Summary
このプロトコルでは、否定的な汚損、詳細な構造と免疫金エクソソームの特定の蛋白質の位置を判断するための極薄断面透過型電子顕微鏡に必要な様々 なテクニックについて説明します。
Abstract
エクソソームは体液によって分泌されるナノ細胞小胞であり、それらを分泌する細胞の特性を表すために知られています。分泌小胞の形態と内容は、セルの動作または生理学的状態、たとえば細胞増殖、移行、胸の谷間と死を反映します。エクソソームの役割のサイズに非常に依存し、エクソソームのサイズ、30 ~ 300 nm。エキソソーム イメージングのため最も広く使用されている方法が否定的な汚損、その他の結果は、クライオ電子顕微鏡、走査電子顕微鏡、原子間力顕微鏡に基づいていますが。典型的なエキソソームの形態の否定的な汚損によって評価はカップの形状が、さらに詳細はまだ分からない。エキソソームの構造研究を特徴は医学・薬学分野の特定の必要です。したがって、関数に依存した形態はエキソソームの詳細構造の特定の蛋白質のラベル付けなどの電子顕微鏡検査の技術によって検証すべき。詳細な構造を観察するには、エクソソームの負の染色像と極薄, 切片画像を比較しました。このプロトコルでは、私達は否定的な汚損、全体マウント免疫染色、ブロック作製、薄セクション、および免疫金ラベルを含むエクソソームのイメージングのための透過型電子顕微鏡を提案します。
Introduction
細胞小胞 (Ev) は、細胞から分泌される脂質二分子膜ベシクル、30、300 nm 間のサイズの範囲します。EVs は、ホジキン病1患者の小胞からの証拠と、1978 年に最初に報告されました。これらの小胞はサイズ 40 に 120 ナノメートルと報告されました。1980 年に、EVs が凝固系と血栓症、癌患者2の血管内血栓の形成に関与していることが報告されました。30 年後、EVs は、浸潤、免疫回避、および血管新生3を促進するために重要な要因であること報告されています。さらに、EVs 機能は、炎症、免疫障害、神経疾患、がん4の領域における細胞間相互作用のレギュレータとして研究されています。EVs は、マイクロ Rna5mRNA、タンパク質など特定の生体分子を含む、診断および治療の潜在的な応用解析6,7されています。EVs は、エクソソーム、prostasomes、oncosomes、dexosomes、微粒子、promininosomes、argosomes、およびエキソソームのような小胞細胞の起源および生物学的機能3によってを含むサブグループから成るカテゴリです。さらに、彼らの器官を基に、これらの EVs に分かれます (小屋機構の解明、100-1000 nm) 機構の解明およびエクソソーム (30-300 nm)8,9。これらのうち、免疫応答10、癌11,12、および伝染病13セル コミュニケーターとして、エキソソームを報告されています。
早期診断マーカーとしてエクソソームの関心が急速に高まっていると精製とエクソソームの性質は、分子イメージング技術と同伴が必要があります。その起源と機能を14、に応じて、エクソソームの形態とさまざまなサイズは、電子顕微鏡などの高解像度の顕微鏡検査の技術によって区別できます。ほとんどエクソソームいた否定的なステンド グラス透過電子顕微鏡 (TEM)15,16,17、可視化し、これらの結果は、全台紙の小胞の特定の蛋白質の反応によって確認されました。18. いくつかの研究グループは、走査電子顕微鏡、原子間力顕微鏡19、20、および低温電子顕微鏡 TEM21,22によって構造を報告しています。ただし、これらのテクニックはエキソソーム構造を調べる場合に役立ちますが、彼ら、エキソソームの内側にある特定の蛋白質の位置観測のために十分ではありません。したがって、特定の蛋白質のラベリングとエクソソームをイメージングするためのプロトコルを導入しました。我々 は、ブロック準備、極薄切片および免疫染色、エキソソームのタンパク質の詳細な場所を判別するに適用されます。否定的な汚損と全体マウント免疫染色は、昔から、エキソソームの特性と比較しました。
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Protocol
1 ブロックの準備、断面、染色や、エキソソームのイメージング
- 1.5 h23100,000 × g で遠心分離によって HCT116 細胞の培養上清からエクソソームをペレットします。培養上清を削除し、1 ml の 0.1 M ナトリウム cacodylate 溶液 (pH 7.0) 4 ° C で 1 時間で 2.5% グルタルアルデヒドの精製エキソソーム ペレットを慎重に修正0.1 M ナトリウム cacodylate 4.28 g ジメチルアルシン酸 160 mL の蒸留水 (DW) を解散します。0.1 M HCl を蒸留水 200 mL までと 7.4 に pH を調整します。
- 定着剤を削除し、室温で 1 ml の 0.1 M ナトリウム cacodylate バッファーのペレットをすすいでください。10 分を持続させる各変更で 3 回を繰り返します。
- 4 ° C で 1 時間 2% オスミウム四酸化の 1 ml サンプルを修正後
- 固定を外し、すすぎ 3 回 0.1 M ナトリウム cacodylate バッファー 10 分毎。
- 傾斜アセトン シリーズで 10 分間インキュベート (50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%、それぞれ)、シェーカーで。
