Summary
Este estudio evalúa la resistencia a la fractura del hueso cortical bovino a nivel sub-meso mediante pruebas microscópicas de cero. Se trata de un original, objetivo, riguroso, y reproducible método propuesto para probar la resistencia a la fractura debajo de la escala macroscópica. Aplicaciones potenciales están estudiando cambios en la fragilidad del hueso debido a enfermedades como la osteoporosis.
Abstract
El hueso es un material complejo jerárquico con cinco niveles distintos de organización. Factores como el envejecimiento y las enfermedades como la osteoporosis aumentan la fragilidad del hueso, lo que es propensa a la fractura. Debido al gran impacto socio-económico de la fractura de hueso en nuestra sociedad, hay una necesidad de nuevas formas evaluar el desempeño mecánico de cada nivel jerárquico del hueso. Rigidez y la fuerza pueden ser sondeados en todas las escalas – nano - micro-, meso-, y macroscópico – evaluación de fractura ha hasta ahora se han limitado a pruebas macroscópicas. Esta limitación restringe nuestro entendimiento de la fractura de hueso y restringe el ámbito de laboratorio y estudios clínicos. En este estudio, investigamos la resistencia de la fractura del hueso de las microscópicas a las escalas de longitud mesoscópica usando las pruebas de scratch micro combinadas con la mecánica de fractura no lineal. Las pruebas se realizan en la orientación longitudinal corto en muestras de hueso cortical bovino. Se desarrolla un minucioso protocolo experimental y un número grande (102) de las pruebas se llevan a cabo para evaluar la resistencia a la fractura de las muestras de hueso cortical mientras que representa la heterogeneidad asociada a microestructura del hueso.
Introduction
En este estudio, medimos la resistencia a la fractura de hueso compacto bovino de la mesoescala (osteons) a microescala (nivel laminar) utilizando una nueva técnica de rayado micro1,2,3,4, 5. Procesos de fractura incluyendo iniciación y crack propagación de grieta en el hueso son directamente influenciados por escalas de la longitud debido a los diferentes componentes estructurales y organización en los diferentes niveles de jerarquía. Por lo tanto, evaluar la fractura de hueso en escalas más pequeñas de la longitud es esencial al rendimiento una comprensión fundamental de la fragilidad del hueso. Por un lado, compacto de pruebas convencionales como tres puntos de flexión, tensión y flexión las pruebas se realizan comúnmente en bovino fémur y la tibia para la caracterización de la fractura en la escala macroscópica6,7, 8. por otro lado, para medir la resistencia a la fractura en la escala microscópica, fractura de indentación de Vicker fue propuesta9. Micro sangría se realizó con penetrador de Vicker para generar grietas radiales. Además, el método de dureza de fractura de nanoindentación de Oliver Pharr se realizó mediante un fuerte cubo esquina penetrador10.
En los estudios mencionados de nanoindentación en fractura dureza, se midieron las longitudes de las grietas así generadas por el observador y se utilizó un modelo semi-empírico para calcular la resistencia a la fractura. Sin embargo, estos métodos son irreproducible, subjetiva y los resultados dependen mucho de la habilidad del observador debido a la necesidad de medir la longitud de grieta utilizando microscopia óptica o microscopia electrónica. Además, se realizaron pruebas de cero en la escala de nano, pero el modelo matemático subyacente no está basado en la física ya que no tiene en cuenta la reducción en la fuerza debido a grietas y defectos11. Por lo tanto, existe una brecha de conocimiento: un método para la evaluación de la fractura a nivel microscópico basado en un modelo mecanicista basado en la física. Esta brecha de conocimiento motivó la aplicación de micro arañazos pruebas para compactar hueso centrándose primero en especímenes porcinos5. El estudio ahora se ha extendido aún más entender hueso cortical bovino.
