Summary
이 원고는 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청 또는 플라스마 DNA에서 복사 번호 유사 분석을 설명 합니다. 이 방법은 거세 저항 전립선 암 환자에서 약물 저항의 예측에 적합 하지만 그것은 또한 다른 질병에 대 한 정보 수 있습니다.
Abstract
혈 청 및 혈장 세포 무료 DNA (cfDNA)은 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항의 예측에 대 한 생체의 유익한 정보, 비-침략 적 원본으로 표시 되었습니다. 전이성 거세 저항 전립선 암 (mCRPC)에서 자주 이벤트는 안 드로 겐 수용 체 (AR) 유전자 사본 번호 (CN) 얻을 가설에서 출발, 잠재적인 예측 biomarker로 cfDNA에서이 이벤트를 분석을 제안 한다.
우리가 2 다른 실시간 PCR 분석 실험 및 2 참조 유전자 (RNaseP 및 전1)를 사용 하 여 cfDNA에 아칸소 CN 평가. DNA 양의 60 ng 각 분석 결과 조합에 대해 사용 되었다. AR CN 이득 디지털 PCR를 사용 하 여 보다 정확한 방법으로 확인 됐다. CN 변형 분석 이미 치료 저항 mCRPC의 설정에서의 예측을 위한 유익 입증 되었습니다 하지만 그것은 도움이 될 수 있습니다 또한 다른 환자의 설정에서 다른 목적을 위해. CfDNA에 CN 분석에는 여러 이점이 있다: 그것은 비 침략 적, 신속 하 고 쉽게 수행 하 고 혈 청 또는 플라스마 소재의 작은 볼륨에서 시작.
Introduction
순환 하는 혈액에서 세포 무료 DNA (cfDNA) 암 진단, 예 후, 모니터링 및 치료 저항1,2의 예측에 대 한 생체의 최적의 원본 증명 되었습니다. 많은 연구 DNA 변경 (돌연변이, 복사 번호 유사 조직에 epigenetic 수정)와 해당 플라즈마 샘플1, 순환 종양 DNA (ctDNA)는 확인 그 사이 좋은 색인 기본 및 전이성 종양 조직 변경3에 대 한 유익한. CtDNA의 가능성은 따라서 게놈 재배열 및 특정 oncogenes4, 잠재적으로 전이성 클론와 subclonal 셀 식별에 복사 번호 유사 (CNVs)의 재건에 대 한 수 있습니다. CtDNA 임상 암 치료 모니터링으로 특정 돌연변이 관련 특정 표적으로 한 치료5,6, CNVs 항구에 특히 유용한 것으로 표시 되었습니다. 그것은 또한 조직 생 검에 대 한 필요를 극복 하 고 결과 비-침략 적 방식으로 특정 암 치료 기간 동안 서로 다른 시간에 얻을 수 있습니다.
전립선 암, 순환 셀 무료 안 드로 겐 사이의 중요 한 상관 관계에 관해서는 수용 체 (아칸소) CNVs 및 치료 응답 abiraterone와 enzalutamide로 표시 되었습니다, 나타내는 AR 유전자 복사 번호 (CN) cfDNA에 있을 수 있습니다는 치료 저항7,,89,10,11예측 가능한 유망 바이오 마커. CtDNA에 특정 유전자의 CNVs 다른 감도, 비용 및 속도으로 다른 접근을 사용 하 여 평가할 수 있다 (예. 실시간, 디지털 PCR, 및 다음 세대 시퀀싱).
