Summary
중첩 된 PCR 틱 보렐 리아 burgdorferi, Lyme 질병의 원인이 되는 에이전트에 대 한 조사를 DNA 추출에 적용 될 수 있는 민감한, 특정, 그리고 간단한 기술입니다. 초기 PCR 실험 유전자 특정 뇌관을 사용 하 여 내부 뇌관을 사용 하 여 후속 반응에 대 한 템플릿 되 긴 amplicons 생성.
Abstract
Lyme 질병 나 선상 세균 감염된 Ixodes 의 진드기에 물린 상처를 통해 인 간에 게 전송의 보렐 리아 burgdorferi sensu lato 가족에 의해 발생 한 심각한 벡터 품 어진 감염 이다. 북미 지역에서 1 차 etiological 대리인 보렐 리아 burgdorferi sensu stricto 이다. 지리적 위험 지역 확장, 그것은 진드기 감염 속도 측정 임상, 수 의사, 그리고 일반 대 중에 결과 전달할 수 있는 강력한 감시 프로그램을 지 원하는 것이 좋습니다. 중첩 된 중 합 효소 연쇄 반응 (nPCR)의 분자 기술을 오래이 목적을 위해 사용 되었습니다 그리고 그것 진드기와 야생 동물에 보렐 리아 의 검출에 중앙, 저렴 한, 그리고 강력한 접근 남아 있다.
이 문서에서는 감염된 표본 식별을 DNA 추출 틱 nPCR의 응용 프로그램을 보여 줍니다. 두 개의 독립적인 B. burgdorferi 대상, 유전자 인코딩 Flagellin B (군살) 및 외부 표면 단백질 A (OspA), 이 기법으로 광범위 하 게 사용 되어 왔습니다. 프로토콜 관련 틱 컬렉션, DNA 추출, 그리고 두 Borrelia의 각을 검출 하는 PCR의 초기 라운드-특정 loci. 이후 연쇄 반응 (PCR) 작고, 내부 증폭 조각을 생성 하 새 템플릿으로 첫 번째 반응의 제품을 사용 합니다. 중첩 된 접근 특이성 및 기존의 PCR의 민감도 향상 시킵니다. 틱 때 두 보렐 리아 유전자에서 내부 amplicons agarose 젤 전기 이동 법에 의해 검출 될 수 있다 병원 체에 대 한 긍정적으로 간주 됩니다.
Introduction
Lyme 질병 (LD), 북반구에서 가장 널리 퍼진 벡터 품 어진 감염 이며 그 발생률1증가 하 고. 이 쇠 약 질병은 라임 borreliosis (파운드) 복잡 한 (흔히 보렐 리아 burgdorferi sensu lato, 또는 s.l.), 역사적으로 지배적인 북미 병원 체, B. 구성의 spirocheteal 병원 균에 의해 발생 burgdorferi sensu stricto (s.s), B. afzelii 및 B. garinii, 유럽 및 아시아에 걸쳐 널리 고 신흥 임상 관련성2,3종의. 이 박테리아는 감염된 Ixodes 틱2. 의 바이트를 통해 인 간에 게 전달 주요 북미 벡터는 I. scapularis 그리고 I. pacificus, 항구 박테리아4전송 하이 속 내의 여러 종 발견 되었습니다. 인간에서는, B. burgdorferi 피부, 관절, 심장, 신 경계, 내 분 비 땀 샘, 위장, 그리고 내부 장기5,6,7에 영향을 미치는 multisystem 증상을 일으킬 수 있습니다. 8,,910. 질병 통제 및 예방 센터는 현재 미국11,12에서 매년 30만 이상의 새로운 인간의 경우를 견적 한다. 연구와 치료 후 증상이 계속 권장된 항생제 처방을 받은 환자의 60% 10% 사이 아무 데도 그 때 질병 진단 및 초기 단계에서 치료 예 후를 유리한 자주 동안 제안 정지, 현상에서 게시물 치료 Lyme 질병 증후군 (PTLDS)13,,1415되 나. 또한, 임상 개입에 지연 진드기 바이트의 인식, 초기 질병의 일반적인 프레 젠 테이 션 및 감염의 발병에서 사용 될 때 전통적인 혈 청 학 기반 진단의 낮은 감도의 부족으로 인해 발생할 수 있습니다. 신속 하 고 적절 하 게 치료 하지 않으면 합병증16,17를 점점 더 쇠 약에서 증명할 수 있는 증상 진행을 수 있습니다. Lyme 질병 예방은 따라서 리스크 관리의 초석입니다. 이 성장 위협에 대처 하기 위해 전략 틱, 병원 체 보급을 나타내는 강력한 감시 조치를 포함 하 고 관심사의 지리적 영역을 식별.
