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Biology

ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosomes की नमूना तैयारी और इमेजिंग

doi: 10.3791/56482 Published: January 4, 2018

Summary

यह प्रोटोकॉल विस्तृत संरचना के लिए ऋणात्मक धुंधलान, ultrathin सेक्शनिंग सहित ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आवश्यक विभिन्न तकनीकों का वर्णन करता है, और exosomes में विशिष्ट प्रोटीन की स्थिति निर्धारित करने के लिए bliss-गोल्ड ्र ।

Abstract

Exosomes नैनो-आकार extracellular बुलबुले शरीर के तरल पदार्थ से स्रावित होते हैं और उन्हें गुप्त कोशिकाओं की विशेषताओं का प्रतिनिधित्व करने के लिए जाना जाता है । सामग्री और स्रावित बुलबुले के आकृति विज्ञान सेल व्यवहार या शारीरिक स्थिति को प्रतिबिंबित, उदाहरण के लिए सेल विकास, प्रवास, दरार, और मौत. exosomes ' भूमिका अत्यधिक आकार पर निर्भर हो सकता है, और exosomes का आकार 30 से ३०० एनएम के लिए बदलता है । exosome इमेजिंग के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि नकारात्मक धुंधला है, जबकि अंय परिणाम क्रायो-संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी पर आधारित हैं । ठेठ exosome की आकृति विज्ञान नकारात्मक धुंधला के माध्यम से मूल्यांकन एक कप आकार है, लेकिन आगे विवरण अभी तक स्पष्ट नहीं कर रहे हैं । एक अच्छी तरह से संरचनात्मक अध्ययन के माध्यम से विशेषता exosome चिकित्सा और दवा क्षेत्रों में विशेष रूप से आवश्यक है । इसलिए, फ़ंक्शन-निर्भर आकृति विज्ञान exosome की विस्तृत संरचना में एक विशिष्ट प्रोटीन लेबलिंग जैसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक द्वारा सत्यापित किया जाना चाहिए । विस्तृत संरचना का निरीक्षण करने के लिए, ultrathin खोदी छवियों और exosomes के नकारात्मक दाग छवियों की तुलना में थे । इस प्रोटोकॉल में, हम नकारात्मक धुंधला, पूरे माउंट bliss-धुंधला, ब्लॉक तैयारी, पतले सेक्शन, और bliss-गोल्ड लेबलिंग सहित exosomes के इमेजिंग के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का सुझाव देते हैं ।

Introduction

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Extracellular बुलबुले (ईवीएस) लिपिड bilayer बुलबुले कोशिकाओं द्वारा स्रावित कर रहे हैं, और उनके आकार 30 और ३०० एनएम के बीच पर्वतमाला । ईवीएस पहले १९७८ में रिपोर्ट किया गया है Hodgkin रोग1के साथ रोगियों के बुलबुले से सबूत के साथ । इन बुलबुले के आकार में ४० से १२० nanometers होने की सूचना थी । १९८० में, यह बताया गया कि ईवीएस जमावट प्रणाली और घनास्त्रता, कैंसर रोगियों में एक रक्त वाहिनियों के अंदर एक खून का थक्का के गठन में शामिल कर रहे हैं2. 30 साल के बाद, ईवीएस को ट्यूमर के आक्रमण को बढ़ावा देने के लिए एक महत्वपूर्ण कारक होने की सूचना दी गई है, प्रतिरक्षा भागने, और angiogenesis3। इसके अलावा, ईवीएस के कार्य सूजन के क्षेत्रों में सेलुलर बातचीत में नियामकों के रूप में अध्ययन किया गया है, प्रतिरक्षा विकार, स्नायविक रोग, और कैंसर4. चूंकि ईवीएस प्रोटीन, mRNA, और microRNA5के रूप में विशिष्ट अणुओं होते हैं, निदान और चिकित्सकीय में अपने संभावित आवेदन6,7विश्लेषण किया गया है । ईवीएस exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, microparticles, promininosomes, argosomes, और exosome-बुलबुले की तरह, अपने सेलुलर मूल और जैविक समारोह3के आधार पर सहित उपसमूहों से बना एक वर्ग हैं । इसके अलावा, उनकी उत्पत्ति के आधार पर, इन ईवीएस microvesicles (शेड microvesicles, १००-१००० एनएम) और exosomes (30-300 एनएम)8, 9 में विभाजित किया जा सकता है । इनमें से, exosome प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया10, कैंसर11,12, और संक्रामक रोग13के लिए एक सेल कम्युनिकेटर के रूप में सूचित किया गया है ।

