नेस्टेड पीसीआर एक संवेदनशील, विशिष्ट, और सरल तकनीक है कि डीएनए निष्कर्षों को टिक अरै burgdorferi, लाइम रोग के प्रेरणा का एजेंट के लिए जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है । प्रारंभिक पीसीआर प्रयोग जीन विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करता है के लिए लंबे amplicons है, जो फिर एक बाद प्रतिक्रिया के लिए टेंपलेट्स बन उत्पंन आंतरिक प्राइमरों का उपयोग ।
लाइम रोग एक गंभीर वेक्टर जनित संक्रमण है जो कि spirochetes के अरै burgdorferi कामुक लाटो परिवार के कारण होता है, जो संक्रमित Ixodes ticks के काटने के माध्यम से मनुष्यों को फैलता है । उत्तरी अमेरिका में प्राथमिक etiological एजेंट अरै burgdorferi कामुक stricto है । के रूप में भौगोलिक जोखिम क्षेत्रों का विस्तार, यह मजबूत निगरानी प्रोग्राम है कि टिक संक्रमण दर उपाय कर सकते है समर्थन विवेकपूर्ण है, और चिकित्सकों, पशु चिकित्सकों, और आम जनता के लिए निष्कर्षों संवाद । नेस्टेड पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (nPCR) की आणविक तकनीक लंबे समय से इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया गया है, और यह एक केंद्रीय, सस्ता, और मजबूत दृष्टिकोण अरै दोनों ticks और वंय जीवन में का पता लगाने में रहता है ।
यह लेख nPCR के आवेदन को दर्शाता है डीएनए निष्कर्षों को टिक करने के लिए संक्रमित नमूनों की पहचान । दो स्वतंत्र बी burgdorferi लक्ष्य, जीन एंकोडिंग Flagellin बी (FlaB) और बाहरी सतह प्रोटीन एक (OspA), इस तकनीक के साथ बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है । प्रोटोकॉल टिक संग्रह, डीएनए निष्कर्षण शामिल है, और फिर पीसीआर के एक प्रारंभिक दौर में प्रत्येक दो अरै-विशिष्ट loci का पता लगाने के लिए । बाद में पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) एक नए के रूप में पहली प्रतिक्रिया के उत्पाद का उपयोग करता है छोटे, आंतरिक प्रवर्धन टुकड़े उत्पंन खाके । नेस्टेड दृष्टिकोण दोनों विशिष्टता और पारंपरिक पीसीआर की संवेदनशीलता पर सुधार । एक टिक रोगज़नक़ के लिए सकारात्मक माना जाता है जब दोनों अरै जीन से भीतरी amplicons agarose जेल ट्रो द्वारा पता लगाया जा सकता है ।
लाइम रोग (एलडी) उत्तरी गोलार्द्ध में सबसे अधिक प्रचलित वेक्टर जनित संक्रमण है, और इसकी घटनाओं में1वृद्धि जारी है । यह दुर्बल बीमारी लाइम लाइम (पौंड) परिसर के spirocheteal रोगजनकों के कारण होता है (सामांयतः अरै burgdorferi कामुक लाटो, या s.l. के रूप में जाना जाता है), जो ऐतिहासिक रूप से प्रमुख उत्तर अमेरिकी रोगज़नक़, बी शामिल है burgdorferi कामुक stricto (एस. एस.), बी afzelii और बी garinii, जो यूरोप और एशिया भर में बड़े पैमाने पर कर रहे है के अलावा, और उभरते नैदानिक प्रासंगिकता2,3की प्रजातियों हैं । ये जीवाणु संक्रमित Ixodes ticks2के काटने के माध्यम से मनुष्यों को प्रेषित कर रहे हैं। हालांकि