Summary
Этот протокол описывает различные методы, необходимые для передачи электронной микроскопии включая негативные окрашивание, ультратонкий секционирование для подробной структуры и иммуно gold маркировки для определения позиции специфических белков в exosomes.
Abstract
Exosomes нано размера внеклеточного везикулы, выделяемый жидкости организма и известны представляют характеристики клеток, которые выделяют их. Содержание и морфология секретируемые везикулы отражают поведение клеток или физиологического статуса, например рост клеток, миграция, расщепление и смерти. Exosomes роль может сильно зависеть от размера, и размер exosomes варьируется от 30 до 300 Нм. Наиболее широко используемый метод для exosome изображений является отрицательным окрашивания, в то время как другие результаты основаны на крио-просвечивающей электронной микроскопии, сканирование электронной микроскопии и атомной силовой микроскопии. Типичный exosome морфология через негативные окрашивание является Кубок форму, но дальнейшие детали еще не ясно. Exosome, хорошо изученных через структурные исследования является особенно необходимым в медицинской и фармацевтической областях. Таким образом функция зависимых морфология должны быть проверены на методы электронной микроскопии, такие как маркировки определенных белков в детальной структуре exosome. Наблюдать за подробную структуру, были сопоставлены ультратонких секционного изображения и негативное витражные изображения exosomes. В этом протоколе мы предлагаем просвечивающей электронной микроскопии для изображений exosomes, включая негативные окрашивание, вся гора иммуно-окрашивание, блок подготовки, шлифов и иммуно золото маркировки.
Introduction
Внеклеточные везикулы (EVs) являются липидного бислоя везикулы выделяется клетками, и их размер колеблется от 30 до 300 Нм. EVs впервые сообщалось в 1978 году, с доказательствами из везикул больных болезнь Ходжкина1. Эти пузырьки были сообщается 40 до 120 нанометров размер. В 1980 году было сообщено, что EVs участвуют в свертывающей системы и тромбоз, формирование сгусток крови внутри сосудов в раковых больных2. После 30 лет чтобы быть важным фактором содействия прорастание опухоли, иммунных бежать и ангиогенез3поступили EVs. Кроме того функции EVs были изучены как регуляторов в клеточных взаимодействия в области воспаления, иммунных расстройств, неврологических заболеваний и рака4. EVs содержат конкретные биомолекул как белок, мРНК и микроРНК5, их потенциальное применение в диагностике и терапии пор анализируемого6,7. EVs – это категория, состоящий из подгрупп, включая exosomes, prostasomes, oncosomes, dexosomes, микрочастицы, promininosomes, argosomes и exosome как пузырьки, в зависимости от их клеточных происхождения и биологическая функция3. Кроме того основываясь на их биогенеза, эти EVs можно разделить микровезикулы (сарай микровезикулы, 100-1000 Нм) и exosomes (30-300 Нм)8,9. Среди них exosome было сообщено как мобильный коммуникатор иммунный ответ10, рака11,12и13инфекционных заболеваний.
Быстро растет интерес к exosomes в качестве биомаркеров для ранней диагностики и очистки и характеристика exosomes должен сопровождаться молекулярные методы визуализации. Различных размеров и морфологии exosomes, в зависимости от их происхождения и функции14, можно отличить по методам микроскопии с высоким разрешением, таких как электронной микроскопии. Большинство exosomes были визуализированное негативное витражные передачи электронной микроскопии (ТЕА)15,16,17, и эти результаты были подтверждены immunolabeling определенного белка в целом гора везикул 18. несколько исследовательских групп сообщили структуры через сканирование электронной микроскопии, атомной силовой микроскопии19,20и крио-ТЕА21,22. Однако хотя эти методы полезны для изучения структуры exosome, они являются недостаточными для наблюдения за позицию специфических белков, расположенный внутри exosome. Таким образом мы ввели протокол для изображений exosomes с протеином конкретных маркировки. Мы применили блок подготовки, ультратонкий секционирование и иммуноокрашивания для выяснения подробных расположение белка в exosome. Это было по сравнению с отрицательным окрашивание и вся гора иммуноокрашивания, который традиционно используется для описания exosome.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Блок подготовки, секционирование, окрашивание и изображений из Exosome
- Пелле exosomes от супернатант культуры клеток HCT116 центрифугированием на 100,000 x g для 1,5 h23. Удалить супернатант культуры и тщательно исправить очищенный exosome гранулы с 1 мл 2,5% глютаральдегид в 0,1 М раствор cacodylate натрия (рН 7,0) за 1 ч при 4 ° C. Для cacodylate натрия 0,1 М растворяют 4.28 г cacodylic кислоты в 160 мл дистиллированной воды (DW). Отрегулируйте пэ-аш до 7,4 с 0,1 М HCl затем сделать до 200 мл дистиллированной водой.