Dos orientaciones diferentes de las muestras son posibles: longitudinal transversal y corta longitudinal. Transversal longitudinal corresponde a propiedades perpendiculares al eje longitudinal del fémur la fractura. Mientras, corta longitudinal corresponde a las propiedades de fractura a lo largo del eje longitudinal del fémur5. En este estudio, aplicamos pruebas scratch bovino huesos corticales para caracterizar la resistencia de la fractura del hueso en la dirección longitudinal corto.
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Protocol
Nota: El protocolo descrito aquí, sigue las pautas de cuidado de los animales de la Comisión de uso y cuidado Animal institucional de Illinois.
1. muestra adquisiciones
- Recoger fémur bovinos recién cosechados de un Estados Unidos Departamento de agricultura USDA certificado matadero y transportan en bolsas de plástico herméticas en una hielera.
Nota: Para el estudio realizado aquí, fémur se obtuvieron de animales que fueron 24-30 meses edad, Morillas y pesados unos 1.000 - 1.100 libras. - Congele el fémur en –20 ° C hasta el inicio del procedimiento de preparación de muestras. Esta temperatura mantiene el fémur fresco12,13,14.
2. corte, limpieza, incrustación y las muestras
- Descongelar los congelados fémures en un recipiente con agua por aproximadamente 2 horas a temperatura ambiente.
- Cortar varios discos de unos 10-15 mm de espesor de la región de la diáfisis media usando una sierra de banda de mesa diamante superior para producir a ejemplares con uniforme de la superficie transversal del hueso cortical.
- Utilice un kit de disección para quitar cualquier tejido suave o la carne unido a la cortical ósea.
- Las secciones transversales de los fémures obtenidas en el paso 2.2 usando una hoja de diamond wafering a una baja velocidad de sierra bajo condiciones húmedas a lo largo del eje longitudinal del hueso para obtener múltiples secciones más o menos cuboidales.
Nota: Aquí, sólo preparación de la muestra y cero pruebas realizadas en el corto – muestras longitudinales se discuten. Sin embargo, excepto para la dirección del corte, el procedimiento de preparación es el mismo para la orientación transversal. - Limpie a los especímenes en una solución preparada con 1.5% aniónico limpiador y lejía 5% para una duración de 20 minutos en un limpiador ultrasónico.
-
Incrustar las muestras de hueso cortical en resina acrílica (adjunto Polimetil metacrilato (PMMA)) para facilitar la maniobrabilidad y estabilidad.
- Para incrustar a las muestras, primero una capa las paredes del molde con un agente de liberación. Luego mezclar la resina y el endurecedor en un vaso, según las instrucciones dadas por el fabricante PMMA.
- Una de las muestras de hueso cortical corte poner en cada molde con la superficie a rayar hacia abajo. Vierta la mezcla de resina acrílica en estos preparados los titulares de la muestra. Deje que las muestras de la curación para una duración de hasta 4-5 h.
- Cortar los especímenes incrustados en discos de espesor 5 mm, exponer la superficie a ser rayada, con la baja velocidad VI y montar las muestras en discos de metal (aluminio) de diámetro 34 mm y altura 5 mm con adhesivo de cianoacrilato.
- Envolver los ejemplares en un calibre empapado en Hanks equilibrada solución salina (HBSS) y refrigerar a 4 ° C hasta más de15,de uso16.
3. pulido y protocolos
Nota: Un requisito previo a las pruebas de alta precisión a escalas pequeñas de longitud es una superficie lisa y nivelada de las muestras. Anteriores protocolos de pulido13,17 resultan en una gran rugosidad de la superficie, conduce a considerable imprecisión en la medida. El reto está en lograr la baja rugosidad de superficie promedio, menos de 100 nm, sobre una superficie de área grande 3 x 8 mm2 .
- Moler a las muestras de hueso cortical bovino a temperatura ambiente usando grano 400 y 600 artículos de carburo de silicio grano por 1 min y 5 min, respectivamente. Mantener la amoladora pulidora a una velocidad base de 100 rpm y 150 rpm, respectivamente.
