) 天。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: Microperimetry (我) 在 a 组的病人中.Limoli 视网膜修复术后六月干燥年龄相关黄斑变性 (AMD) (LRRT)。我从11.44 分贝 (T0) 增加到12.59 分贝 (T180) (升 9.58%)。从0到36在 dB 中的颜色刻度。固定稳定性: 稳定, 相对不稳定, 不稳定。请单击此处查看此图的较大版本.

纳入标准 排除标准
白种臣民 球面当量 > 6 D 的折射误差
营养良好的参与者 SD-OCT 和 FA 对渗出性 AMD 的征兆
诊断由 SD, OCT, 和 FA 眼部疾病: CT, GL,, MP, VM, CRD 等。
可测量 VA 眼部外伤
BCVA ≥1 logMAR 系统性疾病: MS;SDXdm;路;高清;脉管炎
正常眼压 高血压、癌症和其他系统性疾病
良好的存储 extrafoveal 区域
LogMAR: 最小分辨率角的对数;遥感: 光谱域光学相干层析成像;自体荧光成像;荧光素血管造影;视力: 视力;眼压: 眼压;D: 屈光度;CT: 白内障;GL: 青光眼;上: 视神经炎;黄斑褶皱;VM: 新生血管膜;CRD: 脉络膜视网膜病;多发性硬化症;帕金森病;DM: 糖尿病;路: 肾脏疾病;肝脏疾病。

表 1: 与干燥年龄相关的黄斑变性 (AMD) 患者的纳入和排除标准。

参数 LRRT (n = 11) 控制 (n = 14)
年龄 (平均) 71.5 ±3.8SD 80.4 ±2.3SD
年龄 (范围) 62-84 73-79
F:4 M:7 F:7 M:7
BCVA T0 0.581 logMAR 0.573 logMAR
平均)
BCVA T0 (范围) 0.301-1。0 0.0-1。0
BCVA T90 (平均) 0.504 logMAR 0.587 logMAR
BCVA T90 (范围) 0.222-1 0.0-1
BCVA T180 (平均) 0.376 logMAR 0.601 logMAR
BCVA T180 (范围) 0.046-0.699 0.0-1。0
百分比 35.19 4.72
更改
p 值 < 0.01 > 0。5
年龄;n = 病人和控制;SD = 标准偏差;F = 女性;M = 男性;BCVA = 最佳矫正视力在 logMAR;T0=baseline 术前移植;T90=90 后自体移植术后天数;T180=180 后自体移植术后的天数。

表 2: 研究中检查的患者的临床概况.在所有患者中, Limoli 视网膜修复技术 (LRRT) 在细胞移植后 (T0)、90 (T90) 和 180 (T180) 天内记录的平均值。

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Discussion

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本研究的主要目的是评估脂肪细胞、干细胞在 SVF 和 PRP 中的脉络移植是否能改善长期干性 AMD 影响眼中的 VA 和视网膜敏感度。另一项主要目的是根据最近的文献证明这些细胞可能的治疗效果, 因为一些临床前研究表明, 基于 GF 的治疗方法对于几种疾病的病人护理是有益的。

事实上, 一些研究表明, 自体人类诱导多潜能干细胞 (iPSC) 可以代表一个细胞源的移植, 目的是视网膜色素上皮 (RPE) 再生的组织置换治疗 AMD18, 19. 这些细胞表是生成的单层, 可以表达典型的视网膜色素标记和呈现极化 GF 分泌物, 显示吞噬能力, 以及基因表达模式类似于本地 RPE18,19.移植后, 自体非人类灵长类动物 iPSC-RPE 细胞表显示不免疫排斥和肿瘤形成18,19

本研究提出了一些不同的特点。我们直接分析了在干燥的 AMD 受影响的人眼中, 脉络移植细胞是否能改善视觉效果。

此外, 根据 LRRT sovrachoroidal 移植自体细胞一直被证明是安全的。在一年后的干预中, 我们从未注册过视网膜新生血管、黄斑水肿、视网膜脱离或其他视网膜问题。另一方面, 不适当的手术方法理论上可以导致脉络膜穿孔, 随后出血, 但在我们的研究中没有眼睛被破坏。然而, 可能有亚结膜出血, 通常吸收在几天内, 并没有再次出现作为并发症。

最近的研究提供了充分的证据表明, 暗视网膜电的价值, BCVA 和我, 在90和180天后自体移植的显著增加。但是, 如果由 SD OCT 记录的视网膜厚度平均 (RTA) 更高11,26, 则增加的幅度更大。经手术移植的细胞可以产生周围组织、脉络膜和视网膜的 GFs, 并具有神经营养和 angiotrophic 特性, 如碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)、血管内皮生长因子 (VEGF)、色素上皮衍生因子 (PEDF)、白细胞介素 (IL)、巨噬细胞集落刺激因子 (csf)、粒细胞-巨噬素集落刺激因子 (GM-csf) 和胎盘生长因子 (PlGF), 而血小板产生血小板源生长因子 (血小板来源), 血小板源性血管生成因子 (PDAF),6,7,12,13,21

在脉络膜附近的嫁接安置被认为允许被生产的 GFs 进入脉络膜流, 到达内皮细胞受体, RPEs, 穆勒细胞, 感光器, 最后与他们互动。在 LRRT, 自体嫁接的元素是有用的, 每个以自己的方式, 为再生。脂肪细胞产生 bFGF, 表皮生长因子 (EGF), 胰岛素样生长 factor-1 (IGF-1), IL, 转化生长因子β (TGF β), PEDF 和脂联素21。干细胞产生 bFGF, VEGF, 脑脊液, GM-脑脊液, PlGF, TGF β, 肝细胞生长因子 (HGF), IGF-1, IL 和染6,7。血小板产生血小板生成因子、IGF-1、TGF β、VEGF、bFGF、EGF、PDAF 和凝血酶敏感蛋白 (TSP)6, 12.

