Summary
Det här protokollet beskriver de olika teknikerna som är nödvändiga för transmissionselektronmikroskopi inklusive negativ färgning, ultratunna snittning för detaljerad struktur och immuno-guld märkning för att fastställa specifika proteiner positioner i exosomes.
Abstract
Exosomes är nano-storlek extracellulära vesikler utsöndras av kroppsvätskor och är kända som representerar egenskaperna hos celler som utsöndrar dem. Innehåll och morfologi av de utsöndrade blåsor återspeglar cell beteende eller fysiologiska status, till exempel celltillväxt, migration, klyvning och döden. Den exosomes' roll kan bero mycket på storlek och storleken på exosomes varierar från 30 till 300 nm. Den mest använda metoden för exosome imaging är negativ färgning, medan andra resultat baseras på Cryo-transmissionselektronmikroskopi, Scanning Electron Microscopy och Atomic Force Microscopy. Den typiska exosome morfologi bedömas genom negativ färgning är en cup-form, men ytterligare detaljer är ännu inte klart. En exosome välkarakteriserad genom strukturella studier är nödvändiga särskilt i medicinska och farmaceutiska områdena. Funktion beroende av morfologi bör därför kontrolleras av elektronmikroskopi tekniker såsom märkning ett specifikt protein i de detaljerade strukturen exosome. För att observera detaljerade struktur, jämfördes ultratunna sektionerad bilder och negativa färgade bilder av exosomes. I detta protokoll föreslår vi transmissionselektronmikroskopi för bildtagning av exosomes inklusive negativ färgning, hela mount immuno-färgning, block förberedelse, tunna avsnitt och immuno-guld märkning.
Introduction
Extracellulära blåsor (EVs) är lipid lipidens vesikler utsöndras av celler och deras storlek varierar mellan 30 och 300 nm. EVs rapporterades först 1978, med belägg från blåsor av patienter med Hodgkins sjukdom1. Dessa blåsor rapporterades vara 40 till 120 nanometer i storlek. 1980 rapporterades det att EVs är inblandade i koagulationssystemet och trombos, bildandet av en blodpropp inuti ett blodkärl i cancer patienter2. Efter 30 år, har EVs rapporterats vara en viktig faktor att främja tumör invasion, immun fly och angiogenes3. Dessutom har fungerar av EVs studerats som tillsynsmyndigheter i cellulära interaktioner i områdena av inflammation, immunsjukdom, neurologisk sjukdom och cancer4. Eftersom EVs innehålla specifika biomolekyler som proteiner, mRNA och mikroRNA5, har deras potentiella tillämpning i diagnostik och therapeutics analyserat6,7. EVs är en kategori som består av undergrupperna inklusive exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, mikropartiklar, promininosomes, argosomes och exosome-liknande vesicles, beroende på deras cellulära ursprung och biologisk funktion3. Baserat på deras biogenes, kan dessa EVs dessutom delas in i microvesicles (skjul microvesicles, 100-1000 nm) och exosomes (30-300 nm)8,9. Bland dessa, har exosome rapporterats som en cell communicator för immunsvar10, cancer11,12och infektionssjukdom13.