이 문서에서는 감염 된 진드기를 식별 하는 분자 검사 도구로 중첩된 연쇄 반응 (nPCR)의 유틸리티를 보여줍니다. 특이성을 높이기 위해 두 보렐 리아 유전자 병렬 증폭에 사용 됩니다. Flagellin B (군살) 편18의 주요 필 라 멘 트 단백질 인코딩하고 외부 표면 단백질 A (OspA)의 단백 제품 틱 midgut 중재 동안 단일 선형 염색체에 있는 유전자 식민, 플라스 미드로 인코딩된19,20. 워크플로 구성 틱 컬렉션, DNA 추출, 그리고 보렐 리아를 검출 하는 PCR의 초기 라운드-특정 loci. 이후 PCR 작고, 내부 증폭 조각을 생성 하 새 템플릿으로 첫 번째 반응의 제품을 사용 합니다. 진드기는으로 간주 긍정적인 보렐 리아 burgdorferi 때 두 보렐 리아 유전자에서 내부 amplicons agarose 젤 전기 이동 법에 의해 검출 될 수 있다.
NPCR 기술 그리고 FlaB 및 OspA 유전자 대상, 널리 사용 된 생태 감시 및 초기 1990 년대21,,2223 이후 라임 spirochete의 임상 탐지 ,2425. 분자 프로토콜 개발, 이전 틱 subjecting 본질적인 내용을 안티-보렐 리아 면역 형광 검사 (면) 얼룩, 미생물 문화, 또는 조합을26평가 됐다. 이러한 접근 한계, 느린 성장 및 보렐 리아27, 항 체 성능 문제 및 IF 처리21라이브 틱의 요구의 까다로운 성격 등에서 고통. PCR 감염된 벡터의 빠른, 민감한, 그리고 특정 식별 제공 하기 위해 연속적으로 채택 되었다. 그것은 그렇지 않으면 될 하지 테스트21,22 적합 죽은 및 보관 된 틱 등 다양 한 견본 유형에 문화권 직접 응용 프로그램을 포함 한 전통적인 방법론 표시 된 개선 제안 . 중첩 된 실험적인 디자인 더 증폭25,28의 두 연속 라운드에서 유전자 특정 뇌관의 두 가지 세트를 채용 하 여 고전 PCR의 민감도와 특이성 향상.
실험 성공 비판적 amplicon 디자인과 전략적 유전자 선택에 따라 달라 집니다. 보렐 리아 burgdorferi의 존재를 정확 하 게 예측 하려면 뇌관 보렐 리아 속에 또한 회귀 열 나 선상 세균을 cross-reacting 없이 관련 병원 체를 탐지 해야 합니다. 군살, 경우이 특이성 유전자, 보다는 오히려 공유 하는 다양 한 박테리아 (그림 1)24,29 에 의해 상대적으로 보존된 측면에 서 시퀀스의 변수 내부 영역을 대상으로 이루어집니다. , 30.