여기는 실시간 PCR 기술, 혈 청 및 혈장 샘플7,8cfDNA에 아칸소 CN을 평가 하기 위한 이중 분석에 따라 간단 하 고 빠른 방법에 설명 합니다. 전립선 암 (RNaseP, 일반 복사 번호 상태에 있는 것으로 알려져 내부 표준 기준 유전자로 intron 5 아칸소 (Xq12)의 다른 두 유전자 내에서 두 개의 다른 게놈 지역에 설계 된 두 개의 다른 PCR 분석 실험을 고려 14q11;에 전1, 1에 위치한 p 34). 우리는 정밀도 결과의 감도 증가 한 실행 하는 것이 아니라 두 기준 유전자 선택. 60의 DNA 양을 ng 각 분석 결과 조합 (결합 된 분석 결과 대 한 아칸소-assay_1 + RNaseP와 아칸소-assay_2+ AGO1)에 대 한 증폭 되었다. 건강 한 남성에서 3 개의 혈 청 또는 플라스마 DNA 샘플 풀링 되었고는 교정기로 사용. 우리 고려의 차단 > 아칸소 이득에 대 한 1.5와 < 삭제 0.5. 이 방법의 주요 장점 중 하나입니다 그것은 유연 하 고는 다른 유전자 또한 평가 될 수 있다, 변화 하는 표준 내부 기준 유전자 종양 유형 및 특성에 근거 하 여.
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Protocol
복사 번호 분석을 위한 실시간 PCR을 수행 하기 위해 혈 청 또는 혈장 샘플에서 DNA의 격리 프로토콜에 의하여 이루어져 있다. DNA 추출, DNA 수량 제어 (분 광 광도 계)와 특정 대상에 대 한 실시간 PCR 수행 했다. 그림 1, 절차 및 타임 라인의 요약 보고 합니다.
프로토콜은 IRST 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다.
1. 혈 청 수집 및 처리
- 약 5 mL의 전 혈 혈 청을 얻기 위해 응고 제 없이 혈 청 튜브에 수집 합니다. 처리까지 4 ° C에서 혈액 튜브를 유지 합니다.
- 4 ° c.에 15 분 동안 1000 x g에서 원심 분리기 튜브
- 조심 스럽게 2 mL 튜브에 혈 청을 전송 합니다.
- 수집 관을 무시 하 고 즉시-80 ° C에서 상쾌한 사용까지 동결.
2. 플라즈마 수집 및 처리
- 플라즈마를 EDTA와 플라즈마 튜브에서 약 10 mL 전 혈을 수집 합니다. 튜브를 완전히 작성 하 고 8 시간 그것을 반전. 처리까지 4 ° C에서 혈액 튜브를 유지 합니다.
- 튜브는 원심 분리기에 없는 브레이크 설정 실 온에서 15 분 동안 1800 x g에서 원심
- 조심 스럽게 2 mL 튜브에는 플라즈마의 위쪽 부분을 전송 합니다. 화이트 셀 레이어 위에 상쾌한의 적어도 1 mL을 떠나는 전송을 반복 합니다.
참고: 셀 또는 셀 파편 오염 위험 감소는 상쾌한의 위쪽 부분을 전송. - 수집 관을 무시 하 고 즉시-80 ° C에서 상쾌한 사용까지 동결.
3. DNA 분리 혈 청 또는 혈장에서
주: 혈 청 또는 플라스마에서 DNA의 분리 수행 되어야 한다 상업 프로토콜 다음 단계에서 수정을 사용 하 여.
- (0.5에서 2 mL에 포함 되는) 하는 한 약 수 혈 청 또는 플라스마 실 온에서 녹여
- 소용돌이 샘플을 혼합 하 고 명확한 1.5 mL 튜브에 혈 청 또는 혈장 0.5 mL를 전송. -80 ° c.에 재료의 나머지를 고정
- 샘플에 직접 가수분해 k (20 mg/mL)의 50 µ L를 추가 합니다.
- 샘플에 0.5 mL의 세포의 용 해 버퍼를 추가 하 고 pipetting으로 잘 혼합.
- 튜브를 닫고 열 블록에 15 분 동안 56 ° C에서 샘플을 품 어.
- 제조업체의 지침에 표시 된 대로 표시 된 양의 100% 에탄올 워시 버퍼 1과 2에 추가 합니다.
- 실내 온도에 다시 샘플을 가져올 하 고 절대 에탄올의 0.5 mL을 추가 pipetting으로 잘 혼합.