प्रारंभिक निदान के लिए एक exosomes के रूप में ब्याज तेजी से बढ़ती जा रही है, और exosomes के शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन आणविक इमेजिंग तकनीक के साथ किया जाना चाहिए । अलग आकार और exosomes के morphologies, उनके मूल और समारोह के आधार पर14, ऐसे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में उच्च संकल्प, के साथ सूक्ष्म तकनीक द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है । अधिकांश exosomes नकारात्मक सना हुआ संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (उनि)15,16,17, और इन परिणामों की पुष्टि की गई पूरे माउंट में एक विशिष्ट प्रोटीन के immunolabeling द्वारा किए गए थे पुटिका 18. कई अनुसंधान समूहों स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी19,20, और क्रायो-उनि21,22के माध्यम से संरचना की सूचना दी है । हालांकि, जबकि इन तकनीकों exosome संरचना का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं, वे exosome अंदर स्थित विशिष्ट प्रोटीन की स्थिति देख के लिए अपर्याप्त हैं । इसलिए, हम एक विशिष्ट है प्रोटीन लेबलिंग के साथ इमेजिंग exosomes के लिए एक प्रोटोकॉल की शुरुआत की । हम exosome में प्रोटीन के विस्तृत स्थान का पता लगाने के लिए ब्लॉक तैयारी, ultrathin अनुभाग, और immunostaining लागू । इस नकारात्मक धुंधला और पूरे माउंट immunostaining, जो परंपरागत रूप से exosome के लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है के साथ तुलना की गई ।

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Protocol

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1. ब्लॉक तैयारी, अनुभाग, धुंधला और Exosome की इमेजिंग

  1. HCT116 कोशिकाओं की संस्कृति supernatant से exosomes गोली १००,००० x जी के लिए १.५ ज23पर केंद्रापसारक द्वारा । संस्कृति supernatant निकालें और ध्यान से शुद्ध exosome गोली 1 के लिए ०.१ एम सोडियम cacodylate समाधान (पीएच ७.०) में २.५% glutaraldehyde की मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के साथ ठीक । ०.१ मीटर सोडियम cacodylate के लिए, आसुत जल (DW) के १६० मिलीलीटर में ४.२८ ग्राम cacodylic एसिड भंग । ०.१ मीटर एचसीएल के साथ ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें फिर आसुत जल के साथ २०० मिलीलीटर करने के लिए बनाते हैं ।
  2. निर्धारण निकालें और कमरे के तापमान पर ०.१ मीटर सोडियम cacodylate बफर की 1 मिलीलीटर के साथ छर्रों कुल्ला । दोहराएं प्रत्येक परिवर्तन स्थाई 10 मिनट के साथ तीन बार ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2% आज़मियम tetroxide के 1 मिलीलीटर के साथ नमूनों को पोस्ट-फिक्स करें ।
  4. निर्धारण और कुल्ला ०.१ एम सोडियम cacodylate बफर के साथ तीन बार हर 10 मिनट निकालें ।
  5. एक वर्गीकृत एसीटोन श्रृंखला के साथ 10 मिनट के लिए मशीन (५०%, ६०%, ७०%, ८०%, ९०%, ९५%, १००%, क्रमशः) शेखर पर ।
  6. एसीटोन निकालें और 3:1 एसीटोन के समाधान की मशीन: 30 मिनट के लिए कम चिपचिपापन embedding मिश्रण । exosome गोली ट्यूब में है ।
  7. मध्यम निकालें और जोड़ें 1:1 एसीटोन: कम चिपचिपापन एंबेडिंग मिश्रण मध्यम, तो 30 मिनट के लिए मशीन ।
  8. मध्यम निकालें और जोड़ें 1:3 एसीटोन: कम चिपचिपापन एंबेडिंग मिश्रण मध्यम, तो 30 मिनट के लिए मशीन ।
  9. मध्यम निकालें और १००% कम चिपचिपापन एंबेडिंग मिश्रण और कमरे के तापमान पर रात भर गर्मी जोड़ें ।
  10. ६५ डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए एंबेडिंग मोल्ड और सेंकना का उपयोग शुद्ध कम चिपचिपापन एंबेडिंग मिश्रण में नमूना एंबेड ।
  11. एक अल्ट्रा microtome के माध्यम से ६० एनएम मोटाई के साथ वर्गों तैयार करते हैं ।
  12. डबल 20 मिनट और 10 मिनट के लिए नेतृत्व साइट्रेट के लिए 2% uranyl एसीटेट के साथ दाग ।
    रेनॉल्ड्स लीड समाधान के लिए, ५० मिलीलीटर आसुत पानी की कुल करने के लिए सीसा नाइट्रेट और सोडियम साइट्रेट के १.७६ ग्राम के १.३३ ग्राम जोड़ें ।
  13. ८० केवी पर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के तहत ग्रिड का निरीक्षण ।
  14. क्लिक करें "मोल" और फिर क्लिक करें "फ़ाइल" और "के रूप में सहेजें" सीसीडी कैमरा प्रणाली में इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत ८० केवी. एक्सपोज़र समय के लिए स्वचालित सेटिंग्स का पालन करें ।