그림 1: nPCR, 같이 사용 하 여의 개념 보렐 리아 FlaB 유전자를 대상으로. 유전자의 5'과 3' 테르미니가이 지역 라임을 일으키는 병원 체의 특정 평가 대 한 부적 절 한 렌더링 보렐 리아 burgdorferi s.l. 넘어 생물에 공통 됩니다. 덜 보존 인테리어 시퀀스를 사용 하 여 뇌관 대상으로, PCR의 2 라운드 최종, 내부 amplicon 검색 실행 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그들의 차별 능력의 시험에서 인테리어 FlaB 뇌관 80 개 이상의 다른 Borrelia 격리와 평가 되었고만 그 라임 병24와 관련 된 식별을 발견. NPCR의 낮은 검출 한계 문서화 되었습니다에서 624 사이의 순수한 문화에서 1031 박테리아 비록 감도 amplicon blotting 남쪽과 radiolabelled 교배 시키기에 의해 더욱 향상 시킬 수 있습니다 또는 chemiluminescent 프로브입니다. 커플링 기술 단일 spirochete31검출 임계값을 줄일 수 있습니다. 직접 비교 하 여 기존의 unprobed 단일 라운드 PCR 104 나 선상 세균31의 최소의 존재를 보고 발견 됐다. 그러나 그것은,, 복잡 한 환경 및 임상 샘플 없는 DNA 및 잠재적인 억제 물질의 압도적인 존재 때문에 작업할 때 분석 결과 감도 낮은 것 이다 주목 해야한다. 이러한 과제는 크게 nPCR의 사용에 의해 피할 수 있습니다.
지난 수십 년간에서 분자 기술 발전에 불구 하 고 nPCR 현대 감시 노력에 주식 기법을 남아 있습니다. 주의 디자인 및 실행이이 프로토콜의 경우 틱 벡터에 병원 체의 존재를 캡처, 적응력, 강력 하 고 비교적 간단 접근 이다.
Protocol
1. DNA 별개로 틱
- 필드 컬렉션, 또는 수 의사와 공중의 구성원에서 수동 감시를 통해 진드기를 취득 합니다. 틱 해야 동결에 의해 살해, 봉인된 된 봉투에 배치 되며 실 온에서 발송.
- 제출 양식을 사용 하 여, 날짜와 만남, 틱 부착 상태, 호스트 종, 및 호스트의 최근 여행 역사의 지리적 위치에 대 한 정보를 수집 합니다.
- 중첩된 한 PCR 본질적으로 오염에 취약 한 이기 때문에, 실험실 작업 샘플의 크로스-노출을 최소화 하기 위해 설정 되어 확인 합니다. 이 프로토콜의 다른 요소를 철저 하 게 청소 하 고 소독, 서로 잘 분리 별도, 전용 공간에서 실행을 포함 하 고 모든 계측을 보장 하는 것은 오염 물질의 무료.
- 시료를 받으면 진드기 사진 하 고 식별 키32 종, 발달 단계, 섹스, 그리고 engorgement 상태를 비교 하 여 결정 합니다.
- 무 균 조건 하에서 무 균 면도날 또는 메스를 사용 하 여 눈금을 이등분 고 두 틱 조각 별도 microcentrifuge 관 합니다.
- 총 DNA 추출, PCR 호환 서식 파일;을 생성 하 어떤 격리 절차 사용 하 여 이 프로토콜에서는 간단한 chelation 기반 접근 방식을 보여 줍니다.
- 진드기 파편 용균성 킬레이트 시 약의 (수시로 50-200 µ L) 사이의 적절 한 볼륨을 추가 하 여 시작 합니다. 구체적인 금액 표본 크기와 engorgement 상태;에 따라 달라 집니다. 지침 서는 제조 업체에 의해 제공 되어야 한다. 균질 microtube 방 앗 공이 사용 하 여.
- 짧게 45 분, 그리고 소용돌이 60 ° C에서 물 욕조에 샘플을 품 어.
- 데스크톱 microcentrifuge에서 16,276 x g (13300 rpm)에서 4 분에 대 한 샘플을 원심.
- 50 µ L 소 프로 파 놀, 반전, 그리고 다시 (1.2.3)에서 원심에 의해 혼합을 포함 하는 신선한, 레이블이 microtube 상쾌한 전송.
- 상쾌한, 가만히 따르다와 DNA 펠 릿의 70% 에탄올 50 µ L와 린스.
- 초과 에탄올을 피 펫을 제거 하 고 실 온에서 15 분 동안 건조를 펠 릿을 허용.
- Resuspend DNA, 1 mM Tris pH 7.0의 50 µ L을 추가 하 고 60 ° c.에 1 시간을 위한 물 욕조에 샘플을 품 어 DNA는 이제 미래 분자 분석-20 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 중첩 된 PCR Borrelia OspA FlaB의 탐지.
참고: 일반적인 PCR 원칙 및 관행에 대 한 개요는 로렌스, 201233에 의해 제공 됩니다.