Intresset för exosomes som en biomarkör för tidig diagnos ökar snabbt, och rening och karakterisering av exosomes måste vara i sällskap med molekylära avbildningstekniker. Varierande storlekar och morfologier av exosomes, beroende på deras ursprung och funktion14, kan särskiljas genom mikroskopi tekniker med hög upplösning, t ex elektronmikroskopi. De flesta exosomes var visualiserat genom negativt färgade Transmission Electron Microscopy (TEM)15,16,17, och dessa resultat bekräftades av immunolabeling av ett specifikt protein i hela mount vesikler 18. flera forskargrupper har rapporterat struktur genom Scanning Electron Microscopy, Atomic Force Microscopy19,20och Cryo-TEM21,22. Medan dessa tekniker är användbara för att studera exosome struktur, är de dock otillräcklig för att Observera placeringen av specifika proteiner inuti exosome. Därför har vi infört ett protokoll för imaging exosomes med ett specifikt protein märkning. Vi tillämpade block förberedelse, ultratunna snittning och immunfärgning för att fastställa proteinets detaljerad läge i exosome. Detta jämfördes med negativ färgning och hela berget immunfärgning, som traditionellt används för karaktärisering av exosome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. blockera förberedelse, snittning, färgning och avbildning av Exosome
- Pellets av exosomes från kultur supernatanten av HCT116-celler genom centrifugering vid 100 000 x g i 1,5 h23. Ta bort kulturen supernatanten och noggrant fixa renat exosome pelleten med 1 mL 2,5% glutaraldehyd i 0,1 M natrium cacodylate lösning (pH 7,0) för 1 h vid 4 ° C. För 0,1 M natrium cacodylate, lös 4,28 g cacodylic syra i 160 mL destillerat vatten (DW). Justera pH till 7,4 med 0,1 M HCl gör sedan upp till 200 mL med destillerat vatten.
- Avlägsna fixativ och skölj pellets med 1 mL 0,1 M natrium cacodylate buffert vid rumstemperatur. Upprepa tre gånger med varje förändring som varar i 10 min.
- Efter fix av prov med 1 mL 2% Osmium vanligtvis för 1 h vid 4 ° C.
- Ta bort fixeringsvätskan och skölj tre gånger med 0,1 M natrium cacodylate buffert varje 10 min.
- Inkubera i 10 min med en graderad aceton-serien (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, respektive) på shakern.
- Ta bort aceton och inkubera lösningen av 3:1 aceton: låg viskositet inbäddning blandningen i 30 min. Exosome pelleten är i röret.
- Ta bort mediet och Lägg till 1:1 aceton: låg viskositet inbäddning blandning medium och inkubera i 30 min.
- Ta bort mediet och Lägg till 1:3 aceton: låg viskositet inbäddning blandning medium och inkubera i 30 min.
- Ta bort mediet och lägga 100% låg viskositet inbäddning blandning och inkubera över natten vid rumstemperatur.
- Bädda in provet i ren låg viskositet inbäddning blandning med inbäddning mögel och baka för 24 h vid 65 ° C.
- Förbereda sektioner med 60 nm tjocklek genom en ultra-mikrotomen.
- Dubbel-fläcken med 2% uranyl acetat i 20 min och leda citrat i 10 min.
För Reynolds bly lösning, lägga till 1,33 g bly nitrat och 1.76 g natriumcitrat sammanlagt 50 mL destillerat vatten. - Iaktta rutnätet under transmissionselektronmikroskopi på 80 kV.
- Klickar på ”Hämta” och klicka ”File” och ”Spara som” i CCD kamerasystem under elektronmikroskopet på 80 kV. Följ automatiska inställningar för exponeringstiden.
2. Immuno-färgning av sektioner och Imaging (figur 1)
- Skär 60 nm ultrathin sektioner med en ultra-mikrotomen och samla på rutnätet nickel.
- Inkubera rutnät i 50 µL droppar 0,02 M glycin för 10 min att släcka gratis aldehyd grupper.
- Skölj i 100 μL av DW tre gånger vardera för 10 min. Inkubera vid rumstemperatur för 1 h i PBS med 1% BSA.
- Inkubera rutnät i 50-100 µL droppar anti KRS antikropp24 (1: 100 i PBS som innehåller 0,1% BSA) för 1 h (om nödvändigt, detta steg bör genomföras vid 4 ° C över natten.)
- Tvätta rutnät med fem separata droppar (50 µL) av PBS som innehåller 0,1% BSA för 10 min varje.
- Överföra galler till droppar 2nd antikropp för 1 h (anti-kanin IgG konjugerat till 10 nm guld partikel (1: 100) i PBS som innehåller 0,1% BSA).
- Tvätta rutnät med fem separata droppar (50 µL) av PBS som innehåller 0,1% BSA varje 10 min.
