Summary
Ce protocole décrit les différentes techniques nécessaires à la microscopie électronique en transmission dont une coloration négative, coupes ultraminces pour structure détaillée et l’immuno-or étiquetage afin de déterminer les positions des protéines spécifiques dans les exosomes.
Abstract
Exosomes sont de taille nanométrique des vésicules extracellulaires sécrétées par les fluides corporels et sont connus pour représenter les caractéristiques des cellules qui sécrètent les. Le contenu et la morphologie des vésicules sécrétées reflètent le comportement cellulaire ou l’état physiologique, par exemple la croissance cellulaire, migration, clivage et la mort. Rôle des exosomes peut dépendre fortement de taille, et la taille des exosomes varie de 30 à 300 nm. La méthode la plus utilisée pour l’imagerie de l’exosome est une coloration négative, tandis que les autres résultats sont basés sur la microscopie à Force atomique, microscopie électronique à balayage et Cryo-microscopie électronique. Morphologie de l’exosome typique évaluée au moyen d’une coloration négative est une forme de coupe, mais davantage de détails ne sont pas encore claires. L’exosome bien caractérisée par l’étude structurelle est nécessaire notamment dans le domaine médical et pharmaceutique. Par conséquent, morphologie fonction dépendant doit être vérifiée par des techniques de microscopie électronique tels que l’étiquetage d’une protéine spécifique dans la structure détaillée de l’exosome. Pour observer la structure détaillée, images coupes ultraminces et images colorées négatives des exosomes ont été comparés. Dans ce protocole, nous vous suggérons de microscopie électronique à transmission pour l’imagerie des exosomes dont une coloration négative toute monture immunomarquage, préparation de bloc, lame mince et étiquetage immuno-or.
Introduction
Les vésicules extracellulaires (EVs) sont des vésicules de bicouche lipidique sécrétées par les cellules, et leur taille varie entre 30 et 300 nm. EVs ont été pour la première fois en 1978, avec preuve de vésicules des patients atteints de maladie de Hodgkin1. Ces vésicules ont été signalés à être 40 à 120 nanomètres dans la taille. En 1980, il a été signalé que les EVs sont impliqués dans le système de coagulation et de la thrombose, la formation d’un caillot de sang à l’intérieur d’un vaisseau sanguin dans le cancer patients2. Après 30 ans, les EVs ont été signalés à être un facteur important pour promouvoir l’invasion tumorale, évasion immunitaire et angiogenèse3. En outre, les fonctions du serveur virtuel Exchange ont été étudiées comme régulateurs dans les interactions cellulaires dans les domaines de l’inflammation, troubles immunitaires, maladie neurologique et le cancer4. Puisque EVs contiennent des biomolécules spécifiques tels que des protéines, ARNm et des micro-ARN5, leur application potentielle dans le diagnostic et la thérapeutique a été analysé6,7. Véhicules électriques constituent une catégorie composée des sous-groupes dont les exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticules, promininosomes, argosomes et vésicules exosome semblable, selon leur origine cellulaire et leur fonction biologique3. En outre, basé sur leur biogenèse, ces EVs peuvent être divisés en microvésicules (hangar microvésicules, 100-1000 nm) et exosomes (30-300 nm)8,9. Parmi ceux-ci, l’exosome a été signalé comme un communicateur cellulaire pour10de la réponse immunitaire, cancer11,12et maladies infectieuses13.
Intérêt pour les exosomes comme biomarqueurs pour diagnostic précoce augmente rapidement, et la purification et la caractérisation des exosomes doivent s’accompagner avec des techniques d’imagerie moléculaires. Les différentes tailles et morphologies des exosomes, selon leur origine et fonction14, se distingués par des techniques de microscopie à haute résolution, telles que la microscopie électronique. La plupart exosomes ont été visualisées par négatifs colorés microscopie électronique à Transmission (TEM)15,16,17, et ces résultats sont confirmés par immunomarquage d’une protéine spécifique dans la vésicule de support entier 18. plusieurs groupes de recherche ont rapporté la structure par microscopie électronique à balayage, microscopie à Force atomique19,20et Cryo-TEM21,22. Cependant, bien que ces techniques sont utiles pour étudier la structure de l’exosome, elles sont insuffisantes pour observer la position des protéines spécifiques situés à l’intérieur de l’exosome. Par conséquent, nous vous présentions un protocole d’imagerie exosomes avec l’étiquetage d’une protéine spécifique. Nous avons appliqué la préparation du bloc, coupes ultraminces et immunostaining pour déterminer l’emplacement détaillé de la protéine dans l’exosome. Cela a été comparé avec une coloration négative et toute monture immunomarquage, qui est traditionnellement utilisée pour la caractérisation de l’exosome.