मुख्य उत्तर अमेरिकी वैक्टर scapularis और pacificusहैं, इस जीनस के भीतर कई प्रजातियों बंदरगाह के लिए पाया गया है और जीवाणु4संचारित । मनुष्यों में, बी burgdorferi त्वचा, जोड़ों, दिल, तंत्रिका तंत्र, अंत में ग्रंथि, जठरांत्र संबंधी मार्ग, और आंतरिक अंगों5,6,7को प्रभावित करने के लक्षण पैदा कर सकता है, 8,9,10. रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र वर्तमान में संयुक्त राज्य अमेरिका11,12में सालाना ३००,००० नए मानव मामलों पर अनुमान है । जबकि रोग का निदान अक्सर अनुकूल है जब बीमारी का पता चला है और प्रारंभिक अवस्था में इलाज किया है, अध्ययनों से सुझाव दिया है कि कहीं भी 10% और रोगियों की सिफारिश की एंटीबायोटिक आहार प्राप्त की ६०% के बीच चिकित्सा के बाद लक्षण अनुभव करने के लिए जारी प्रेक्टिस, एक घटना में पद उपचार लाइम रोग सिंड्रोम (PTLDS)13,14,15। इसके अलावा, नैदानिक हस्तक्षेप में देरी एक टिक काटने के बारे में जागरूकता की कमी का एक परिणाम के रूप में पैदा कर सकते हैं, प्रारंभिक बीमारी के गैर विशिष्ट प्रस्तुति, और संक्रमण की शुरुआत में इस्तेमाल किया जब पारंपरिक सीरोलॉजी-आधारित निदान की कम संवेदनशीलता. तेजी से इलाज के लिए विफलता और उचित लक्षण प्रगति है कि तेजी से दुर्बलता में प्रकट कर सकते हैं सक्षम बनाता है16,17जटिलताओं । लाइम रोग निवारण इसलिए जोखिम प्रबंधन की आधारशिला है । इस बढ़ते खतरे से निपटने के लिए रणनीतियों में टिकर में रोगजनक प्रसार को इंगित करने के लिए मजबूत निगरानी उपाय शामिल हैं, और चिंता के भौगोलिक क्षेत्रों की पहचान करें ।
यह आलेख नेस्टेड पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (nPCR) की उपयोगिता को एक आणविक स्क्रीनिंग टूल के रूप में प्रदर्शित करता है जिसके द्वारा संक्रमित टिकरों की पहचान की जाती है. विशिष्टता बढ़ाने के लिए, समानांतर प्रवर्धन के लिए दो अरै जीन का उपयोग किया जाता है । Flagellin बी (FlaB) encodes flagellum के एक प्रमुख रेशा प्रोटीन18, और जीन एकल रैखिक गुणसूत्र पर स्थित है, जबकि बाहरी सतह प्रोटीन एक (OspA) मध्यस्थता टिक midgut के लिपोप्रोटीन उत्पाद औपनिवेशीकरण, और है प्लाज्मिड-इनकोडिंग19,20। कार्यप्रवाह टिक संग्रह, डीएनए निष्कर्षण, और फिर अरै-विशिष्ट loci का पता लगाने के लिए पीसीआर के एक प्रारंभिक दौर के होते हैं । बाद में पीसीआर एक नए के रूप में पहली प्रतिक्रिया के उत्पाद का उपयोग करता है छोटे, आंतरिक प्रवर्धन टुकड़े उत्पंन खाके । एक टिक अरै burgdorferi के लिए सकारात्मक माना जाता है जब दोनों अरै जीन से भीतरी amplicons agarose जेल ट्रो द्वारा पता लगाया जा सकता है ।