- 3.7 분리 및 6000 x g에서 원심 분리기는 1 분 동안에 단계에서 얻은 혼합물의 650 µ L를 추가 합니다.
- 통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브에 열을 놓습니다. 3.8 및 3.9 단계 한 번 더 반복 합니다.
- 습윤 열과 1 분 동안 6000 x g에서 원심 분리기의 테두리 없이 워시 버퍼 1, 500 µ L를 추가 합니다.
- 통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브로 교체.
- 습윤 십 분 (20000 x g) 최고 속도로 원심 분리기의 테두리 없이 워시 버퍼 2, 500 µ L를 추가 합니다.
- 통해 흐름을 포함 하는 튜브를 삭제 하 고 새로운 깨끗 한 컬렉션 튜브로 교체.
- 최고 속도로 (20000 x g) 어떤 잔여 세척 버퍼를 제거 하려면 3 분 원심.
- 장소는 깨끗 한 1.5 mL 튜브에 열. 차입 버퍼의 150 µ L을 추가 하 고 해당 버퍼 늦으면 열 수 있도록 7 분을 기다립니다.
- 1 분 동안 8000 x g에서 원심.
- DNA의 최대 복구를 보장 하기 위해 1 분 동안 다시 같은 열과 (20000 x g) 최고 속도로 원심 분리기에 단계의 3.16 elute 플라스틱
4. DNA 정량화 및 희석
- 분 광 광도 계를 사용 하 여 DNA의 정량화를 수행 합니다. 샘플의 2 µ L를 사용 하 여 제조 업체의 지시 당 벤치 정상 분 광 광도 계에.
참고: 경우 DNA 수량 실시간 PCR를 계속 충분 하지 않습니다 (적어도 120 ng), 새로운 DNA 분리 과정을 수행. - 마지막 볼륨 (약 50 µ L) 모든 실시간 PCR를 위한 충분 한 2.5 ng / µ L를 혈 청 또는 플라스마에서 DNA를 희석.
5. 실시간 PCR
- Thaw 복사 번호 분석 실험, 참조 유전자 분석 결과, 희석 DNA 샘플 및 교정기 얼음에 풀링된. 실 온에서 4 ° c.에 저장 된 마스터 믹스 equilibrate
- 각 샘플의 풀링된 교정기 3 복제에 대 한 대상 분석 결과의 참조 유전자 분석 결과, 1 µ L, 믹스 마스터의 10 µ L의 1 µ L의 혼합을 준비 합니다. 혼합 부정적인 제어 (물) 및 2 추가 샘플을 준비 합니다.
- 96 잘 접시, 각 우물에 혼합의 aliquot 12 µ L에서. 피 펫 또는 스핀 튜브 하지 않습니다.
- 각 DNA 샘플의 각 음에 풀링된 교정기 8 µ L (2.5 ng / µ L의 농도)를 추가 합니다. 피 펫 또는 스핀 튜브 하지 않습니다. 각 잘에 대 한 팁을 변경 합니다.
참고: 30 DNA 샘플 96 잘 접시를 사용 하 여 각 실시간 실험에 대 한 처리 수: 30 x 3 샘플 + 1 x 3 교정기 풀링된 + 부정 제어 = 94. - 짧게 1000 x g에서 접시를 회전 합니다.
- 다음 프로토콜을 사용 하 여 접시를 실행: 15 95 ° C에서 40 주기를 10 분 동안 95 ° C에 단계 개최 s, 그리고 1 분 동안 60 ° C.
6. 데이터 분석 및 해석
- 증폭 플롯 결과 아래에 "옵션" 섹션에서 첫 번째 대상 유전자 분석에 대 한 0.2에서 Ct 임계값을 설정 합니다. 각 대상 또는 참조 유전자에 대 한 집합을 반복 합니다. .Txt 확장명에 실시간 PCR 파일을 내보내려면, 도구 모음에 "내보내기"를 누릅니다. 플래그 "결과"만 선택 → 내보낼 데이터 선택 파일 형식으로는 확장명.txt → 언론 "수출 시작" → 가까이 내보내기 도구.