2. bliss-वर्गों और इमेजिंग के धुंधला (चित्रा 1)

  1. कट ६० एनएम ultrathin एक अल्ट्रा microtome का उपयोग कर वर्गों, और निकल ग्रिड पर इकट्ठा ।
  2. मुक्त एल्डिहाइड समूहों बुझाने के लिए 10 मिनट के लिए ०.०२ मीटर glycine के ५० µ एल ड्रॉप में ग्रिड की मशीन ।
  3. DW के १०० μL में कुल्ला तीन बार प्रत्येक 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 1 h के लिए 1% से युक्त पंजाबियों में मशीन BSA ।
  4. ५० में मशीन ग्रिड-१०० एंटी KRS एंटीबॉडी µ एल बूंदों के24 (०.१% BSA युक्त पंजाब में 1:100) 1 ज के लिए (यदि आवश्यक हो, इस कदम को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जाना चाहिए.)
  5. 10 मिनट प्रत्येक के लिए ०.१% BSA युक्त पंजाबियों के पांच अलग बूंदों (५० µ एल) के साथ ग्रिड धो लें ।
  6. 1 घंटे के लिए 2nd एंटीबॉडी की बूंदों के लिए ग्रिड स्थानांतरण (विरोधी खरगोश आईजीजी संयुग्मित से 10 एनएम गोल्ड कण (1:100) में ०.१% BSA युक्त) ।
  7. पांच अलग बूंदों (५० µ एल) के साथ धो ग्रिड ०.१% BSA प्रत्येक 10 मिनट युक्त पंजाबियों के ।
  8. डबल अंधेरे शर्तों के तहत 20 मिनट के लिए और 10 मिनट, क्रमशः के लिए है Reynold नेतृत्व साइट्रेट के साथ 2% uranyl एसीटेट के साथ दाग ।
  9. क्लिक करें "मोल" और फिर क्लिक करें "फ़ाइल" और "के रूप में सहेजें" सीसीडी कैमरा प्रणाली में एक उनि के तहत ८० केवी. एक्सपोज़र समय ने स्वचालित सेटिंग फ़ॉलो की ।

Figure 1
चित्र 1: नमूना तैयारी और immunostaining की प्रक्रिया । (क) डबल फिक्स्ड exosome निर्जलित और कम चिपचिपापन embedding मिश्रण राल के साथ घुसपैठ की है । (ख) राल embedding । (ग) डायमंड चाकू के साथ अल्ट्रा पतली अनुभाग । (D) bliss-गोल्ड लेबलिंग के लिए सेटअप । ultrathin वर्गों के साथ ग्रिड एक parafilm है, जो गीला कागज तौलिया के साथ रखा जाता है पर तरल बूंदों पर डाल रहे हैं । प्रत्येक खंड ५०-१०० µ एल एंटीबॉडी की बूंदों के साथ मशीन है, तो बफर के साथ धोया । (ङ) uranyl एसीटेट और सीसा साइट्रेट के साथ डबल धुंधला । ढक्कन भारी धातु धुंधला के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर किया जाता है । (च) धुंधला समाधान फ़िल्टर काग़ज़ द्वारा निकाल दिया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