दोनों nPCR तकनीक, और FlaB और OspA जीन लक्ष्य, व्यापक रूप से 1990 के दशक21के बाद से पारिस्थितिकी निगरानी और लाइम spirochete के नैदानिक जांच के लिए इस्तेमाल किया गया है,22,23 ,24,25. आणविक प्रोटोकॉल के विकास से पहले, ticks विरोधी को आंत सामग्री-अरै इम्यूनोफ्लोरेसेंस (यदि) धुंधला, माइक्रोबियल संस्कृति, या तत्संबंधी संयोजन26के अधीन द्वारा मूल्यांकन किया गया । इन तरीकों अंतर्निहित सीमाओं से ग्रस्त हैं, अरै27की धीमी वृद्धि और दुराराध्य प्रकृति सहित, एंटीबॉडी प्रदर्शन के मुद्दों, और यदि प्रसंस्करण21के लिए जीना ticks की आवश्यकता । बाद में संक्रमित वैक्टर की तीव्र, संवेदनशील और विशिष्ट पहचान प्रदान करने के लिए पीसीआर को अपनाया गया । यह पारंपरिक पद्धति, संस्कृति सहित विविध प्रकार के नमूने के लिए स्वतंत्र प्रत्यक्ष आवेदन, जैसे मृत और संग्रहीत ticks है कि अंयथा21,22 के परीक्षण के लिए अनुपयुक्त होगा के रूप में चिह्नित सुधार की पेशकश की . नेस्टेड प्रयोगात्मक डिजाइन आगे25,28प्रवर्धन के दो लगातार दौर में जीन विशिष्ट प्राइमरों के दो अलग सेट को रोजगार से विशिष्टता और शास्त्रीय पीसीआर की संवेदनशीलता पर सुधार ।
प्रायोगिक सफलता सामरिक जीन चयन और amplicon डिजाइन पर गंभीर रूप से निर्भर है । सही अरै burgdorferiकी उपस्थिति का अनुमान लगाने के लिए, प्राइमरों को भी अरै जीनस में spirochetes के साथ परस्पर प्रतिक्रिया के बिना प्रासंगिक रोगजनकों का पता लगाना चाहिए । FlaBके मामले में, इस विशिष्टता जीन के एक चर आंतरिक क्षेत्र को लक्षित करने के बजाय अपेक्षाकृत संरक्षित है कि विविध जीवाणुओं द्वारा साझा कर रहे है क्रम से हासिल की है (चित्रा 1)24,29 , 30.
चित्रा 1: nPCR की अवधारणा, के रूप में सचित्र प्रयोग अरै FlaB जीन एक लक्ष्य के रूप में । जीन के 5 ‘ और 3 ‘ टर्मिनी अरै burgdorferi s.l. से परे जीवों के लिए आम हैं, लाइम के विशिष्ट आकलन के लिए इन क्षेत्रों अनुपयुक्त प्रतिपादन रोगजनकों के कारण । प्राइमरी लक्ष्य के रूप में कम संरक्षित इंटीरियर दृश्यों का उपयोग करना, पीसीआर के दो राउंड एक अंतिम, आंतरिक amplicon का पता लगाने के लिए निष्पादित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
उनकी भेदभावपूर्ण क्षमता के परीक्षण में, इंटीरियर FlaB प्राइमरों से अधिक ८० अलग अरै पृथक के साथ मूल्यांकन किया गया है, और केवल लाइम रोग24के साथ जुड़े लोगों की पहचान करने के लिए पाया । nPCR के कम पता लगाने की सीमा के बीच में प्रलेखित किया गया है छह24 और दस शुद्ध संस्कृति से31 बैक्टीरिया, हालांकि संवेदनशीलता आगे दक्षिणी सोख्ता amplicon द्वारा सुधार किया जा सकता है, और hybridizing एक radiolabelled या chemiluminescent जांच की । युग्मन तकनीक एक एकल spirochete31के लिए खोज थ्रेशोल्ड कम कर देता है । प्रत्यक्ष तुलना, पारंपरिक, जांच एकल दौर पीसीआर द्वारा 104 spirochetes31की एक ंयूनतम की उपस्थिति की रिपोर्ट पाया गया । यह ध्यान दिया जाना चाहिए, तथापि, कि परख संवेदनशीलता कम हो जाएगा जब जटिल पर्यावरण और नैदानिक नमूनों के साथ काम, असंबंधित डीएनए और संभावित निरोधात्मक पदार्थों की भारी उपस्थिति के कारण । इन चुनौतियों को काफी हद तक nPCR के इस्तेमाल से दरकिनार किया जा सकता है.