- Снимите фиксатор и промойте окатышей с 1 мл 0,1 М натрия cacodylate буфера при комнатной температуре. Повторите три раза с каждым изменением, 10 мин.
- После исправления образцы с 1 мл 2% осмия тетраоксид за 1 час при 4 ° C.
- Снимите фиксатор и полоскать три раза с cacodylate натрия 0,1 М буфера каждые 10 мин.
- Проинкубируйте втечение 10 мин с серией градуированных ацетон (50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%, соответственно) в шейкер.
- Удаление ацетон и инкубировать и решение 3:1 ацетон: низкая вязкость внедрения смеси за 30 мин. Exosome гранул находится в трубку.
- Удалите носитель и добавить 1:1 ацетон: низкой вязкости внедрения смесь, а затем Инкубируйте 30 мин.
- Удалите носитель и добавить 1:3 ацетон: низкая внедрения смесь вязкости, а затем Инкубируйте 30 мин.
- Удалите носитель и добавьте 100% низкая вязкость, встраивание смесь и инкубировать на ночь при комнатной температуре.
- Внедрить образца в чистом низкой вязкости, встраивание смесь с помощью внедрения формы и выпекать на 24 ч при температуре 65 ° C.
- Подготовка разделов толщиной 60 Нм через ультра микротома.
- Двухместный пятно с 2% ацетат уранила 20 мин и привести цитрат за 10 мин.
Для решения свинца Рейнольдс добавьте 1,33 g нитрата свинца и 1,76 г, натрия цитрата в общей сложности 50 мл дистиллированной воды. - Наблюдать за сетку под просвечивающей электронной микроскопии на 80 кв.
- Нажмите кнопку «Получить» и затем нажмите «Файл» и «Сохранить как» в CCD камеры системы под микроскопом на 80 кв. Следуйте автоматические настройки для времени экспозиции.
2. иммуно окрашивание секций и изображений (рис. 1)
- Вырезать 60 Нм ультратонких разделов с помощью ультра микротом и собирать на сетке никеля.
- Инкубируйте сетки в 50 мкл капли 0,02 М глицин на 10 минут, чтобы утолить свободной альдегидной группы.
- Промывайте в 100 мкл DW три раза каждый для 10 минут инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч в PBS, содержащей 1% BSA.
- Инкубировать сетки в 50-100 мкл капли анти KRS антитела24 (1: 100 в PBS, содержащие 0,1% BSA) за 1 ч (при необходимости, этот шаг должен осуществляться при температуре 4 ° C на ночь.)
- Мыть сетки с пяти отдельных капель (50 мкл) PBS, содержащие 0,1% BSA за 10 мин.
- Передавать сетки капли 2nd антитела для 1 h (анти кролик, которую IgG конъюгированных до 10 Нм золотые частицы (1: 100) в PBS, содержащие 0,1% BSA).
- Мойка сетки с пяти отдельных капель (50 мкл) PBS, содержащие 0,1% BSA каждый 10 мин.
- Двухместный пятно с 2% уранила ацетата 20 мин в условиях темноты и Рейнольдса в свинец цитрат за 10 мин, соответственно.
- Нажмите кнопку «Получить» и затем нажмите «Файл» и «Сохранить как» в CCD камеры системы под ТЕА на 80 кв. Время экспозиции за автоматические настройки.