- Dubbel-fläcken med 2% uranyl acetat i 20 min under mörka förhållanden och med Reynolds bly citrat i 10 min, respektive.
- Klickar på ”Hämta” och klicka ”File” och ”Spara som” i CCD kamerasystem under en TEM på 80 kV. Exponeringstid följt automatiska inställningar.
Figur 1: processen för provberedning och immunfärgning. (A) dubbla fasta exosome är uttorkad och infiltrerade med låg viskositet inbäddning blandning harts. (B) harts inbäddning. (C) Ultra-tunn avsnitt med diamond kniv. (D) inställning för Immuno-guld märkning. Rutnäten med ultratunna sektioner sätts på flytande droppar på en parafilm, som placeras med våt pappershandduk. Varje avsnitt är inkuberas med droppar av 50-100 µL antikropp, sedan tvättas med buffert. (E) dubbel färgning med uranyl acetat och leda citrat. Locket är täckt med aluminiumfolie för tungmetall färgning. (F) färgning lösning avlägsnas genom filterpapper. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
3. negativ färgning
- Glöd-ansvarsfrihet tunn formvar/kol filmdragerade 200 mesh koppar EM rutnäten för 1 min av glöd discharger.
- Fixa renat exosomes med 1 mL 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) för 5 min.
Försiktighet: PARAFORMALDEHYD ångorna är giftiga. Allt arbete bör göras i ett ventilerat dragskåp. - Fyll på 5-7 µL exosome fjädring lösning på nätet och inkubera i 1 min. Om koncentrationen av exosome är för hög, späd koncentrationen till 1/2 - 1/5.
- Omedelbart fläcken med ~ 20 droppar av filtrerade 1% uranyl acetat (UA) lösning på ytan av rutnätet EM av sprutan.
- Ta bort överflödigt UA lösningen på nätet genom att kontakta rutnät kanten med filterpapper.
- Snabbt skölja rutnätet med en droppe vatten. Detta steg tar bort överflödig färglösningen.
- Placera rutnätet på bordet genom att hålla med pincett och täcka rutnätet delvis med en kultur maträtt torka i 10 min under rumstemperatur.
- Förvara i rutnätet i ett EM rutnät låda för framtida observation av en TEM på 80 kV.
4. hela Mount för immunfärgning
- Glöd-ansvarsfrihet tunn formvar/kol filmen belagda 200 mesh koppar EM galler för 30 s.
- Fixa renat exosomes med 1 mL 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) för 5 min.
Försiktighet: PARAFORMALDEHYD ångorna är giftiga. Allt arbete bör göras i ett ventilerat dragskåp. - Fyll på 5-7 µL fasta exosome lösning på nätet och inkubera i 5 min. Skölj med 100 µL av PBS tre gånger vardera för 10 min.
- Behandla nät med 50 µL av 0,05 M glycin för 10 min att släcka gratis aldehyd grupper.
- Överföra galler till en droppe blockerande buffert (PBS som innehåller 1% BSA) i 30 min.
- Inkubera nät med 50-100 µL anti PD-L1-antikropp (1: 100 i PBS som innehåller 0,1% BSA) för 1 h (om nödvändigt, detta steg bör genomföras vid 4 ° C över natten).
- Tvätta rutnät med fem separata droppar (50 µL) av PBS som innehåller 0,1% BSA för 10 min varje.
- Överföra rutnät till en droppe 2nd antikropp för 1 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För närvarande indelas exosomes i storlek och form kategorier av transmissionselektronmikroskopi. Figur 2 visar negativt färgade exosome och immun-märkt exosome i hela mount status. Figur 3 visar sektionerad exosome och immuno-märkt exosomes efter tunn snittning. Immuno-guld färgning med hjälp av antikroppar av specifika proteiner används för att identifiera en exosome positivt och klassificera olika typer av proteiner i exosome. Protokollet i detta dokument använder hela mount immunfärgning och immunfärgning med plast sektionerad exosome.