- Máquina de moler las muestras de hueso cortical bovino a temperatura ambiente en los papeles de grano 800 y 1.200 para una duración de 15 minutos para cada paso. Mantener la amoladora pulidora a una velocidad base de 150 rpm, cabeza velocidad de 60 rpm y de funcionamiento de 1 lb.
- Polaco los especímenes utilizando 3 μm, 1 μm y 0,25 μm diamante suspensión soluciones en el mismo orden en un duro, perforado, tela no tejida para una duración de 90 min a temperatura ambiente. Mantener la carga de operación de cada paso en 1 lb con velocidades de base y la cabeza de la pulidora en 300 rpm y 60 rpm, respectivamente.
- Pulir a la muestra con solución de suspensión de alúmina 0,05 μm en un paño suave, sintéticas rayón para una duración de 90 min en 1 lb con base y la cabeza de 100 rpm y 60 rpm, respectivamente, también a temperatura ambiente.
- Poner a las muestras en un vaso de precipitados con agua desionizada y puso el vaso en un baño ultrasónico durante 2 min entre cada paso consecutivo de esmerilado y pulido para limpiar los residuos y evitar la contaminación cruzada.
- Ver las características de superficies mediante microscopía óptica y proyección de imagen de SEM.
Nota: Como se muestra en la figura 1, osteons, conductos de Havers, líneas de cemento, las regiones intersticiales y lagunas fueron observados en las muestras de hueso cortical bovino. Estos métodos imagenológicos revelan la naturaleza porosa, heterogénea y anisotrópica de las muestras de hueso cortical. Además, prueba avanzada de la superficie de las muestras fue realizado para evaluar la calidad de la superficie pulida. Una representante de la superficie pulida se muestra en la figura 2.
4. micro arañazos prueba
Nota: Micro arañazos pruebas se realizan en las muestras de hueso cortical bovino pulido con un comprobador de memoria micro (figura 3). Un diamante penetrador Rockwell con un radio de punta de 200 μm y vértice el ángulo de 120° se utiliza para el estudio. El instrumento permite la aplicación de una carga progresiva lineal hasta 30 N. Además, el instrumento está equipado con sensores de alta precisión para medir la carga horizontal, la profundidad de penetración y emisiones acústicas generadas debido al rascado. El instrumento puede capturar los panoramas de surcos del rasguños.
- Antes de la prueba de las muestras de hueso cortical, calibrar la punta del penetrador Rockwell con policarbonato como material de referencia3.
- Coloque a la muestra de hueso cortical en el escenario y elija el sitio de la prueba de scratch con el microscopio óptico creado integrado al módulo probador micro de la memoria.
- Aplicar una carga progresiva lineal con una carga inicial de 30 mN y final de la carga de 30 N. La velocidad de carga debe ajustarse a 60 N/min y la longitud de cero a 3 mm.
- Realizar series de pruebas de scratch en el longitudinal corto (figura 3b) muestras de hueso cortical bovino como se ilustra en la figura 3.
- Humedezca la superficie del espécimen con HBSS después de una serie de cada tres o cuatro cero pruebas para mantenerlos hidratados.
- Analizar los datos de prueba cero basados en mecánica de fractura no lineal, modelado2.
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Representative Results
Microscopía de fuerza atómica fue utilizado para medir la rugosidad de la superficie pulida. Como regla general, la muestra califica como un bien pulido si la rugosidad es un orden de magnitud más pequeño que las características superficiales de interés. En este caso, la aspereza superficial medida de 60 nm en una superficie de μm 40 μm x 40 cae claramente dentro de este criterio.