- 합성 또는 보렐 리아 유전자 특정 외부 및 내부 oligonucleotide 뇌관을 얻을. 뇌관 세트, 그들의 각각 amplicon 크기, 및 녹는 온도 대 한 표 1 을 참조 하십시오.
| 뇌관 이름 | 진 대상 | 시퀀스 (5'-3') | Amplicon 크기 | 어 닐 링 온도 | |
| Fw 아웃 flaB | 군살 | gcatcactttcagggtctca | 503 혈압 | 55 ° C | |
| Rv가 밖으로 군살 | 군살 | tggggaacttgattagcctg | |||
| Fw에 flaB | 군살 | ctttaagagttcatgttggag | 447 혈압 | 58 ° C | |
| Rv에 flaB | 군살 | tcattgccattgcagattgt | |||
| OspA 아웃 Fw | OspA | cttgaagttttcaaagaagat | 487 혈압 | 55 ° C | |
| OspA 아웃 Rv | OspA | caactgctgacccctctaat | |||
| Fw에 OspA | OspA | acaagagcagacggaaccag | 350 혈압 | 58 ° C | |
| OspA Rv | OspA | ttggtgccatttgagtcgta | |||
표 1: 내부 및 외부 뇌관 Borrelia burgdorferiFlaB 및 OspA nPCR에 대 한.
실제로, FlaB 뇌관 B. burgdorferi s.s. 등 밀접 한 보렐 리아 genospecies OspA 뇌관만 B. burgdorferi s.s. 캡처 동안 감지 두 loci에서 증폭 B. 나타냅니다 burgdorferi. s.s.
- 미리 소독 UV 빛과 70% 에탄올과 PCR 캐비닛.
참고: 잠재적인 샘플 오염을 최소화 하려면이 작업 한다 틱 해 부, DNA 추출의 위치에서 되며 젤 전기 이동 법.- 초기 PCR 실행에 대 한 외부 뇌관을 사용 하 여 DNA 1.0, 위의 단계에서 복구 하 고 반응 혼합물 표 2에 설명 된 대로 템플릿와 함께. 동시에 긍정적인 제어 실행 확인된 보렐 리아 DNA의 구성 하 고 부정적인 제어 없음 템플릿 반응 시 약 및에 어로 졸 오염 감지를 포함 하 여 실행을 수행 합니다. 시 약의 잠재적인 오염을 최소화 하기 위해 끝에 DNA를 추가 합니다. 각 튜브 시 약의 추가 되지 및 DNA 추가 후 즉시 및 다른 튜브 열 전에 튜브를 닫을 때 항상 모든 닫힌 확인 하십시오.
- 다음과 같이 열 cycler 프로그램: 95 ° C 5 분; 15 95 ° C의 40 주기 어 닐 링 온도 30 s s, 45 72 ° C s; 72 ° C 5 분; 4 ° c.에서 개최
- 2 µ L의 첫 번째 PCR 제품 (2.2.2에서 생산)와 내부 뇌관을 사용 하 여 제외 하 고 첫 번째 반응에 유사한 PCR의 두번째 라운드를 수행 합니다.
참고: 반응 볼륨 다시 표 2에 제공 됩니다. 서식 파일 DNA 마지막 추가 되 고 한 번에 하나의 샘플에 해당 하는 관은 오픈 함으로써 amplicons의 교차 오염을 방지 하려면 주의 해야 합니다.
표 2: 첫 번째 및 두 번째 확대에 대 한 PCR 반응 혼합물.구성 요소 PCR # 1 볼륨 PCR # 2 볼륨 Taq 중 합 효소 마스터 믹스 2 X 12.5 Μ L 12.5 Μ L Nuclease 무료 물 8.5 Μ L 8.5 Μ L 10 µ M 앞으로 반전 뇌관 1.0 µ L 외부 뇌관 1.0 µ L 내부 뇌관 DNA 템플렛 샘플 추출 (1.2.7)에서 2.0 µ L PCR (2.2.2)의 1 라운드에서 2.0 µ L
- 이전, 열 cycler 프로그램 하지만 내부 뇌관 (표 1 참조)에 맞게 어 닐 링 온도 조정.
3. Agarose 젤 전기 이동 법 및 이미징
참고: 기본 DNA 전기 이동 법으로 분리, 참조 리 외. 2012,34.