पिछले दशकों में आणविक प्रौद्योगिकियों में अग्रिमों के बावजूद, nPCR आधुनिक निगरानी प्रयासों में एक प्रधान तकनीक बनी हुई है. यदि देखभाल डिजाइन और इस प्रोटोकॉल के निष्पादन में लिया जाता है, यह एक शक्तिशाली, अनुकूलनीय, और अपेक्षाकृत सीधा करने के लिए tick वैक्टर में रोगजनकों की उपस्थिति पर कब्जा दृष्टिकोण है ।
उपयोग के दशकों में, पीसीआर आधारित तकनीक लगातार सन्धिपाद और स्तनधारी नमूनों से अरै का पता लगाने में अपने मूल्य साबित कर दिया है, चाहे अरै पर्यावरण या नैदानिक मूल से आते हैं । पीसीआर निगरानी के लिए पूर्व मौजूदा दृष्टिकोण पर कई सुधार प्रदान करता है । विशेष रूप से, यह एंटीबॉडी रिएजेंट के विकास और प्रदर्शन पर निर्भर नहीं है, और इसके बजाय आसानी से केवल प्राइमरी दृश्यों को संशोधित करके ब्याज के नए लक्ष्य का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । पीसीआर भी या तो स्वतंत्र रूप से या एक मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया के माध्यम से समानांतर में कई loci के मूल्यांकन को समायोजित । यह विविध नमूना आदानों के लिए लागू किया जा सकता है, सहित ताजा और संग्रहीत ticks22, पशु या मानव शारीरिक तरल पदार्थ, और प्रतिच्छेदित ऊतक25. पीसीआर भी पैदावार amplicons कि आगे संसाधित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए प्रतिबंध एंजाइम पाचन, जांच संकरण, या अनुक्रमण द्वारा, माइक्रोबियल पहचान21में वृद्धि की अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं ।
एक नैदानिक उपकरण के रूप में, पीसीआर मानक सीरम निदान के लिए वैचारिक रूप से बेहतर है, के रूप में यह जीवाणु उपस्थिति का एक सीधा संकेत प्रदान करता है, बजाय संक्रमण के एक द्वितीयक उपाय के रूप में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर निर्भर है । हालांकि, लाइम लाइम एक अपेक्षाकृत मामूली माइक्रोबियल बोझ के साथ जुड़ा हुआ है (< 50 जीवों/एमएल या प्लाज्मा) और क्षणिक spirochetemia, जो झूठी नकारात्मक परिणाम को जन्म दे सकता है25। क्लिनिक में इस तकनीक की संवेदनशीलता ऊतक प्रकार, संक्रमण की अवस्था, और नमूना स्थिति के आधार पर काफी भिन्न होता है, १२.५% और रक्त के मौजूदा अध्ययनों में ६२% के बीच गिरने, मस्तिष्कमेरु द्रव, और biopsied ऊतक३६. आणविक संवेदनशीलता सीमाएं चिंता का विषय नहीं हैं, तो पीसीआर बैक्टीरियल संस्कृति के लिए बाद में किया जाता है, लेकिन नैदानिक नमूनों से व्यवहार्य spirochetes की वसूली इसी तरह चुनौतीपूर्ण साबित कर दिया है । हाल ही में प्रोटोकॉल उच्च यील्ड३५के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है । इस बीच, एक संक्रमित वयस्क टिक के आंत औसत पर कहीं भी २,००० से ५०,००० अरै३७,३८,३९, जो nPCR का पता लगाने की सीमा के भीतर ठोस है पर बंदरगाह कर सकते हैं । इस प्रकार, प्रोटोकॉल अच्छी तरह से निगरानी के प्रयासों को टिक करने के लिए अनुकूल है ।