- 분석 소프트웨어를 열고 가져올 파일.txt (도구 모음 → 가져오기).
- 분석 하 고 도구 모음 (재생 기호)에 의해 분석 설정을 선택 파일 이름을 선택 합니다.
- 보정 샘플 및 대상 ( AR 유전자에 대 한 복사예를 들어, 1)의 사본의 알려진된 수를 지정 합니다. 보도 자료 "적용 됩니다."
- 각 샘플에 대 한 다른 우물에 비해 다른 델타 Ct (ΔCt) 한 음을 생략 합니다.
- 실험 (언론 플레이 기호) 분석
- 바 작 또는 테이블 복사본 수로 결과 평가 합니다.
참고: 결과 테이블 자신감, Z-점수, 및 결과 해석에 대 한 도움이 될 수 있는 분석 복제 같은 여러 매개 변수를 포함 합니다.
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Representative Results
총 cfDNA 농도 모든 샘플 분석, 6.12 ng / µ L의 중간값을 보여주는 분 광 광도 법으로 정량 (범위: 2.00-23.71 ng / µ L) 혈 청 샘플 및 3.21 ng / µ L의 중간값 (범위: 2.31-8.49 ng / µ L) 플라즈마 샘플. 우리는 실시간 PCR 실험에 의해 총 115 샘플의 분석.
테스트 감도 복사 번호 분석에 대 한 보정 샘플으로도 사용 되는 건강 한 기증자 로부터 아칸소, 그리고 DNA에 대 한 높은 또는 낮은 이득이 환자에서 혈 청 혼합된 DNA를 사용 하 여 평가 했다. 그림 2에 표시, 아칸소 CN은 충분히 아칸소 이득 건강 한 기증자 DNA 유전자 이득 감지 (그림 2)를 혼합 환자 들에서 DNA의 0.375%에서 발견. 따라서,이 방법은 복사 번호 이득의 매우 낮은 금액을 감지. 각 환자에 대 한 CN 분석 실험에서 ΔCt의 표준 편차 계산 (평균 ± SD = 0.1, 범위: 0.00-0.36). 우리는 복사 번호 이득 구분 선택에 대 한 표준 편차 값 들의 중간값을 사용 합니다.
Abiraterone로 치료 하는 환자에서 의 복사 수 분석 (n = 53), 아칸소 이득7전시 16 (30.2%) 환자를 찾는. 마찬가지로, 우리 AR 유전자 enzalutamide와 치료 환자에 대 한 복사 번호 유사 분석 (n = 59), 21 (36%)의 환자8 아칸소 이득을 찾는.
또한, 우리 AR CN 및 카 플 란-마이어 메서드를 사용 하 여 임상 결과 사이 협회를 평가 하 고 로그-순위 테스트 중요 한 협회를 발견. 특히, abiraterone 사건 환자 치료 AR 유전자 이득 얻은 비의 경우 9.5 개월 대 2.8의 중간 진행 성 자유로운 생존 (PFS)을 보였다 (p < 0.0001). 더 낮은 전반적인 생존 (OS) 또한 아칸소 CN 이득 환자에서 보고 되었다 (p < 0.0001).
마찬가지로, enzalutamide 케이스 시리즈, 우리 발견 평균 2.4 개월 4.0 대의 PFS 아칸소 이득 이득으로 환자와 환자에 대 한 (p = 0.0004). 또한, AR CN 이득 환자의 중간 운영 체제는 그 이득 없이 14.1 개월 대 6.1 (p = 0.0003). 실시간 PCR 방법에서 얻은 모든 아칸소 CN 이득 결과 디지털 PCR (그림 3)를 포함 하 여 다른 방법을 사용 하 여 확인 되었다.