- 20 X SB 버퍼 (0.2 M NaOH, 0.8 M 붕 소의 산 성 pH 8), 1 X, 희석을 사용 하 여 1.2 %agarose 젤 준비 하 고 바란다면 미리 젤의 얼룩은 따르고, 전에 DNA 얼룩의 약 5 µ L를 추가 합니다.
- 10 µ L의 각 실험에서 두 번째 (내부) PCR 반응에서 제품 및 제어 샘플 100 bp 사다리 (5 µ L)와 함께 로드 합니다.
- 107에서 1 h electrophorese V (5V/cm).
- 보기 및 문서는 transilluminator와 연결 된 카메라와 소프트웨어를 사용 하 여 젤.
Representative Results
nPCR 복잡 한 환경 샘플 조사를 받고 있을 때 특히 특이성 및 병원 체 검출의 감도 증가 하는 우아한 접근 이다. 그림 1에서 같이, 보렐 리아 FlaB 로커 스 (및 OspA, 사진 안)의 전략적 영역을 대상으로 하는 PCR의 2 라운드 짧은 내부의 세대를 통해 보렐 리아 burgdorferi 박테리아의 존재를 보고할 수 있습니다. amplicons입니다. 젤 전기 이동 법으로 해결 하는 경우 각 틱에서 FlaB 와 OspA 반응 제품 시각적으로 득점 고 컨트롤에 대 한 비교. 그림 2를 독특한 견본 식별자 각 젤 상단의 제공 되며 노 템플릿과 졸 컨트롤 표시 됩니다 맨 왼쪽 및 오른쪽, 각각, 사다리에 인접 한.
강력한 amplicon 밴드 선택 실험 샘플에서 명확 하 게 볼 수 있습니다 그리고 그들은 쉽게 과잉 뇌관 및 잔여 DNA (그림 2)에서 고유. 명시 된 실험 설계 원칙에 따라, 진드기가 여겨진다 긍정적인 보렐 리아 때 부정적인 컨트롤 설명 없음 증폭, 및 내부 amplicons FlaB 와 OspA 뇌관에서 생산 됩니다에 병렬에 대 한. 이 경우에, T907, T604, 및 T606 표본 라임 병원 체 (그림 2)에 대 한 감시 기준을 만났다. By contrast, T923 OspA, 결과는 여러 가지 이유가 있다에 대 한 긍정적인만 했다: A) 원래 틱 보렐 리아에 대 한 부정적인 했지만 외부 또는 내부 OspA PCR 준비 가짜로 오염 된 서식 파일 DNA (참고 시 약의 전신 오염 부정적인 컨트롤을 통해 밖으로 지배 되었다), B) 진드기 수행 라임 보렐 리아, 하지만 낮은 템플릿 금액 또는 실험 오류 방지 FlaB또는 C의 증폭) 유기 체는 그 보존된 OspA 시퀀스를 포함 하지만 Flagellin 부족 또는 뇌관을 anneal 하 FlaB 의 대상된 지역에서 부족 정체성을 했다. 실제로, OspA 시퀀스 유사 생물, 식물 및 동물28등의 다양 한 지적 되었습니다. 대화 상황, 더 증폭 Flagellin 유전자, 하지만 하지 OspA 유전자 보존, 관련된 보렐 리아 종족을 나타낼 수 있습니다. 실제로,이 프로토콜 FlaB 뇌관, 시나리오 'A'가 가장 가능성이 설명 제안 하는 것 보다 더 많은 OspA 단일 긍정적인 결과 생성 합니다. 그러나 논쟁 적인 견본의 추가 실험 분석, 없이, 아니다 단일 긍정적인 결과의 소스를 확인할 수 없습니다. 가짜로 이전 반응에 도입 된 어떤 오염 물질 보관 된 DNA에 존재 하지 않을 것 이다 이후 그들의 진정한 상태를 조정 하 모호 샘플에 수행 하는 기술 복제의 수를 증가 도움이 됩니다. 그러나, 이러한 뇌관으로 후속 반응 결정적인 결과 제공 하지, 다른 Borrelia loci PCR에 의해 조사 될 수 있습니다. 이 반응에서 생성 된 Amplicons 또한 시퀀싱 하 고 격리 id를 할당 하 고 스트레인 분기의 정도 추정 하 중 비교 수 있습니다. Sapi와 동료 인간의 임상 샘플35를 사용 하 여이 워크플로의 예를 제공 합니다.