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Protocol
1. bloc préparation, coupes, coloration et d’imagerie de l’Exosome
- Pellet les exosomes de surnageant de culture de cellules HCT116 par centrifugation à 100 000 x g pendant 1,5 h23. Retirer le surnageant de culture et de Difficulté soigneusement le culot de l’exosome purifié avec 1 mL de glutaraldéhyde à 2,5 % en solution de cacodylate de sodium 0,1 M (pH 7,0) pendant 1 h à 4 ° C. Pour cacodylate de sodium 0,1 M, dissoudre 4,28 g d’acide cacodylique dans 160 mL d’eau distillée (DW). Ajuster le pH à 7,4 avec 0,1 M HCl puis faire jusqu'à 200 mL d’eau distillée.
- Retirez le fixateur et rincez les boulettes avec 1 mL de tampon de cacodylate de sodium 0,1 M à la température ambiante. Répétez trois fois à chaque changement d’une durée de 10 min.
- Fixer les échantillons avec 1 mL de tétroxyde d’Osmium 2 % pendant 1 h à 4 ° C.
- Retirez le fixateur et rincer trois fois à cacodylate de sodium 0,1 M de tampon toutes les 10 min.
- Incuber pendant 10 min avec une série graduée de l’acétone (50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 %, respectivement) sur l’agitateur.
- Retirez l’acétone et incuber la solution de mélange encastrement de 3:1 acétone : faible viscosité pendant 30 min. Le culot de l’exosome est dans le tube.
- Enlever le milieu et ajouter 1:1 acétone : faible viscosité encastrement mélange moyen, puis incuber pendant 30 minutes.
- Enlever le milieu et ajouter 1 / 3 acétone : faible viscosité encastrement mélange moyen, puis incuber pendant 30 minutes.
- Retirer le milieu et ajouter 100 % faible viscosité enrobage mélange et incuber une nuit à température ambiante.
- Incorporer l’échantillon en pure basse viscosité, incorporer le mélange à l’aide de l’enrobage moule et cuire au four pendant 24 h à 65 ° C.
- Préparer les sections d’épaisseur 60 nm grâce à un ultra-microtome.
- Double-tache avec de l’acétate d’uranyle 2 % pendant 20 min et citrate pendant 10 min de plomb.
Pour la solution de Reynolds de plomb, ajouter 1,33 g de nitrate de plomb et 1,76 g de citrate de sodium à un total de 50 mL d’eau distillée. - Observer la grille sous microscopie électronique à transmission à 80 kV.
- Cliquez sur « Acquérir », puis cliquez sur « Fichier » et « Enregistrer sous » dans le système à caméra CCD en microscopie électronique à 80 kV. Suivez les paramètres automatiques pour la durée d’exposition.
2. immunomarquage de Sections et d’imagerie (Figure 1)
- Coupe des coupes ultrafines de 60 nm à l’aide d’un microtome-ultra et recueillir sur la grille de nickel.
- Incuber les grilles dans 50 gouttes µL de glycine de 0,02 M pendant 10 min étancher les groupes aldéhyde libre.
- Rincez dans 100 μL de DW trois fois chacun pour 10 min. laisser incuber à température ambiante pendant 1 h dans du PBS contenant 1 % de BSA.
- Incuber les grilles dans 50 à 100 gouttes µL d’anti KRS anticorps24 (au 1/100 dans du PBS contenant 0,1 % de BSA) pendant 1 h (si nécessaire, que cette étape doit être effectuée à 4 ° C durant la nuit.)
- Laver les grilles avec 5 gouttes distincts (50 µL) de PBS contenant 0,1 % de BSA pour 10 min chacun.
- Transférer des grilles à gouttes de 2nd anticorps pendant 1 h (anti-lapin IgG conjugué à 10 particules d’or nm (1/100) dans du PBS contenant 0,1 % de BSA).
- Grilles de lavage avec cinq séparent gouttes (50 µL) de PBS contenant 0,1 % de BSA chaque 10 min.