La figura 4 muestra la fuerza versus penetración gráficos de profundidad de las pruebas de scratch representante realizados sobre las muestras de hueso cortical bovino longitudinal corto. Mientras que la fuerza vertical es la carga incremental prescrita, la fuerza horizontal es la resistencia de la sonda. La figura 5 muestra las imágenes de microscopía electrónica barrido de la superficie del hueso cortical bovino longitudinal corto fracturada. Esta imagen muestra el cincelado y descamación de la superficie y la ocurrencia de mecanismos intrínsecos de endurecimiento como micro grietas, desviación de crack y crack puente. Los datos de prueba cero micro es analizados mediante secuencias de comandos de MATLAB basados en mecánica de fractura no lineal, modelado2. Antes de la ocurrencia del proceso de fractura, sería la disipación plástica18. A medida que aumenta la profundidad de penetración, se activan procesos de fractura.
Basado en la observación microscópica, consideramos una sola grieta propagar tal como se muestra en la figura 3b. Construimos una fractura no lineal mecánica modelo1,2 para predecir la escala de la fuerza cero. Una microestructura isótropa transversal homogénea se considera para el hueso cortical a nivel de tejido. La figura 6 muestra la escala de la fuerza de la resistencia a la fractura de las muestras de hueso cortical longitudinal corto. Una transición de dúctil a frágil se introduce mediante la variación de la profundidad de penetración. En el régimen frágil y basada en la fractura, la fuerza cero 
es proporcional a la cantidad de 
, donde 
es la sonda forma función1,2,3,4, 5. Por lo tanto, la resistencia a la fractura, 
1,2,3,4,5 converge hacia una constante. Además, un valor de Kc que corresponde a una fractura frágil se divulga sobre la fuerza de escala parcela para una sola prueba, como se muestra en la figura 6. se realizaron 102 pruebas micro de cero en las muestras de hueso cortical bovino longitudinal corto como se muestra en la figura 7. Pruebas de valores atípicos corresponden a los especímenes que fueron probados después de una semana de preparación y almacenamiento de información en la solución salina. Almacenamiento de la muestra para una duración muy larga altera la superficie debido a la formación de precipitado de la solución salina hacia valores de tenacidad de fractura diferentes. El valor de dureza de fractura total obtenido es 4.05±0.63 MPa
. La literatura informó valores de tenacidad de fractura en el rango de 2.5 a 5.5 MPa6,8. Estos resultados muestran que los valores de dureza de fractura de las pruebas de scratch micro están de acuerdo con la literatura.
Figura 1: un gráfico que muestra los diferentes niveles jerárquicos de las muestras de hueso y las investigaciones experimentales realizadas en cada nivel. El eje horizontal corresponde a la escala de longitud que van desde la macroescala a nanoescala y el eje vertical corresponde a la escala de tiempo en el que se llevan a cabo los experimentos correspondientes a cada nivel. (Crédito de la imagen: Kavya Mendu). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: fotografías Digital de discos de aluminio (a) utilizados como base para las muestras y los muestra (B) bien pulido hueso longitudinal corto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Micro scratch test. Fotografía digital de la prueba de scratch micro sobre las muestras de hueso cortical bovino (A). Una sonda de Rockwell con un ángulo de vértice de 120o la muestra de hueso cortical de sondeo incrustado en metacrilato de Polymethyl. (B) esquema de una sonda de cero labranza el material óseo que muestra la llegada de un modo mixto de fractura en una muestra longitudinal corto. (Créditos: Ange-Thérèse Akono, Amrita Kataruka y Kavya Mendu). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: surco cero. Imagen de microscopía óptica del panorama de la ranura de memoria (A). (B) parcela de correspondiente de la fuerza versus profundidad a lo largo de la longitud de la ranura del rasguño. Fuerza horizontal corresponde a la fuerza friccional resistiva detectada por los sensores conectados a la etapa de micro probador de rasguño y la fuerza vertical corresponde a la fuerza lineal progresiva, aplicada sobre la muestra de hueso cortical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Análisis de imágenes de microscopía electrónica (SEM). Imágenes de SEM del scratch groove mostrando micro mecanismos tales como desviación de crack, crack puente, puente de fibra y saltar a niveles diferentes aumentos (A) 40 X (B) 10.000 X c 2.400 X d 5, 000 X. Capturado usando el microscopio electrónico de barrido de bajo vacío en el laboratorio de ciencia de materiales de Frederick Seitz y Beckman Institute, Universidad de Illinois en Urbana Champaign. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Scratch fuerza y micro imagen cero. (A) escala de la fuerza de cero a lo largo de la longitud de cero muestra la convergencia de la resistencia a la fractura. es la fuerza horizontal y es la función de forma de punta de prueba que depende de la profundidad de penetración y geometría. (B) imagen de microscopía óptica panorámica de un micro arañazos en hueso bovino en la dirección longitudinal corto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: tenacidad a la fractura. Diagrama que muestra la fractura valores de dureza de las pruebas de scratch micro 102 llevó a cabo en las muestras de hueso cortical bovino longitudinal corto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Micro pruebas scratch inducir una fractura de modo mixto3. Además, en las muestras de hueso cortical bovino longitudinal corto, se activan procesos de fractura como la sonda excava más profundo. Para un arañazo largo 3 mm, el volumen prismático sondeado es alrededor de 3.600 μm de largo, ancho 600 μm y μm 480 profundo. Este gran volumen ayudó a predecir una respuesta homogeneizada. Un modelo de mecánica de fractura no lineal nos permitió extraer la resistencia de la fractura basada en el J-cálculo integral1,2,4.
Muestras de hueso cortical bovino proporcionan un área más grande para las pruebas en comparación con los especímenes porcinos que fueron utilizados para la publicación anterior5. Sin embargo, hay una diferencia correspondiente en el tamaño de las características de la microestructura de porcino a las muestras de hueso cortical bovino. Esto condujo al desarrollo de un nuevo protocolo de pulido para los ejemplares bovinos. Además, durante el desarrollo del método, se observó que las muestras de hueso cortical bovino preparado deben analizarse dentro de una semana después de la preparación. Esto es para evitar la formación de residuos en las muestras bovinas debido a la solución salina, que podría afectar drásticamente los resultados de la prueba.
Además, los ensayos realizados en las muestras de hueso cortical bovino longitudinal corto tenían condiciones ambientales controladas y estandarizadas protocolos de preparación de muestras. Esto condujo a una reducción en la variabilidad de los resultados de la prueba del 23% previamente divulgados por hueso cortical porcino longitudinal corto muestras5 a 15% para las muestras de hueso cortical bovino longitudinal corto en este estudio. Sin embargo, en la figura 7, resultados de pruebas de valores atípicos pueden atribuirse a varias razones como la duración del almacenamiento en agua salina o la ubicación del cero sí mismo. Sin embargo, dado que el hueso es heterogéneo en el meso - y escalas microscópicas de la longitud, se espera una cierta cantidad de variabilidad.
Microscopía electrónica de barrido muestra la incidencia de los procesos de fractura durante estas pruebas de scratch. Mecanismos de endurecimiento como micro grietas en la meso escala, deflexión de grietas y puentes en la microescala y puentes de fibra en la escala sub-micron de grietas fueron observados (ver figura 5). Esto está de acuerdo con los mecanismos de endurecimiento registrados anteriormente en la literatura19. Así, micro arañazos pruebas determinan las propiedades de fractura de las muestras de hueso cortical bovino desde la meso escala a escala micro.