모든 요인을 고려, 개요 프로토콜 및 해석 조건을 각각 0.0063%와 0.17%의 거짓 긍정과 거짓 부정적인 요금을 생성 견적 되었다.
그림 2 :의 보렐 리아 burgdorferi nPCR의 의해 개별 틱 군살 그리고 OspA. 각 눈금에 할당 된 코드는 젤의 위쪽에 표시 되 고 정체성 각 표본에서 OspA FlaB 의 탐지를 보고 맞춤. 레인 (오른쪽 차선)는 실험실 환경 오염을 잡으려고 졸 컨트롤 이미지 대표 노-템플릿 컨트롤의 왼쪽에서 B를 받을 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
사용의 년간 PCR 기반 기술을 일관 되 게 입증 Borrelia 의 검출에 그들의 가치 arthropod와 포유류 표본에서 보렐 리아 환경 또는 임상에서 온 여부. PCR 감시를 기존의 방법 많은 개선을 제공합니다. 특히, 그것은 개발 및 항 체 시 약의 성능에 의존 하 고 대신 적용할 수 있습니다 쉽게 단순히 뇌관 시퀀스를 수정 하 여 관심의 새로운 목표를 검출 하기. 독립적으로 또는 다중 반응을 통해 PCR는 또한 동시에 여러 개의 loci의 평가 수용 한다. 그것은 신선 하 고 보관 된 틱22, 동물 또는 인간의 체액 및 절제 조직25를 포함 하 여 다양 한 표본 입력에 적용할 수 있습니다. PCR amplicons 처리할 수 있는 추가, 예를 들면 금지 효소 소화, 프로브 교 잡, 또는 시퀀싱, 미생물 정체성21에 증가 된 통찰력을 제공 하 여 생성 됩니다.
임상 도구로 PCR 바람직합니다 개념적으로 표준 혈 청 학적인 진단에 감염의 보조 수단으로 호스트 면역 반응에 의존 하는 것 보다는 세균 존재의 직접적인 표시를 제공 합니다. 그러나, 라임 borreliosis 상대적으로 겸손 한 미생물 부담으로 연결 됩니다 (< 소변 또는 플라즈마의 50 생물/mL) 및 false 네거티브를 야기할 수 있는 일시적인 spirochetemia 결과25. 병원에서이 기법의 감도 조직 유형, 감염, 및 샘플 상태의 단계 12.5%와 혈액, 중추 신 경계, 그리고 biopsied 조직36의 기존 연구에서 62% 사이 떨어지는 상당히 다릅니다. 그러나 분자 감도 제한 되지 않습니다 우려 PCR은 세균성 문화, 이후 착수 하는 경우 복구 가능한 나 선상 세균의 임상 표본에서 마찬가지로 어려운 입증 했다. 최근에 프로토콜 높은 수익률35에 대 한 최적화 되었습니다. 한편, 감염된 된 성인 진드기의 용기 수 항구 평균 어디 2000에서 50000 이상의 보렐 리아37,38,39, 단단하게 nPCR의 감지 범위 내에서입니다. 따라서, 프로토콜은 틱 감시 활동에 적합 합니다.