इसके कई फायदे के बावजूद, nPCR कुछ चुनौतियों का सामना करता है, और इस तकनीक की क्षमता को सही ढंग से टिक संक्रमण रिपोर्ट इसलिए जीन और amplicons की रणनीतिक चयन पर निर्भर करता है, जटिल प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह कि गुणवत्ता डीएनए की वसूली नमूनों से, जबकि नमूने के पार जोखिम को कम करने, और उचित नियंत्रण है कि प्रयोगशाला वातावरण और रिएजेंट में दूषित पदार्थों की रिपोर्ट कर सकते हैं का उपयोग करें. किसी भी प्रयोग से पहले, गुंजाइश और जांच के इरादे स्पष्ट रूप से परिभाषित किया जाना चाहिए ताकि उचित आनुवंशिक loci, और क्षेत्रों में, चुना जा सकता है । यदि उद्देश्य लाइम के लिए एक निष्पक्ष स्क्रीन प्रदान करने के लिए है-कारण अरै burgdorferi s.l. जटिल, प्राइमरों समान संबध और प्रवर्धन दक्षता के साथ संबद्ध उपभेदों के सभी का पता लगाने के लिए बनाया जाना चाहिए, असंबंधित कब्जा के बिना जीवों को25. नई प्राइमर डिजाइन और इस तरह के प्राइमर के रूप में सॉफ्टवेयर उपकरणों का उपयोग silico में मूल्यांकन किया जा सकता है-विस्फोट४०, हालांकि वे भी प्रयोग मानक संदर्भ के खिलाफ अलग से मांय किया जाना चाहिए से पहले विलक्षण नमूनों पर लागू किया जा रहा है । डीएनए निष्कर्षण प्रक्रिया का लक्ष्य एक मिश्रित पर्यावरणीय नमूना (टिक homogenate) से बरकरार माइक्रोबियल टेम्पलेट को ठीक करने के लिए है । पीसीआर के साथ आगे बढ़ने से पहले एक वैकल्पिक कदम के लिए निकाली डीएनए की अखंडता का मूल्यांकन है । इसके अतिरिक्त, समानांतर प्रतिक्रियाओं की स्थापना के लिए टिक में एक गृह व्यवस्था जीन लक्ष्य हो सकता है । उत्तरार्द्ध विधि भी प्रतिक्रिया मिश्रण में अवरोधकों की उपस्थिति का संकेत कर सकते हैं, बढ़ा विश्वास है कि नकारात्मक अरै प्रतिक्रियाओं जीव के अभाव के कारण कर रहे हैं, और एक निरोधात्मक contaminant की उपस्थिति के लिए नहीं प्रदान करते हैं ।
नेस्टेड पीसीआर दृष्टिकोण की वृद्धि की संवेदनशीलता संभावित संदूषण है कि झूठी सकारात्मक परिणाम उत्पंन की कीमत पर आता है । Exogenous टेम्पलेट टिक विच्छेदन और डीएनए वसूली के दौरान एक नमूने के लिए पेश किया जा सकता है, या बाहरी और भीतरी प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं की स्थापना की प्रक्रिया में. इसलिए यह विशेष रूप से पीसीआर के लिए सबसे अच्छा अभ्यास प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए टेंपलेट या amplicon पार संदूषण से बचने के महत्वपूर्ण है । इन स्वतंत्र airflows, पीसीआर और जैविक सुरक्षा अलमारियां जहां उपयुक्त, पूरी तरह से रासायनिक और शारीरिक सफाई और सतहों और रिएजेंट की नसबंदी, और डीएनए के सतर्क हैंडलिंग में रोकथाम के साथ अलग काम स्टेशनों के उपयोग में शामिल हैं ४१. No-टेम्पलेट नियंत्रण भी स्टॉक रिएजेंट के संदूषण की पहचान करने में महत्वपूर्ण हैं । nPCR की एक विशेष भेद्यता amplicon हैंडलिंग है कि जब दूसरी पीसीआर पोत में पहली प्रतिक्रिया के उत्पादों को स्थानांतरित होता है । लक्ष्य डीएनए के बाद से पहले से ही सकारात्मक नमूनों में घातीय संवर्धन आया है, यह कदम विशेष रूप से पार करने के लिए प्रवण है संदूषण, और एक एकल ट्यूब nPCR प्रोटोकॉल