3. नकारात्मक धुंधला

  1. चमक-निर्वहन पतली formvar/कार्बन फिल्म लेपित २०० मेष कॉपर EM ग्रिड 1 मिनट के लिए ग्लो अभियोक्ता द्वारा ।
  2. 5 मिनट के लिए 2% Paraformaldehyde (पीएफए) के 1 मिलीलीटर के साथ शुद्ध exosomes ठीक करें ।
    सावधानी: Paraformaldehyde धुएं विषाक्त कर रहे हैं । सभी काम एक हवादार धुएं हुड में किया जाना चाहिए ।
  3. लोड 5-7 µ एल exosome ग्रिड पर निलंबन समाधान और 1 मिनट के लिए मशीन । यदि exosome की एकाग्रता बहुत अधिक है, 1/2-1/5 करने के लिए एकाग्रता को पतला ।
  4. तुरंत सिरिंज द्वारा EM ग्रिड की सतह पर फ़िल्टर 1% uranyl एसीटेट (UA) समाधान की ~ 20 बूंदों के साथ दाग ।
  5. ग्रिड पर अतिरिक्त UA समाधान फिल्टर कागज के साथ ग्रिड किनारे से संपर्क करके निकालें ।
  6. जल्दी से पानी की एक बूंद के साथ ग्रिड कुल्ला । यह चरण अतिरिक्त धुंधला समाधान निकाल देगा ।
  7. चिमटी के साथ धारण करके मेज पर ग्रिड प्लेस, और एक संस्कृति डिश के साथ आंशिक रूप से ग्रिड को कवर कमरे के तापमान के तहत 10 मिनट के लिए शुष्क करने के लिए ।
  8. ८० केवी में एक उनि द्वारा भविष्य के अवलोकन के लिए एक EM ग्रिड बॉक्स में ग्रिड की दुकान ।

4. Immunostaining के लिए पूरे माउंट

  1. चमक-निर्वहन पतली formvar/कार्बन फिल्म लेपित २०० मेष कॉपर EM ग्रिड के लिए 30 एस ।
  2. 5 मिनट के लिए 2% Paraformaldehyde (पीएफए) के 1 मिलीलीटर के साथ शुद्ध exosomes ठीक करें ।
    सावधानी: Paraformaldehyde धुएं विषाक्त कर रहे हैं । सभी काम एक हवादार धुएं हुड में किया जाना चाहिए ।
  3. लोड 5-7 µ एल ग्रिड पर फिक्स्ड exosome समाधान और 5 min. कुल्ला के लिए पंजाब के १०० µ एल के साथ तीन बार 10 मिनट के लिए प्रत्येक के लिए मशीन ।
  4. 10 मिनट के लिए ०.०५ एम glycine के ५० µ एल के साथ ग्रिड समझो मुक्त एल्डिहाइड समूहों बुझाने के लिए ।
  5. ब्लॉक बफर की एक बूंद के लिए ग्रिड स्थानांतरण (पंजाब 1% BSA युक्त) 30 मिनट के लिए ।
  6. ५० के साथ मशीन ग्रिड-१०० µ एल एंटी पीडी-L1 एंटीबॉडी (1:100 पंजाब में ०.१% BSA युक्त) 1 के लिए ज (यदि आवश्यक हो, इस चरण में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर किया जाना चाहिए) ।
  7. 10 मिनट प्रत्येक के लिए ०.१% BSA युक्त पंजाबियों के पांच अलग बूंदों (५० µ एल) के साथ ग्रिड धो लें ।
  8. 1 h के लिए 2nd एंटीबॉडी की एक बूंद के लिए ग्रिड स्थानांतरण ।
एंटी-माउस आईजीजी संयुग्मित को 9-11 एनएम गोल्ड पार्टिकल को 1:100 पर पतला कर ०.१% BSA वाले पंजाब में ।
  • 10 मिनट प्रत्येक के लिए ०.१% BSA युक्त पंजाबियों के पांच अलग बूंदों (५० µ एल) के साथ ग्रिड धो लें । दो अलग बूंदों (५० µ एल) DW के साथ ग्रिड धो लें । ३.४ से ३.८ के रूप में वर्णित के रूप में 2% uranyl एसीटेट के साथ नकारात्मक धुंधला प्रदर्शन ।
  • ८० केवी में एक उनि द्वारा भविष्य के अवलोकन के लिए एक EM ग्रिड बॉक्स में ग्रिड की दुकान ।
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    Representative Results