- アセトンを取り外して 30 分間 3:1 アセトン: 低粘度埋め込み混合溶液を孵化させなさい。エキソソーム ペレットは、チューブです。
- メディアを取り出して 1:1 アセトン: 低粘度埋め込み混合媒体を追加し、30 分間インキュベートします。
- メディアを取り出して 1:3 アセトン: 低粘度埋め込み混合媒体を追加し、30 分間インキュベートします。
- メディアを取り出して、100% 低粘度混合物を埋め込み、室温で一晩インキュベートを追加します。
- 純粋な低粘度 65 ° C で 24 h の埋め込み型と焼くを使用して混合物を埋め込むサンプルを埋め込む
- 超ミクロトームで 60 nm の厚さでセクションを準備します。
- 20 分間の 2% 酢酸ウラニウム二重染色と 10 分のクエン酸をリードします。
レイノルズ鉛ソリューション 1.33 g 鉛硝酸とクエン酸ナトリウムの 1.76 g を 50 ml の蒸留水の合計に追加します。 - 80 で透過型電子顕微鏡下でグリッドを観察 kV。
- 「取得」をクリックし、、クリックして「ファイル」と"Save as"80 で電子顕微鏡 CCD カメラ システムの kV。露光時間の自動設定に従います。
2. セクションおよびイメージング (図 1) の免疫染色
- 超ミクロトームを使用して 60 nm の超薄切片を切り、ニッケル グリッドを収集します。
- 50 μ L の滴無料アルデヒド グループをクエンチする 10 分の 0.02 M のグリシンのグリッドを孵化させなさい。
- リンス DW の 100 μ L で 3 回それぞれ 1 %bsa を含む PBS で 1 時間室温で 10 分間加温。
- 50-100 μ L 滴 KRS 抗体24 (0.1 %bsa を含む PBS で 1: 100) アンチのグリッド間インキュベート 1 時間に応じて、このステップべきである 4 ° C で一晩。
- 10 分の 0.1 %bsa を含む PBS の 5 別滴 (50 μ L) でグリッドを洗います。
- 2nd抗体 (抗うさぎ IgG が 0.1 %bsa を含む PBS で 10 nm の金粒子 (1: 100) に共役) 1 h の滴にグリッドを転送します。
- 5 洗浄グリッドは各 10 分 0.1 %bsa を含む PBS の滴 (50 μ L) を区切ります。
- ダブル-染色暗い条件の下で 20 分間酢酸 2% ウランとレイノルドの鉛クエン酸 10 分間それぞれ。
- 「取得」をクリックし、、"ファイル"と"Save as"CCD カメラ システム 80 で電子顕微鏡の下でをクリック kV。露出時間は続いた自動設定です。
図 1: サンプル調製と染色のプロセス。(A)二重固定エキソソームが脱水および混合樹脂を埋め込み低粘度で浸透します。(B)の樹脂を埋め込みます。(C)ダイヤモンド ナイフで超薄いセクション。(D)免疫金ラベルを設定します。超薄切片のグリッドは、湿らせたペーパー タオルに配置されますのパラフィルムで液滴に置かれます。各セクションは 50-100 μ L 抗体の液滴と孵化し、バッファーで洗浄します。(E)酢酸ウラニウム染色を二重になりクエン酸。蓋は、重金属染色用アルミ箔で覆われています。(F)は染色液はろ紙によって削除されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
3. 負の染色
- グロー放電グロー放電によって 1 分ホルムバール/炭素薄膜塗膜 200 メッシュ銅 EM グリッド。
- 2 %1 ml 精製エクソソームを修正パラホルムアルデヒド (PFA) 5 分。
注意: パラホルムアルデヒド煙、有毒です。すべての作業は、換気の発煙のフードで行われるべき。 - グリッド上の 5-7 μ L エキソソーム懸濁液ソリューションを読み込むし、1 分間インキュベートします。エキソソームの濃度が高すぎる場合は、1/2 - 1/5 の濃度を薄めます。
- すぐに注射器による EM グリッド面フィルター 1% ウラニル酢酸 (UA) ソリューション 〜 20 滴で染色します。
- ろ紙をグリッド エッジに連絡してグリッドに過剰な UA ソリューションを削除します。
- すぐに水を一滴を持つグリッドをすすいでください。このステップは、余分な染色液が削除されます。
- ピンセットでグリッドをテーブルに置くし、室温下で 10 分間乾燥する培養皿で部分的にグリッドをカバーします。
- 80 で TEM による未来の観察のための EM グリッド ボックスのグリッドを保存 kV。
4 是非、全体のマウント
- グロー放電ホルムバール/炭素薄膜フィルム コーティング 200 メッシュ銅 EM グリッド 30 s。
- 2 %1 ml 精製エクソソームを修正パラホルムアルデヒド (PFA) 5 分。
注意: パラホルムアルデヒド煙、有毒です。すべての作業は、換気の発煙のフードで行われるべき。 - エキソソーム ソリューションを固定グリッド上 5-7 μ L を読み込むし、インキュベート pbs 100 μ L に 5 分すすぎ 3 回各 10 分。
- 無料アルデヒド グループをクエンチする 10 分の 0.05 M のグリシンの 50 μ L でグリッドを扱います。
- 30 分のブロック バッファー (1 %bsa を含む PBS) のドロップにグリッドを転送します。