그 많은 장점에도 불구 하 고 특정 도전과 정확 하 게 보고 진드기 감염 따라서 유전자 그리고 amplicons, 품질 DNA를 복구 하는 세심 한 실험 워크플로의 전략적 선택에 따라이 기술 수 nPCR 포즈지 않습니다. 크로스-노출의 샘플, 그리고 실험실 환경 및 시 약에서 오염 물질을 보고할 수 있는 적절 한 컨트롤의 사용을 최소화 하면서의 표본에서 어떤 실험에 앞서 범위와 조사 의도 정의 되어야 한다 명확 하 게 되도록 적절 한 유전 loci과 지역, 선택할 수 있습니다. 목적은 라임을 일으키는 보렐 리아 burgdorferi s.l. 복잡 한에 대 한 편견된 화면을 제공 하는, 모두 비슷한 선호도와 관련 된 긴장을 검출 하기 위하여 뇌관을 생성 해야 하 고 증폭 효율, 캡처 없이 무관 유기 체25. 새로운 뇌관 디자인 될 수 있다 고 평가 철에 비록 그들은 또한 유효성을 검사 해야 실험적으로 표준 참조에 대 한 뇌관 폭발40, 같은 소프트웨어 도구를 사용 하 여 새롭거나 샘플에 적용 되 고 전에 격리. DNA 추출 절차의 목표 혼합된 환경 샘플 (틱 homogenate)에서 그대로 미생물 서식 파일을 복구 하는 것입니다. PCR 진행 하기 전에 단계는 선택적 추출 된 DNA의 무결성을 평가 하는 것입니다. 또한, 병렬 반응 수 설정할 수 틱에 하우스키핑 유전자를 대상으로. 두 번째 방법은 반응 혼합물, 제공 하 고 증가 자신감을 부정적인 보렐 리아 반응 유기 체, 그리고 하지 억제 오염 물질의 존재 때문에 억제제의 존재를 나타낼 수도 있습니다.
중첩 된 PCR 방법의 감도 증가 거짓 양성 결과 생성 하는 잠재적인 오염 비용으로 온다. 틱 해 부 및 DNA 복구 동안 또는 외부 및 내부 증폭 반응을 설정 하는 과정 외 인 템플릿 샘플 소개 수 있습니다. 그것은 따라서 템플릿이나 amplicon 피하기 위해 PCR 위한 최상의 연습 프로토콜에 따라 특히 중요 한 교차 오염. 이 PCR 및 생물 안전 캐비닛에 독립적인 기류, 봉쇄와 별도 워크 스테이션의 사용을 포함 적절 한, 철저 한 화학 및 물리적 청소와 표면 및 시 약, 살 균 및 DNA 의 신중한 처리 41. 아니-템플릿 컨트롤은 또한 재고 시 약의 오염 식별에 중요 한. NPCR의 특정 취약점을 처리 하는 amplicon 발생 두 번째 PCR 선박에 첫 번째 반응의 제품을 전송 하는 경우입니다. 이후 대상 DNA 이미 긍정적인 샘플 지 수 농축 겪은,이 단계는 교차 오염을, 특히 경향이 그리고 단일 튜브 nPCR 프로토콜이이 한계를 우회 하도록 개발 되었습니다. 이 방법에서는, 주어진된 유전자를 위한 뇌관의 두 세트는 PCR31의 두 라운드 봉인 남아 있는 반응 관에 함께 추가 됩니다. 외부 및 내부 뇌관 쌍 외부 몇 증폭 템플릿의 내부 프라이 머에 대 한 금지는 높은 어 닐 링 온도에서 그런 열역학으로 고유 해야 합니다. 두 번째 라운드에서 어 닐 링 온도 내부 쌍에 맞게 낮 췄 다. 뿐만 아니라이 잠재적으로 혼란 단계를 무시, 그것은 또한 추가의 사용 방지 오염 측정31,42. 그러나,이 수정 일부 시험 감도 희생 수 있습니다. 접근 방식에는 샘플에 독립적으로 수행 하는 기술 복제의 수를 증가 가짜 감염을 식별 하 데 도움이 됩니다.
분자 기술, nPCR의 도입 이후 진화를 계속 하 고 이러한 새로운 접근 선택 이점이 원래 디자인을 제공 하는 금융 비용 증가에 불구 하 고. 마찬가지로 이름이 있듯이, 정량 PCR (정량 또는 진짜 시간 (RT)-PCR) 기존의 기법 자연43질적 동안 샘플, 병원 체의 열거에 대 한 수 있습니다. 정량의 감도가 비슷합니다 보도 nPCR38의 뇌관 특성28에 따라 변동 될 수 있지만. 기존의 TaqMan 프로브 대신 분자 비콘 (MB)를 사용 하 여 정량의 변화는 또한 임상 표본44,,4546에 보렐 리아 의 검출에 약속을 보여주었다. 그들의 독특한 보조 구조 때문 분자 비콘 보도 낮은 배경 형광 및 그로 인하여 제공 탁월한 감도47높은 합법적인 신호를 생성 합니다. 전 임상 평가 제안 하나, 10 나 선상 세균44,45사이 잠재적인 검출 임계값. 또한, 기술은 멀티플렉스 반응을 동시에 포유류 호스트 유전자44 및45의 다른 tick-borne 병원 균 감지는 nPCR과 같이 쉽게 달성에서 성공적으로 적용 되었다. 다른 디자인 수정 포함 표준 곡선39,48를 사용 하지 않고 DNA를 계량 수 방울 디지털 PCR (ddPCR) 기술. 보렐 리아 에 대 한이 기술의 낮은 검출 한계는 똑같이 약 10 나 선상 세균/샘플39이다. NPCR에 비해, 이러한 접근 또한 이점을 오염, 감소 잠재력의 그들은 단일 증폭 프로토콜을 필요로.