Рисунок 1: процесс подготовки проб и иммуноокрашивания. (A) двойной фиксированной exosome обезвоженной и проникли с низкой вязкостью, встраивание смесь смолы. (B) смолы, встраивание. (C) ультра-тонкий секция с алмазным ножом. (D) установки для маркировки иммуно золото. Сетки с ультратонких секции ставятся на жидкие капельки на парафина, который находится с влажной салфеткой. Каждый раздел инкубировали с капельками 50-100 мкл антител, а затем промывают с буфером. (E) двойной окрашивание с уранила ацетат и привести цитрата. Крышка покрыта алюминиевой фольги для окрашивания хэви-метал. (F) пятная раствор удаляется фильтр-бумаги. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
3. негативные пятнать
- Тлеющего разряда тонкой formvar/углеродной пленки с покрытием 200 сетка медная ет сетки для 1 мин на свечение молниеотвода.
- Закрепите очищенный exosomes 1 мл 2% параформальдегида (PFA) за 5 мин.
Предупреждение: Параформальдегида газы являются токсичными. Все должно быть сделано в вентилируемых зонта. - Загрузить 5-7 мкл exosome подвеска решение на сетке и инкубировать в течение 1 мин. Если слишком высока концентрация exosome, ослабить концентрацию до 1/2 - 1/5.
- Сразу же пятно с ~ 20 капель раствора отфильтрованных 1% уранила ацетат (UA) на поверхности сетки EM шприца.
- Удалите избыток раствора UA на сетке, связавшись с краю сетки с фильтровальной бумаги.
- Быстро промойте сетку с капли воды. Этот шаг будет удалять Избыточное окрашивание раствора.
- Установите решетку на таблице путем проведения с помощью пинцета и охватывают Сетка частично с культуры блюдо для просушки на 10 мин при комнатной температуре.
- Хранить сетки в поле Сетка EM для будущего наблюдения по ТЕА на 80 кв.
4. весь кронштейн для иммуноокрашивания
- Тлеющий разряд тонкой formvar/углеродной пленки с покрытием 200 сетка медная ет сетки для 30 s.
- Закрепите очищенный exosomes 1 мл 2% параформальдегида (PFA) за 5 мин.
Предупреждение: Параформальдегида газы являются токсичными. Все должно быть сделано в вентилируемых зонта. - Загрузка 5-7 мкл фиксированной exosome решение на сетке и инкубировать на 5 мин полоскания с 100 мкл PBS три раза каждый за 10 мин.
- Лечить сетки с 50 мкл 0,05 М глицин на 10 минут, чтобы утолить свободной альдегидной группы.
- Передача сетки к падению блокировки буфера (PBS, содержащей 1% BSA) за 30 мин.
- Инкубируйте сетки с 50-100 мкл анти-PD-L1 антитела (1: 100 в PBS, содержащие 0,1% BSA) за 1 ч (в случае необходимости, этот шаг должен осуществляться при температуре 4 ° C на ночь).
- Мыть сетки с пяти отдельных капель (50 мкл) PBS, содержащие 0,1% BSA за 10 мин.
- Передавать сетки капли 2nd антитела для 1 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В настоящее время exosomes подразделяются на категории размер и форма просвечивающей электронной микроскопии. На рисунке 2 показано негативное витражные exosome и иммунной помечены exosome в целом гора статус. Рисунок 3 показывает секционного exosome и иммуно помечены exosomes после разрезания тонкой. Иммуно золото окрашивание с помощью антител специфических белков используется положительно определить exosome и классифицировать типы белков в exosome. Протокол в этой статье использует всю гору иммуноокрашивания и иммуноокрашивания с пластиковой секционного exosome.
Рисунок 2: отрицательные, окрашивание и вся гора иммуно-окрашивание. (A) морфология Exosome наблюдается при отрицательных пятнать. Exosomes показывает их Чашеобразная морфологии. (B, C) Вся гора иммуно-золото пятнать показывает расположение конкретных белка (анти человека CD274; PD-L1) в exosome. Белые стрелки указывают местоположение золота. Черные стрелки указывают местоположение фонового сигнала. (D) отрицательный контроль результата иммуноокрашивания. Isotype управления был использован основное антитело в этом процессе иммуноокрашивания. Шкалы бар = 100 Нм.