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    वर्तमान में, exosomes आकार और आकार श्रेणियों में संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा वर्गीकृत कर रहे हैं । चित्रा 2 पूरे माउंट स्थिति में नकारात्मक दाग exosome और प्रतिरक्षा लेबल exosome से पता चलता है. चित्रा 3 से पता चलता है खोदी exosome और bliss-बला exosomes बाद पतली खोदी । bliss-सोने विशिष्ट प्रोटीन का एंटीबॉडी का उपयोग दाग सकारात्मक एक exosome की पहचान और exosome में प्रोटीन के प्रकार वर्गीकृत करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस पत्र में प्रोटोकॉल पूरे माउंट immunostaining और प्लास्टिक के साथ immunostaining खोदी exosome का उपयोग करता है ।

    Figure 2
    चित्रा 2: नकारात्मक धुंधला और पूरे माउंट bliss-धुंधला । (क) Exosome आकृति विज्ञान नकारात्मक धुंधला द्वारा मनाया जाता है । Exosomes उनके कप के आकार आकृति विज्ञान से पता चलता है । (ख, ग) पूरे माउंट bliss-गोल्ड धुंधला विशिष्ट प्रोटीन के स्थान से पता चलता है (एंटी ह्यूमन CD274; exosome में पीडी-L1). सफेद तीर सोने के स्थान का संकेत है । काले तीर पृष्ठभूमि संकेत के स्थान का संकेत है । (D) immunostaining परिणाम का नकारात्मक नियंत्रण । इस immunostaining प्रक्रिया में प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा Isotype नियंत्रण का उपयोग किया गया । स्केल बार = १०० एनएम ।

    Figure 3
    चित्रा 3: इलेक्ट्रॉन micrograph की खोदी exosomes. (क) Exosomes ' गोल आकृति विज्ञान । (ख) एमन कार्यक्रम में "बॉक्सर" उपकरण का उपयोग exosome बॉक्स्ड । (सी, डी) bliss-सोने की बला भारी धातु के दाग से exosome । काले तीर सोने के कणों का संकेत (A-D) स्केल बार = १०० एनएम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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    Discussion

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    यह लेख विस्तृत exosome की संरचना और उसके विशिष्ट प्रोटीन के लेबल देख के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । नकारात्मक धुंधला exosome इमेजिंग17के लिए सबसे अच्छी विधि के रूप में माना गया है । इस पारंपरिक तकनीक exosomes ' कप के आकार संरचना दिखाया गया है । हालांकि, इस कप आकार मूर्ति है कि सुखाने की प्रक्रिया के कारण हो सकता है का एक रूप है । क्रायो-उनि परिणाम से पता चला है कि exosomes जलीय समाधान25,26में एक पूरी तरह से गोलाकार संरचना है । क्रायो-उनि तकनीक प्राकृतिक संरचना की जांच के लिए एक बहुत शक्तिशाली तरीका है, लेकिन यह bliss-सोने की विधि लागू करने के लिए मुश्किल है । रासो और सह-कार्यकर्ताओं ने परम्परागत पद्धति में सुखाने की ओर इशारा किया (पूरे पर्वत-नकारात्मक धुंधला विधि) एक कप के आकार की आकृति विज्ञान के परिणामस्वरूप । इस अध्ययन में, सेल तैयारी के लिए मानक विधि (उंहें नियमित; निर्धारण, निर्जलीकरण, embedding, और अनुभाग) exosome सुखाने प्रभाव को कम करने के लिए लागू किया गया था । नित्य उंहें प्लास्टिक एंबेडिंग का उपयोग कर से बचने या कलाकृतियों को कम कर सकते है (मात्रा और आकार में परिवर्तन) विकार की वजह से । रासायनिक निर्धारण के लिए, glutaraldehyde (GA) का उपयोग क्रॉस-लिंकिंग (अमीनो समूहों के बीच आबंध इंटरैक्शन) के लिए किया जाता था. आमतौर पर, आज़मियम tetroxide (OsO4) लिपिड के निर्धारण के साथ ही सुधार कंट्रास्ट के लिए प्रयोग किया जाता है ।