감시의 목적은 프로 틱의 다양 한 세균성 내용 대신 경우 16S rRNA metagenomic 심사는 매력적인 옵션49이다. 그것은 정확 하 게 더 많은 미생물의 광범위 한 스펙트럼을 캡처할 수 있습니다 있지만이 이렇게 costlier, 모든 분자 생물학 실험실에서 찾을 수 없는 특수 DNA 시퀀서 필요 필요로 보다 정교한 생물 정보학 기반 해석, 벡터의 병원 체 로드를 나타냅니다.
정량 및 그 유도체는 양적 응용 프로그램에 대 한 선택의 방법 metagenomics 화면 틱 미생물의 광범위 한 재고를 제공 하는 동안 대상된 감시 노력은 종종 염려의 유무의 이진 보고 벡터에 하나 또는 소수의 병원 이러한 상황에서이 최신, 더 정교한 접근 과정에 불필요 한 복잡성과 재정 부담이 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로, nPCR 틱 테스트에서 중추적인 기법으로 시간 시험을 성장 했다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
뇌관 디자인을 위해 카 미 해리스, 애슐리 McKibbon 촬영, 제시카 토마스 Ebbett 죤 Blakely, 알렉산드라 폴 리-Eby, 크리스 랭 글 리, 줄리 루이스, 켈 시 매 킨 타이어, 애슐리 McKibbon, 크리스 하느님, 그리고로 지에 대 한 개 감사 하고자 하는 저자는 비디오입니다. A. M. K. 캐나다 라임 질병 연구 재단에 의해 지원 되었다 그리고 프로젝트 자금 자연과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에 의해 제공 했다. M. K. B. W. 급여 자금 뉴 브 런 즈 윅 혁신 재단 (NBIF)에서 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LabGard Class II, Type A2 biological safety cabinet | Nuaire | ES AIR NU-543 | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | 0.22 mm thickness |
| Microfuge Tubes (Microtubes 1.5 mL) | Axygen | 311-08-051 | |
| AquaGenomic | MultiTarget Pharmaceuticals | 2030 | DNA extraction reagent |
| Microtube Pestle | Diamed | DIATEC610-1551 | Designed for 1.5 ml tubes |
| Water bath - Isotemp 202 | Fishse Scientific | 15-462-2 | |
| Vortex | Labnet | S0100 CAN | |
| Spectrafuge 24D Digital Microcentrifuge | Labnet | C2400 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 | |
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | B9754 | |
| Primer Synthesis | Sigma-Aldrich | OLIGO | |
| PCR Cabinet | Misonix | PCR6-482 | |
| PCR tube with attached flat caps 0.2mL | VWR | 20170-012 | |
| GoTaq Green Master Mix 2x | Promega | M7123 | |
| Nuclease-free water | Promega | M7123 | The water comes with the GTG |
| Spectrafuge Mini | Labnet | C1301 | |
| SYBR Safe DNA Stain 10,000X Concentration | EDVOTEK | 608 | |
| Froggarose LE (Molecular Biology Grade Agarose) | FroggaBio | A87-500G | |
| GD 100 bp DNA Ladder | FroggaBio | DM001-R500 | |
| Electrophoresis power pack | VWR | VWR 105 | EC Apparatus Corporation |
| Fluor-S MultiImager | BioRad | 170-7700 (Serial number 433B0154) | |
| Quantity One 1-D Analysis Software (V. 4.5.2) | BioRad | 1709600 |
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