一些因素促进内皮细胞再生, 一些刺激 ADSC 增殖, 从而有利于自体脂肪和脂肪细胞的生存, 而其他抑制新生血管的进程22,23,24。PEDF 和 bFGF 有利于感光细胞的存活, 而 EGF 通过触发内源性 bFGF 转录和刺激干细胞来增强其分泌活性25,27, 对穆勒电池施加作用。虽然 GFs 通常是由 RPEs 分泌, 但这并不发生在萎缩黄斑由于视网膜色素/choriocapillaris 综合体。分泌 GF 分泌的移植细胞有助于偏爱感光和 choriocapillaris 生存28。此外, 脑脊液、GM 和 IL 对巨噬细胞有抗炎和趋化作用, 它涉及消除 intraretinal 细胞碎片, 这一功能是由 RPEs2930在生理学上进行的。

在脉络膜后接枝的细胞类型, 可以保证在脉络流中持续的 GF 分泌。GFs 可以从脉络膜到视网膜细胞, 与他们的细胞膜受体相互作用, 最后激活细胞内通路。提出的数据表明, LRRT 可以增加脉络膜灌注和感光 trophism 不仅通过 bFGF 受体相互作用, 但也通过刺激的米勒细胞, RPEs, 和视网膜感光器。因此, 基因表达的改变和最终的抗凋亡效应可以解释 neuroenhancement。这种细胞机制的基础上的能力, 以提高视觉性能, 如突出的临床发现, 在嫁接组。总之, LRRT 在长期维持干性 AMD 受影响患者的视觉功能方面是有益的。

然而, 正如我们在以往的研究中所表明的, 锥杆视网膜电和棒状视网膜的关系与 RTA 有非常显著的相关性, 而这不是锥视网膜电的情况。这可以解释为一个事实, 即凹功能似乎是妥协, 虽然黄斑卷在干 AMD 继续是经常性的, 至少在最初阶段26。在这种病理学中, 残留的视网膜 trophism 测量的可作为预后标准的 LRRT 治疗, 因为更好的结局是更频繁的患者的250µm26。可利用的 GF 集可能导致 neuroenhancement, 其程度与具有较大细胞构成的区域的存在成正比, 如电气活动26所记录的那样.在后期, 由于缺乏 GF-膜受体相互作用, 不良组织细胞构成不会给出术后寻求的治疗效果。

这项研究的下一步将需要通过统计评估所有必要的测试, 以证实该技术是有效的, 并研究生化效应, 以获得更大的 VA 和中央固定的更多的科目。可以争辩说, 细胞 trophism 的增加反映在细胞的视觉活动, 客观地测量由视网膜电、BCVA 和我的11。以 GF 为基础的治疗方法可为眼科疾病提供最新、选择性、安全、合理的治疗方案。

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Disclosures

提交于 ARVO 2015, 可 3-7-丹佛, 联合美国。

Acknowledgments

作者没有确认。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Blunt cannula, 3 mm.  Mentor, Santa Barbara, CA.
Luer-LokTM syringe.  BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ.
Regen-BCT tube.  RegenKit; RegenLab, Le Mont-sur-Lausanne, CH.
Centrifuge  RegenPRP Centri. RegenLab, Le Mont-sur-Lausanne, CH.
BD Venflon Pro Safety 22G x 1.00 inch (0.9 mm x 25 mm).  BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ.
SPSS Statistics Version 19.0 IBM Corp., Armonk, NY, USA.
Confocal scanning laser ophthalmoscope  Nidek Inc, Fremont, CA Nidek F10 
Cirrus 5000 Spectral Domain-Optical Coherence Tomography Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Germany  SD-OCT 
Maia 100809 Microperimetry  CenterVue S.p.A., Padua, Italy
Ocular electrophysiology electromedical system, C.S.O., S.r.l., Scandicci, Italy  Retimax for ERG 

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脉络细胞自体移植治疗老年性黄斑变性的再生疗法: 初步<em>体内</em>报告
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Limoli, P. G., Vingolo, E. M., Limoli, C., Scalinci, S. Z., Nebbioso, M. Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report. J. Vis. Exp. (132), e56469, doi:10.3791/56469 (2018).More

Limoli, P. G., Vingolo, E. M., Limoli, C., Scalinci, S. Z., Nebbioso, M. Regenerative Therapy by Suprachoroidal Cell Autograft in Dry Age-related Macular Degeneration: Preliminary In Vivo Report. J. Vis. Exp. (132), e56469, doi:10.3791/56469 (2018).

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