그림 1입니다. 워크플로 및 타임 라인. 방법은 워크플로의 다른 단계 및 시간으로 나누어져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. AR CN 검색 2 가지 풀 (샘플 1과 샘플 2) DNA의 건강 한 기증자와 CRPC 환자, AR 유전자에 대 한 얻은 사용 하 여 테스트에 대 한 접근 감도 다른 농도에서 혼합. 환자 DNA 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50, 및 100, 총 DNA에의 비율에 혼합 했다. 레드 라인: 아칸소 CN 이득 (1.5)에 대 한 차단. 이 그림 Salvi 외 에서 수정 되었습니다. 7
그림 3. AR CN 실시간 PCR (정량)과 여러 환자 (x 축)에 대 한 디지털 PCR (dPCR) 사이 결과 비교. 블랙 라인: 아칸소 CN 이득 (1.5)에 대 한 차단. 이 그림 Salvi 외 에서 수정 되었습니다. 7
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Discussion
AR 혈 청 및 혈장 샘플에서 CN 분석 거세 저항 전립선 암 (CRPC) 환자의 계층에 대 한 새로운, 비-침략 적 접근 방식을 나타냅니다. 그것은 최근 증명 되었습니다 아칸소 CN CRPC 환자 화학 요법7,8,,910전후 abiraterone와 enzalutamide, 치료 결과 예측 수 있다.
우리의 접근 방법의 주요 장점은 DNA 분리 과정, 한 실시간 PCR 분석 및 쉬운 데이터 해석의 구성 된 프로토콜을 수행 하기 위해 매우 간단한는입니다. 또한, 테스트 수 있습니다 신속 하 게 수행된에 1 작업 일, 그리고 절차는 비싼 (각 샘플에 대 한 $20 USD 약). 우리는이 방법은 높은 재현성을 맞춰 디지털 PCR7,8을 포함 하 여 더 비싼 하 고 정확한 방법에서 얻은 결과 증명 하고있다. 또한, 우리는 유사한 AR 플라즈마 샘플 abiraterone9,10치료에 타겟 NGS 접근 감지 하는 주파수를 얻을 발견. 또 다른 중요 한 장점은이 이렇게 유연 AR 유전자는 중요 한 역할을가지고 있는 다른 질병에 적용 될 수 있는 것입니다. 또한, 다른 대상 및 기준 유전자 선택의 질병에 따라 수 있습니다.
혈 청에서 AR 유전자의 CN 분석은 또한 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, DNA spectrophotometric 정량화 방법 자주 정확 하지 않습니다 하 고 다른, 더 정확한 fluorometric 방식으로 대체 될 수 있었다. 더 정확한 정량화는 더 정확한 CN 결과 줄 수 있습니다. 둘째, 일부 연구 그것 세럼 DNA 대신 플라즈마 DNA를 분석 하는 더 나은 것을 제안 했다. 플라즈마12,13, 혈 청, 혈 청은 잠재적으로 종양 특정 DNA 분석에 대 한 더 소스 제안에 백혈구 세포의 응고 때문에 보다 혈 청 셀 무료 DNA을 순환의 양을 일반적으로 높다. 때문에 야생-타입 DNA의 가능한 존재.
Enzalutamide 또는 abiraterone로 치료를 시작 하기 전에 실시간 PCR 방법을 사용 하 여 혈 청에서 AR 유전자의 CN 분석 112 CRPC 환자에 수행 되었습니다. 우리의 데이터 보여주었다 cfDNA에 아칸소 CN 임상 결과 abiraterone와 enzalutamide의 강력한 유전자 바이오 마커 이며 선험적 안티-아칸소 치료에서 유익할 수 있습니다 사람을 식별 하는 데 사용 수 또는 신속 하 고 저렴 한 비용 PCR 분석 결과 사용 하 여 화학 요법. 이러한 연구 결과 모두 초기 및 고급 CRPC에 치료 저항 메커니즘을 질문에 대 한 최소한 침략 적 방법으로 혈액의 유틸리티를 강조 표시 합니다. 미래에, 예비 및 큰 연구 임상 결과 후속 차이 치료 응답에 비추어 아칸소 상태를 순환 하 여 환자를 충 한다.
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Disclosures
저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.
Acknowledgments
우리 데이터 분석에서 지원에 대 한 키 아 라 Molinari와 필리포 Martignano 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
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