El método que proponemos aquí requiere un pequeño número de muestras y permite la prueba de los especímenes en escalas más pequeñas de la longitud. Por ejemplo, transición dúctil a frágil se introduce en la escala macroscópica, trabajando con ejemplares de diferentes tamaños teniendo una proporción constante. Según la técnica de evaluación de fractura del efecto de tamaño, por lo menos 5 muestras de tamaño diferentes se requieren estimar una fractura dureza valor20,21. Así, para estimar 102 fractura dureza valores, necesita pruebas alrededor de 510 muestras macroscópicas que implica mucho tiempo y recursos. Así, este método que se propone estima la resistencia a la fractura a un ritmo más rápido y es más económico. Además, entender las características de la fractura en diferentes niveles jerárquicos nos permite comprender la mecánica del hueso más eficientemente. Además, prueba es eficiente y reproducible y fácilmente puede llevarse a cabo bajo una amplia gama de controles ambientales. Por ejemplo, prueba las muestras sumergidas en una solución salina en una cámara ambiental pueden llevarse a cabo para simular condiciones en vitro . Además, también se aplicará el método para probar la resistencia a la fractura del hueso en la dirección longitudinal transversal para capturar la anisotropía en el hueso. Así, nuestro método es una novela para la evaluación de la fractura de los tejidos biológicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Civil e ingeniería ambiental y la Facultad de ingeniería en Universidad de Illinois en Urbana Champaign. Reconocemos la Ravindra Kinra y Kavita Kinra beca para apoyar los estudios de posgrado de Kavya Mendu. Investigación de microscopia electrónica de barrido se realizó en las instalaciones del laboratorio de investigación de Material de Frederick Seitz e Instituto Beckman de la Universidad de Illinois en Urbana Champaign.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table Top Diamond Band Saw | McMaster Carr, Elmhurst, IL | Model C-40 | Blade speed of 40 mph; Blade dimensions: 37 inch in diameter, 0.02 inch wide and 0.14 inch deep |
| Buehler Isomet 5000 Precision Cutter | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 112780 | Blade speed in the range of 200-5000 rpm in 50 rpm incrments; 8 inch diamond wafering blade |
| Branson 5800 Ultrasonic Cleanser | (Through) Grainger, Peoria, Illinois | 39J365 | Bransonic CPXH ultrasonic bath has a tank capacity of 2.5 gal |
| Buehler Ecomet 250 Grinder - Polisher | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 497250 | 8 inch base plate with a speed range from 10-500 rpm |
| Anton Paar, CSM Instruments Micro scratch tester | Anton Paar Switzerland AG | 163251 | Compact Platform, Acoutstic Emission Sensor |
| JEOL 6060LV general purpose scanning electron microscope | JEOL USA, Inc., Peabody, MA | Environmental scanning electron microscope which enables imaging at low vacuum levels. | |
| Philips XL30 ESEM FEG | FEI Company | Wet mode working of the instrument enables imaging of non conductive samples without altering them | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables | |||
| Bovine Femur | L&M Slaughter house, Georgetown, IL | Corn fed, 24-30 month old mature bovine specimens. | |
| Alconox Powdered Precision Cleaner | Alconox, Inc., 30 Glenn St., Ste. 309, White Plains, NY, 10603 | 1104-1 | Biodegradable, Non caustic, Interfering-residue free |
| Acrylic Plastic Casting | Electron Microscopy Sciences | 24210-02 | Polymethyl Methacrylate |
| CarbiMet SiC Abrasive Paper 400 grit, 8 inch, PSA backed | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 36080400 | Grinding - Abrasive Papers |
| CarbiMet SiC Abrasive Paper 600 grit, 8 inch, PSA backed | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 36080600 | Grinding - Abrasive Papers |
| MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 36080800 | Grinding - Abrasive Papers |
| MicroCut Discs 800 grit, 8 inch, PSA backed | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 16081200 | Grinding - Abrasive Papers |
| Texmet P For 8'' Wheel PSA | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 407638 | Polishing Cloth |
| 8'' Microcloth PSA | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 407518 | Polishing Cloth |
| Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 3 µm | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 406631 | Polishing suspension |
| Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 1 µm | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 406630 | Polishing suspension |
| Meta Di Supreme Polycrystalline Diamond Suspension, 0.25 µm | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 406629 | Polishing suspension |
| MasterPrep Polishing Suspension, 0.05µm | Buehler,41 Waukegan Rd, Lake Bluff, IL 60044 | 40-6377-032 | Polishing suspension |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14025126 | Buffer Solution |
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