- Double-tache avec l’acétate d’uranyle de 2 % pendant 20 min dans des conditions sombres et citrate de plomb de Reynold pendant 10 min, respectivement.
- Cliquez sur « Acquérir », puis cliquez sur « Fichier » et « Enregistrer sous » dans le système à caméra CCD sous un TEM à 80 kV. Temps d’exposition suivie de réglages automatiques.
Figure 1 : processus de préparation des échantillons et immunostaining. (A) Double fixe exosome est déshydraté et infiltré avec enrobage résine mélange de faible viscosité. (B) résine enrobage. (C) section ultra-mince avec couteau diamant. (D) le programme d’installation pour le marquage Immuno-or. Les grilles avec les coupes ultrafines sont mis sur les gouttelettes de liquide sur une parafilm, qui est placé avec la serviette de papier humide. Chaque section est incubée avec des gouttelettes d’anticorps de 50-100 µL, puis lavée avec un tampon. (E) Double coloration avec l’acétate d’uranyle et citrate de plomb. Le couvercle est recouvert de papier d’aluminium pour la coloration des métaux lourds. (F) solution de coloration est enlevée par le papier filtre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
3. coloration négative
- Les grilles de EM mince formvar/carbone pelliculés cuivre 200 mailles pendant 1 min de déchargeur de lueur décharge luminescente.
- Difficulté des exosomes purifié avec 1 mL de 2 % paraformaldéhyde (PFA) pendant 5 min.
ATTENTION : Paraformaldéhyde vapeurs sont toxiques. Tout travail doit être fait sous une hotte ventilée. - 5-7 µL de solution de suspension exosome sur la grille de charge et incuber pendant 1 min. Si la concentration de l’exosome est trop élevée, diluer la concentration à 1/2 - 1/5.
- Souillez immédiatement avec les ~ 20 gouttes de la solution filtrée 1 % uranyle acétate (UA) sur la surface de la grille de l’EM de la seringue.
- Retirer l’excédent de solution UA sur la grille en communiquant avec le bord de la grille avec du papier filtre.
- Rapidement, rincez la grille avec une goutte d’eau. Cette étape va supprimer la solution de coloration excessive.
- Placez la grille sur la table en organisant avec des pincettes et recouvrir la grille partiellement avec une boîte de Petri sécher pendant 10 min sous la température ambiante.
- Conserver la grille dans une boite de grille d’EM pour future observation par un TEM à 80 kV.
4. toute monture pour Immunostaining
- Décharge luminescente le film mince formvar/carbone enduit 200 grilles d’EM de maille en cuivre pendant 30 s.
- Difficulté des exosomes purifié avec 1 mL de 2 % paraformaldéhyde (PFA) pendant 5 min.
ATTENTION : Paraformaldéhyde vapeurs sont toxiques. Tout travail doit être fait sous une hotte ventilée. - 5-7 µL fixe exosome solution sur la grille de charge et incuber pendant 5 min. Rincer à 100 µL de PBS trois fois chacun pendant 10 min.
- Traiter les grilles avec 50 µL de glycine 0,05 M pendant 10 min étancher les groupes aldéhyde libre.
- Transfert des grilles à une goutte de tampon de blocage (PBS contenant 1 % de BSA) pendant 30 min.
- Incuber les grilles avec 50-100 µL anti anticorps PD-L1 (1/100 dans du PBS contenant 0,1 % de BSA) pendant 1 h (si nécessaire, que cette étape doit être effectuée à 4 ° C durant la nuit).
- Laver grille avec cinq gouttes distincts (50 µL) de PBS contenant 0,1 % de BSA pour 10 min chacun.
- Grille de transfert à une baisse de 2nd anticorps pendant 1 h.
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Representative Results
Actuellement, les exosomes sont classées en catégories de taille et la forme par microscopie électronique à transmission. La figure 2 illustre négatifs colorés exosome et immunitaire marqué exosome support entier du statut. La figure 3 montre l’exosome sectionné et immuno-étiqueté exosomes après lamélisation mince. Immuno-or en utilisant des anticorps des protéines spécifiques de coloration est utilisée pour identifier un exosome positivement et de classer les types de protéines dans l’exosome. Le protocole dans cet article utilise toute monture immunostaining et immunomarquage avec exosome sectionnée en plastique.