Рисунок 3: электронная микрофотография секционного exosomes. (A) Exosomes круглой формы морфология. (B) в штучной упаковке с помощью инструмента «боксер» в программе "Эман" exosome. (C, D) Иммуно золото помечены exosome с метал пятнать. Черные стрелки указывают золотые частицы (A-D) шкалы бар = 100 Нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта статья представляет протокол для наблюдения за подробный exosome структуры и маркировки своих специфических белков. Отрицательный пятнать рассматривается как лучший метод для exosome изображений17. Эта традиционная методика показал exosomes Кубок образной структуры. Однако эта форма Кубка является формой артефакт, который может возникнуть вследствие процесса сушки. Крио-ТЕА результаты показали, что exosomes имеют идеально сферическая структура в водный раствор25,26. Крио ТЕА техника является очень мощный метод для изучения естественной структуры, но трудно применить метод иммуно золото. Расо и коллег указал сушки в методе обычных (весь Маунт отрицательный окрашивания метода) привели к Чашеобразная морфологии. В этом исследовании, стандартный метод для подготовки клетки (обычные EM; фиксация, обезвоживание, внедрение и секционирование) был применен к сокращению exosome сушки эффект. Обычные EM, с использованием пластиковых вложения можно избежать или уменьшить артефакты (изменения в объем и форму), вызванные денатурации. Для химической фиксации глутаровый (GA) был использован для сшивки (ковалентного взаимодействия между группами аминокислот). Обычно осмия тетраоксид (OsO4) используется для фиксации липидов, а также улучшение контрастности.
В этом исследовании отрицательные пятнать помогли подтвердить типичной морфологии exosomes, который уже сообщалось в предыдущих документах21,27,28,29. Помимо негативных окрашивание, блок секционирование также является хорошим методом для наблюдения за exosomes (рис. 2). Хотя секционного изображения показали внутреннюю структуру exosome, в отличие от негативное витражные ТЕА показал главным образом на поверхности exosome. В секционного изображения (рис. 3) везикулы показал люмен структура, которая известна как структурная особенность exosomes30. В этом протоколе мы использовали блок секционирование, иммуно окрашивание и изображений ТЕА. Специально секционирование блок является полезным для анализа на более позднее время, когда изображения может потребоваться при различных увеличениях, технику различных микроскопии и другие анализы, например иммуно золото маркировки. После разрезания, разделы на сетке могут храниться в поле Сетка, которая может быть использована для иммуно окрашивание для классификации exosomes. Например мы обнаружили известных exosome маркеры14 в изолированных exosomes для изучения функции exosomes.
Immunogold обозначая методы имеют некоторые технические трудности, включая без маркировки или высокий фон маркировки. При возникновении не маркировки, мы рекомендуем проверять основное антитело концентрации и первичный инкубации раз. В случае низкой концентрации первичных антител титрование антител может быть полезно, чтобы найти оптимизированный иммунореактивности. Она также может быть полезно увеличить время инкубации до 4 ° C на ночь. Напротив если концентрация основного антитела является слишком высокой или слишком длинное время инкубации при высокой температуре, фонового сигнала будет увеличено.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано био & медицинской технологии развития программы Национальный исследовательский фонд (NRF) & финансируется корейским правительством (MSIP & MOHW) (№ 2016M3A9B6904244). Мы также благодарим членов лекарственные Bioconvergence научно-исследовательского центра для очистки exosome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glutaraldehyde | EMS | 16200 | |
| Sodium cacodylate | EMS | 12300 | |
| Osmium tetroxide 1 g crystal | EMS | 19100 | Use only in fume hood |
| acetone | JUNSEI | 1B2031 | |
| Spurr medium | TED PELLA | 18108 | |
| Ultra-microtome | Leica | UCT | |
| Uranyl acetate | EMS | 22400 | Hazardous chemical |
| Lead citrate | EMS | 17900 | |
| Transmission Electron Microscopy | Hitachi | H7600 | |
| nickel grid | EMS | G200-Ni | |
| Copper grid | EMS | G200-Cu | |
| glycine | SIGMA | 022K5404 | |
| Phosphate buffer saline | SIGMA | P4417 | |
| Bovine serum albumin | Aurion | 25557 | |
| 1st Antibody | purification in manually | ||
| Purified anti-human CD274 (B7-H1, PD-L1) Antibody | BioLegend | 329710 | Whole mount Immumogold |
| Purified Mouse IgG2b, κ Isotype Ctrl | BioLegend | 401202 | Whole mount Immumogold (Control) |
| 2nd Anti-mouse igG conjugated 9-11 nm gold particle | sigma | G7652 | |
| Transmission Electron Microscopy | JEOL | JEM2200FS | |
| Glow discharger | JEOL | JFC1100E | |
| Carbon grid | EMS | 121119 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19210 | |
| Formvar carbon coated Copper Grid (200 meh) | EMS | FCF200-CU | |
| Formvar carbon coated Nickel Grid (200 mesh) | EMS | FCF200-NI |
References
- Friend, C., et al. Observations on cell lines derived from a patient with Hodgkin's disease. Cancer Res. 38 (8), 2581-2591 (1978).