- 50-100 μ L 抗 PD L1 抗体 (0.1 %bsa を含む PBS で 1: 100) でグリッドを 1 時間に応じて、このステップべきである 4 ° C で一晩インキュベートします。
- 10 分の 0.1 %bsa を含む PBS の 5 別滴 (50 μ L) でグリッドを洗います。
- グリッドを 1 h の 2nd抗体のドロップに転送します。
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Representative Results
現在、エクソソームは透過電子顕微鏡によるサイズと形状のカテゴリに分類されます。図 2に示します負エキソソームと全体のマウント ・ ステータスに免疫標識エキソソームを染色します。図 3は、薄切片法後断面エキソソームと免疫標識エクソソームを示します。免疫金は特定の蛋白質の抗体を用いて染色は、積極的に、エキソソームを識別し、エキソソームのタンパク質の種類を分類する使用されます。本プロトコルは、プラスチックの断面エキソソームを全体のマウント免疫染色、免疫染色を使用します。
図 2: 負の染色と全体のマウント免疫染色します。(A)エキソソーム形態はネガティブ染色法で観察されます。エクソソームのカップの形をした形態を示しています。(B、 C)(抗ひと CD274; 特定の蛋白質の位置を示しています全くマウント免疫金染色PD-L1) エキソソームの。白い矢印は、金の位置を示します。黒い矢印は、背景信号の位置を示します。(D)負の免疫染色結果のコントロール。アイソタイプ コントロールは、この染色過程で一次抗体によって使用されました。スケールバー = 100 nm。
図 3: エクソソームの断面の電子顕微鏡写真です。(A)エクソソームの丸い形の形態。(B)箱入りエキソソーム エーモン川プログラムの「ボクサー」ツールを使用します。(C, D)免疫金標識重金属染色とエキソソーム。黒い矢印を示す金の粒子(A ~ D)スケール バー = 100 nm。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、詳細なエキソソームの構造を観察し、その特定の蛋白質の分類のためのプロトコルを示します。否定的な汚損はエキソソーム17をイメージングに最適な方法として考えられています。この手法は、エクソソームのカップ状の構造を示しています。しかし、このカップの形状は乾燥プロセスによって発生するアーチファクトのフォームです。低温電子顕微鏡 TEM 結果エクソソームが水溶液25,26で完全に球状構造を持っていることを示しています。クライオ電子顕微鏡法は、自然の構造を検査するための非常に強力な法免疫金法を適用することは困難です。デルラソと同僚 (全体マウント-ネガティブ染色法) の従来の方法で乾燥を指摘したカップ状の形態をもたらした。本研究では, セル準備 (ルーチン EM; 固定、脱水、埋め込み、および断面) の標準的な方法でエキソソームの乾燥の影響を減らすために適用されました。プラスチックを埋め込むを使用して EM を回避または変性による工芸品 (容積や形状の変更) を削減できるルーチン。化学固定法、グルタルアルデヒド (GA) (アミノ基の共有結合性相互作用) の架橋用使用しています。通常、四酸化オスミウム (OsO4) は、脂質だけでなく、改良されたコントラストの固定に使用されます。
本研究では否定的な汚損を手伝った前論文21,27,28,29で報告されているエクソソームの典型的な形態を確認するには否定的な汚損に加えブロック断面、エクソソーム (図 2) の観察のための良い方法です。一方, 切片画像エキソソームの内部構造を示し、対照的に負染色 TEM は主に、エキソソームの表面を示した。断面画像 (図 3)、小胞エクソソーム30の構造的特徴として知られている内腔構造を示した。このプロトコルでは、ブロック断面、免疫染色や電子顕微鏡イメージングを使用しました。特に、ブロックの断面はイメージが異なる倍率で要求されるかもしれないとき、後で解析、各種の顕微鏡技術および免疫金ラベルなど他の分析に適して。断面後、エクソソームの分類の免疫染色に使用することができますグリッド ボックスのグリッドのセクションを格納できます。たとえば、エクソソームの機能分離エクソソームの知られているエキソソーム マーカー14を検出しました。
免疫分類方法ラベルまたは分類の高いバック グラウンドを含むいくつかの技術的な問題があります。ラベリングを経験しないとき、は、一次抗体濃度と主なインキュベーション時間をチェックすることをお勧めします。一次抗体の低濃度の場合、抗体価が最適化された免疫反応性を探し出すに便利かもしれません。一晩に 4 ° C インキュベーション時間を増やすと効果があります。対照的に、一次抗体の濃度が高すぎる、または高温培養時間が長すぎる、バック グラウンド信号が増加されます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この研究は生物によって支えられた & 医療技術開発プログラム国立研究財団 (NRF) の & 韓国の政府によって資金を供給 (MSIP & MOHW) (第 2016M3A9B6904244)。私たちもエキソソームの浄化の薬用 Bioconvergence 研究センターのメンバーに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
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