Figure 2 : négatif, coloration et toute monture immunomarquage. (A) la morphologie Exosome est observée par une coloration négative. Exosomes montre leur morphologie en forme de coupe. (B, C) Ensemble or Mont immuno-coloration montre l’emplacement d’une protéine spécifique (anti CD274 humaine ; PD-L1) dans l’exosome. Les flèches blanches indiquent l’emplacement de l’or. Les flèches noires indiquent l’emplacement du signal de fond. (D) contrôle d’immunomarquage résultat négatif. Isotype contrôle a été utilisé par un anticorps primaire dans ce processus d’immunomarquage. Echelle = 100 nm.
Figure 3 : microscope électronique des exosomes sectionnés. Morphologie de forme ronde (A) des Exosomes. (B) Boxed exosome utilisant l’outil de « boxer » du programme EMAN. (C, D) Immuno-or étiquetés exosome avec coloration des métaux lourds. Les flèches noires indiquent des particules d’or (A-D) échelle bar = 100 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Cet article présente un protocole pour observer la structure de l’exosome détaillée et le marquage de ses protéines spécifiques. Une coloration négative a été considérée comme la meilleure méthode pour exosome d’imagerie17. Cette technique classique a montré la structure en forme de tasse des exosomes. Cependant, cette forme de coupe est une forme d’artefact qui peut se produire en raison du processus de séchage. Résultats de la Cryo-TEM ont montré que les exosomes ont une structure parfaitement sphérique en solution aqueuse25,26. La technique de cryo-TEM est une méthode très puissante pour l’examen de la structure naturelle, mais il est difficile d’appliquer la méthode immuno-or. Raso et ses collaborateurs a souligné séchage dans la méthode conventionnelle (toute méthode de coloration Mont-négatif) conduit à une morphologie en forme de coupe. Dans cette étude, la méthode standard pour la préparation de cellules (routine EM ; fixation, déshydratation, enrobage et sectionnement) a été appliquée afin de réduire l’exosome effet de séchage. La routine EM utilisant un enrobage en plastique peut éviter ou réduire les artefacts (changements de volume et forme) causées par la dénaturation. Pour une fixation chimique, glutaraldéhyde (GA) a été utilisé pour la mise en réseau (interactions covalentes entre les groupes aminés). Habituellement, le tétroxyde d’osmium (OsO4) est utilisé pour la fixation des lipides ainsi que contraste amélioré.
Dans cette étude, une coloration négative contribué à confirmer la morphologie typique des exosomes qui a été signalé dans les précédents documents21,27,28,29. En plus une coloration négative, bloc de sectionnement est également une bonne méthode pour l’observation des exosomes (Figure 2). Alors que sectionnées images montrent la structure interne de l’exosome, en revanche négatif coloré TEM a montré principalement la surface de l’exosome. Dans images sectionnés (Figure 3), les vésicules ont montré la structure lumen qui est connue comme une caractéristique structurelle des exosomes30. Dans ce protocole, nous avons utilisé le bloc sectionnement, immunomarquage et l’imagerie TEM. Spécialement, le sectionnement de bloc est utile pour l’analyse à une date ultérieure, lorsque les images peuvent être requises à différents grossissements, pour la technique de microscopie différents et pour d’autres analyses comme l’étiquetage immuno-or. Après sectionnement, sections sur la grille peuvent être stockées dans la zone de la grille, qui peut être utilisée pour immuno-coloration pour la classification des exosomes. Par exemple, nous avons détecté l’exosome connu marqueurs14 dans les exosomes isolé pour étudier les fonctions des exosomes.
Méthodes de marquage immunologique à l’or ont des difficultés techniques, y compris aucun marquage ou étiquetage de fond élevé. En ne connaissant aucun étiquetage, nous vous recommandons de vérifier la concentration en anticorps primaire et temps d’incubation primaire. Dans le cas de faibles concentrations d’anticorps primaires, un titrage d’anticorps peut être utile pour trouver l’immunoréactivité optimisée. Il peut également être utile augmenter les temps d’incubation à 4 ° C durant la nuit. En revanche, si la concentration de l’anticorps primaire est trop élevée, ou le temps d’incubation est trop longtemps à la température élevée, le signal de fond sera augmenté.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le Bio & Medical Technology Development Program de la National Research Foundation (NRF) & financé par le gouvernement coréen (MSIP & Ministère) (n° 2016M3A9B6904244). Nous remercions également les membres du pôle de recherche Bioconvergence médicinales pour la purification de l’exosome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
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