- Dvorak, H. F., et al. Tumor shedding and coagulation. Science. 212 (4497), 923-924 (1981).
- Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers. Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68 (16), 2667-2688 (2011).
- Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacol Ther. , (2017).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Villarroya-Beltri, C., Baixauli, F., Gutierrez-Vazquez, C., Sanchez-Madrid, F., Mittelbrunn, M. Sorting it out: regulation of exosome loading. Semin Cancer Biol. 28, 3-13 (2014).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Camussi, G., Deregibus, M. C., Bruno, S., Cantaluppi, V., Biancone, L. Exosomes/microvesicles as a mechanism of cell-to-cell communication. Kidney Int. 78 (9), 838-848 (2010).
- Zaharie, F., et al. Exosome-Carried microRNA-375 Inhibits Cell Progression and Dissemination via Bcl-2 Blocking in Colon Cancer. J Gastrointestin Liver Dis. 24 (4), 435-443 (2015).
- Fuhrmann, G., Neuer, A. L., Herrmann, I. K. Extracellular vesicles - a promising avenue for the detection and treatment of infectious diseases? Eur J Pharm Biopharm. , (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Liu, X., Wang, H. W. Single particle electron microscopy reconstruction of the exosome complex using the random conical tilt method. J Vis Exp. (49), (2011).
- Wang, J., Yao, Y., Wu, J., Li, G. Identification and analysis of exosomes secreted from macrophages extracted by different methods. Int J Clin Exp Pathol. 8 (6), 6135-6142 (2015).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).
- Mazzeo, C., et al. Exosome secretion by eosinophils: A possible role in asthma pathogenesis. J Allergy Clin Immunol. 135 (6), 1603-1613 (2015).
- Sokolova, V., et al. Characterisation of exosomes derived from human cells by nanoparticle tracking analysis and scanning electron microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 87 (1), 146-150 (2011).
- Sharma, S., et al. Structural-mechanical characterization of nanoparticle exosomes in human saliva, using correlative AFM, FESEM, and force spectroscopy. ACS Nano. 4 (4), 1921-1926 (2010).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Bosch, S., et al. Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage. Sci Rep. 6, 36162 (2016).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Kim, S. B., et al. Caspase-8 controls the secretion of inflammatory lysyl-tRNA synthetase in exosomes from cancer cells. J Cell Biol. , (2017).
- Conde-Vancells, J., et al. Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes. J Proteome Res. 7 (12), 5157-5166 (2008).
- Kadiu, I., Narayanasamy, P., Dash, P. K., Zhang, W., Gendelman, H. E. Biochemical and biologic characterization of exosomes and microvesicles as facilitators of HIV-1 infection in macrophages. J Immunol. 189 (2), 744-754 (2012).
- Gong, J., Korner, R., Gaitanos, L., Klein, R. Exosomes mediate cell contact-independent ephrin-Eph signaling during axon guidance. J Cell Biol. 214 (1), 35-44 (2016).
- Melo, S. A., et al. Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer. Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- van Niel, G., Heyman, M. The epithelial cell cytoskeleton and intracellular trafficking. II. Intestinal epithelial cell exosomes: perspectives on their structure and function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 (2), G251-G255 (2002).