    इस अध्ययन में, नकारात्मक धुंधला exosomes की विशिष्ट आकृति रचना है कि पिछले कागजात21,27,28,29में सूचित किया गया है की पुष्टि करने में मदद की । नकारात्मक दाग के अलावा, ब्लॉक अनुभाग भी exosomes (चित्रा 2) के अवलोकन के लिए एक अच्छा तरीका है । जबकि खोदी गई छवियों में exosome की भीतरी संरचना दिखाई देती है, इसके विपरीत नकारात्मक सना में उनि ने मुख्य रूप से exosome की सतह को दिखाया. में खोदी छवियों (चित्रा 3), बुलबुले लुमेन संरचना है कि exosomes30के एक संरचनात्मक सुविधा के रूप में जाना जाता है दिखाया. इस प्रोटोकॉल में, हम ब्लॉक अनुभाग, bliss-धुंधला, और उनि इमेजिंग का इस्तेमाल किया । विशेष रूप से, ब्लॉक अनुभाग एक बाद में विश्लेषण के लिए उपयोगी है जब छवियों विभिन्न आवर्धन पर आवश्यक हो सकता है, अलग माइक्रोस्कोपी तकनीक के लिए, और अन्य विश्लेषणों के लिए जैसे bliss-गोल्ड लेबलिंग. अनुभाग के बाद, ग्रिड पर वर्गों ग्रिड बॉक्स में संग्रहीत किया जा सकता है, जो bliss के लिए इस्तेमाल किया जा सकता-exosomes के वर्गीकरण के लिए धुंधला । उदाहरण के लिए, हमने ज्ञात exosome मार्करों का पता लगाया14 अलग exosomes में exosomes के कार्यों का अध्ययन करने के लिए.

    Immunogold लेबलिंग विधियों में कुछ तकनीकी समस्याएं हैं, जिनमें कोई लेबलिंग या उच्च पृष्ठभूमि लेबल नहीं है । जब कोई लेबलिंग का अनुभव, हम प्राथमिक एंटीबॉडी एकाग्रता और प्राथमिक मशीन समय की जांच की सलाह देते हैं । प्राथमिक एंटीबॉडी की कम एकाग्रता के मामले में, एंटीबॉडी अनुमापन अनुकूलित immunoreactivity खोजने के लिए उपयोगी हो सकता है । यह भी रात भर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए गर्मी समय बढ़ाने के लिए सहायक हो सकता है । इसके विपरीत, यदि प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता बहुत अधिक है या उच्च तापमान पर मशीन समय बहुत लंबा है, पृष्ठभूमि संकेत बढ़ जाएगा ।

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    Disclosures

    लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

    Acknowledgments

    इस शोध का समर्थन बायो & #38; नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) के मेडिकल टेक्नोलॉजी डेवलपमेंट प्रोग्राम & #38; कोरियन सरकार (MSIP & #38; MOHW) (No. 2016M3A9B6904244) द्वारा वित्तपोषित । हम भी exosome के शुद्धिकरण के लिए औषधीय अभिसरण अनुसंधान केंद्र के सदस्यों को धंयवाद ।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Glutaraldehyde EMS 16200
    Sodium cacodylate  EMS 12300
    Osmium tetroxide 1 g crystal EMS 19100 Use only in fume hood
    acetone JUNSEI 1B2031
    Spurr medium TED PELLA 18108
    Ultra-microtome Leica UCT
    Uranyl acetate EMS 22400 Hazardous chemical
    Lead citrate EMS 17900
    Transmission Electron Microscopy Hitachi H7600
    nickel grid EMS G200-Ni
    Copper grid EMS G200-Cu
    glycine SIGMA 022K5404
    Phosphate buffer saline SIGMA P4417
    Bovine serum albumin Aurion 25557
    1st Antibody purification in manually 
    Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody BioLegend 329710 Whole mount Immumogold
    Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl BioLegend 401202 Whole mount Immumogold (Control)
    2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle sigma G7652
    Transmission Electron Microscopy JEOL JEM2200FS
    Glow discharger JEOL JFC1100E
    Carbon grid EMS 121119
    Paraformaldehyde EMS 19210
    Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) EMS FCF200-CU
    Formvar carbon coated  Nickel Grid (200 mesh) EMS FCF200-NI

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा Exosomes की नमूना तैयारी और इमेजिंग
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    Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).More

    Jung, M. K., Mun, J. Y. Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (131), e56482, doi:10.3791/56482 (2018).

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