Figur 2: negativ färgning och hela berget immuno-färgning. (A) Exosome morfologi observeras av negativ färgning. Exosomes visar deras skålformade morfologi. (B, C) Hela berget immuno-guld färgning visar platsen för specifika protein (anti mänsklig CD274; PD-L1) i exosome. Vita pilar indikerar platsen för guld. Svarta pilar indikerar platsen för bakgrunden signalen. (D) negativ kontroll av immunfärgning resultatet. Isotypen kontroll användes av primär antikropp i denna immunfärgning process. Skalstapeln = 100 nm.
Figur 3: elektron Mikrograf av sektionerad exosomes. (A) Exosomes' runda formen morfologi. (B) Boxed exosome med verktyget ”boxare” i EMAN program. (C, D) Immuno-guld märkt exosome med tungmetall färgning. Svarta pilar tyder guldpartiklar (A-D) skala bar = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel presenterar ett protokoll för att observera den detaljerade exosome struktur och uppmärkning av dess specifika proteiner. Negativ färgning har ansetts som den bästa metoden för exosome imaging17. Denna konventionella teknik har visat exosomes' skålformade struktur. Men är denna cup form en form av artefakt som kan uppstå på grund av torkningsprocessen. Cryo-TEM resultat har visat att exosomes har en perfekt sfärisk struktur i vattenlösning25,26. Cryo-TEM tekniken är en mycket kraftfull metod för att pröva den naturliga strukturen, men det är svårt att tillämpa metoden immuno-guld. Raso och medarbetare påpekade torkning i den konventionella metoden (hela färgning metoden mount-negativa) resulterade i en skålformade morfologi. I denna studie, standard metod för cell förberedelse (rutinmässiga EM, fixering, uttorkning, inbäddning, och snittning) tillämpades för att minska den exosome uttorkande effekt. Rutinen EM med plast inbäddning kan undvika eller minska artefakter (förändringar i volym och form) orsakas av denaturering. För kemiska fixering användes glutaraldehyd (GA) för bryggbindningen (kovalenta interaktioner mellan amino grupper). Vanligtvis, används osmium vanligtvis (OsO4) för fixering av lipider samt förbättrad kontrast.
I denna studie bidragit negativ färgning till att bekräfta typiska morfologi av exosomes som rapporterats i tidigare uppsatser21,27,28,29. Förutom att negativ färgning är block snittning också en bra metod för observation av exosomes (figur 2). Medan sektioneras bilder visade den inre strukturen av exosome, visade däremot negativt färgade TEM främst på ytan av exosome. I sektionerad bilder (figur 3) visade blåsor lumen struktur som kallas en strukturell funktion i exosomes30. I detta protokoll använde vi block snittning, immuno-färgning och TEM imaging. Speciellt, är den block snittning användbara för analys vid ett senare tillfälle när bilder kan krävas vid olika förstoringar, för olika mikroskopi teknik och för andra analyser såsom immuno-guld märkning. Efter snittning, kan avsnitten på nätet lagras i rutan rutnät, som kan användas för immuno-färgning för klassificering av exosomes. Exempelvis har vi upptäckt den kända exosome markörer14 i den isolerade exosomes att studera funktionerna i exosomes.
Immunogold märkning metoder har vissa tekniska problem, inklusive ingen märkning eller hög bakgrund märkning. När upplever ingen märkning, rekommenderar vi att du kontrollerar de primära antikroppskoncentrationen och primära inkubationstider. Vid låg koncentration av primära antikroppar, kan antikroppstitrering som vara till hjälp att hitta den optimerade immunoreaktivitet. Det kan också vara bra att öka inkubationstider till 4 ° C över natten. Däremot om koncentrationen av den primära antikroppen är för hög eller inkubationstiden är för långt vid hög temperatur, kommer bakgrunden signalen att öka.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av Bio & medicinsk teknik Development Program av National Research Foundation (NRF) & finansieras av den koreanska regeringen (MSIP & MOHW) (nr 2016M3A9B6904244). Vi tackar också medlemmar av Medicinal Bioconvergence forskningscentrum för rening av exosome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