इस सीमा को दरकिनार करने के लिए विकसित किया गया है । इस दृष्टिकोण में, एक दिया जीन के लिए प्राइमरों के दोनों सेट एक प्रतिक्रिया ट्यूब है कि पीसीआर31के दोनों राउंड के लिए सील रहता है के लिए एक साथ जोड़ रहे हैं । बाहरी और भीतरी प्राइमर जोड़े, इस तरह के एक उच्च एनीलिंग तापमान है कि भीतरी प्राइमरों के लिए निषेध है पर टेम्पलेट को प्रवर्धित कि इस प्रकार के विशेष रूप से अलग किया जाना चाहिए । दूसरे दौर में, एनीलिंग तापमान आंतरिक जोड़ी को समायोजित करने के लिए कम है । न केवल इस बाईपास एक संभावित कदम है, यह भी अतिरिक्त विरोधी के उपयोग की अनुमति-प्रदूषित उपाय31,४२। हालांकि, इस संशोधन कुछ परख संवेदनशीलता बलिदान कर सकते हैं । दृष्टिकोण के बावजूद, तकनीकी दोहराने की संख्या में वृद्धि स्वतंत्र रूप से एक नमूने पर प्रदर्शन नकली संदूषण की पहचान करने में मदद मिलेगी ।
आणविक तकनीक nPCR की शुरूआत के बाद से विकसित करने के लिए जारी रखा है, और इन नए दृष्टिकोण मूल डिजाइन पर चुनिंदा लाभ प्रदान करते हैं, हालांकि वृद्धि की वित्तीय खर्च पर । जैसा कि नाम से पता चलता है, मात्रात्मक पीसीआर (qPCR या रीयल टाइम (RT)-पीसीआर) एक नमूने में रोगजनकों के गणन के लिए अनुमति देता है, जबकि पारंपरिक तकनीक प्रकृति में गुणात्मक४३। qPCR की संवेदनशीलता कथित तौर पर nPCR३८की है कि इसी तरह की है, हालांकि यह28प्राइमर विशेषताओं के आधार पर उतार चढ़ाव कर सकते हैं । पारंपरिक TaqMan जांचों के स्थान पर आणविक बीकन (एमबी) का उपयोग करने qPCR की भिन्नता का पता लगाने में भी वादा दिखाया गया है अरै नैदानिक नमूनों में४४,४५,४६. उनके अद्वितीय माध्यमिक संरचना के कारण, आणविक बीकन कथित तौर पर कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और उच्च वैध संकेतों का उत्पादन, जिससे बेहतर संवेदनशीलता४७प्रदान । पूर्व नैदानिक मूल्यांकन एक और दस spirochetes४४,४५के बीच की एक संभावित पता लगाने की दहलीज सुझाव है । इसके अलावा, तकनीक सफलतापूर्वक मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं में लागू किया गया है एक साथ एक स्तनधारी मेजबान जीन४४ और अंय टिक-जनित रोगजनकों४५है, जो nPCR के साथ के रूप में आसानी से प्राप्त नहीं है का पता लगाने के लिए । अंय डिजाइन संशोधनों छोटी बूंद डिजिटल पीसीआर (ddPCR) प्रौद्योगिकी, जो एक मानक वक्र३९,४८के उपयोग के बिना डीएनए यों तो कर सकते है शामिल हैं । अरै के लिए इस तकनीक का कम पता लगाने की सीमा इसी तरह के आसपास है दस spirochetes/३९नमूना । nPCR की तुलना में, इन दृष्टिकोण भी संदूषण के लिए कम क्षमता का लाभ है, के रूप में वे केवल एक प्रवर्धन प्रोटोकॉल की आवश्यकता है ।
यदि निगरानी के उद्देश्य के बजाय एक टिक के विभिंन बैक्टीरियल सामग्री प्रोफ़ाइल करने के लिए है, 16S rRNA metagenomic स्क्रीनिंग एक आकर्षक विकल्प४९है । हालांकि इस दृष्टिकोण महंगा है, विशेष डीएनए सभी आणविक जीव प्रयोगशालाओं में नहीं पाया sequencers की आवश्यकता है, और आवश्यक अधिक परिष्कृत bioinformatics आधारित व्याख्या, यह अधिक सही करने के लिए रोगाणुओं की एक व्यापक स्पेक्ट्रम पर कब्जा कर सकते हैं वेक्टर के रोगज़नक़ लोड का प्रतिनिधित्व करते हैं ।
जबकि qPCR और उसके डेरिवेटिव मात्रात्मक अनुप्रयोगों के लिए पसंद के तरीके हैं, और metagenomics स्क्रीन टिक microbiome की व्यापक सूची प्रदान करते हैं, लक्षित निगरानी प्रयासों अक्सर उपस्थिति या की अनुपस्थिति के बाइनरी रिपोर्टिंग के साथ संबंध हैं एक या एक सदिश में कुछ रोगजनकों । ऐसी परिस्थितियों में, इन नए, और अधिक विस्तृत दृष्टिकोण प्रक्रिया में अनावश्यक जटिलता और वित्तीय बोझ को लागू कर सकते हैं । इन कारणों के लिए, nPCR समय की कसौटी पर टिक परीक्षण में एक निर्णायक तकनीक के रूप में झेल है ।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों को प्राइमर डिजाइन, एशले McKibbon और जेसिका थॉमस के लिए कमि हैरिस-Ebbett फिल्माने के लिए शुक्रिया अदा करना चाहते हैं, और जॉन ब्लेक, एलेक्जेंड्रा Foley-Eby, क्रिस लैंगली, जूली लुईस, Kelsey McIntyre, एशले McKibbon, क्रिस Zinck, और रोजी में दिखने के लिए कुत्ता वीडियो. ए. एम. के. ने कनाडाई लाइम रोग अनुसंधान फाउंडेशन का समर्थन किया था, और परियोजना के वित्तपोषण को प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद कनाडा (NSERC) द्वारा प्रदान किया गया था । एम. के. बी. डब्ल्यू. ने न्यू ब्राउनश्विक इनोवेशन फाउंडेशन (NBIF) से वेतन अनुदान प्राप्त किया.
LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet | Nuaire | ES AIR NU-543 | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | 0.22 mm thickness |
Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL) | Axygen | 311-08-051 | |
AquaGenomic | MultiTarget Pharmaceuticals | 2030 | DNA extraction reagent |
Microtube Pestle | Diamed | DIATEC610-1551 | Designed for 1.5 ml tubes |
Water bath – Isotemp 202 | Fishse Scientific | 15-462-2 | |
Vortex | Labnet | S0100 CAN | |
Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge | Labnet | C2400 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B9754 | |
Primer Synthesis | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
PCR Cabinet | Misonix | PCR6-482 | |
PCR tube with attached flat caps 0.2mL | VWR | 20170-012 | |
GoTaq Green Master Mix 2x | Promega | M7123 | |
Nuclease-free water | Promega | M7123 | The water comes with the GTG |
Spectrafuge Mini | Labnet | C1301 | |
SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration | EDVOTEK | 608 | |
Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose) | FroggaBio | A87-500G | |
GD 100 bp DNA Ladder | FroggaBio | DM001-R500 | |
Electrophoresis power pack | VWR | VWR 105 | EC Apparatus Corporation |
Fluor-S MultiImager | BioRad | 170-7700 (Serial number 433B0154) | |
Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2) | BioRad | 1709600 |