Summary
Ce manuscrit décrit l’analyse de variation numéro de copie exécutée dans l’ADN de sérum ou de plasma à l’aide de la méthode PCR en temps réel. Cette méthode convient pour la prédiction de la pharmacorésistance chez des patients de cancer de la prostate résistant à la castration, mais ça pourrait être instructif aussi pour d’autres maladies.
Abstract
Sérum et plasma cellulaire ADN gratuit (cfDNA) a été établi comme une source informative et non invasif de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer, pronostic, surveillance et prévision de résistance au traitement. À partir de l’hypothèse que le nombre de copies de gènes androgène récepteurs (AR) (CN) gain est un événement fréquent de cancer de la prostate métastatique castration résistance (CRPC), nous proposons d’analyser cet événement dans cfDNA comme biomarqueurs prédictifs potentiels.
Nous avons évalué AR CN en cfDNA à l’aide de 2 différents tests de PCR en temps réel et de 2 gènes de référence (RNaseP et il Y A1). Quantité d’ADN de 60 ng a été utilisée pour chaque combinaison de dosage. AR Gain CN a été confirmée par PCR numérique comme une méthode plus précise. Analyse de la variation de CN a déjà été démontré d’être informatif pour la prédiction de la résistance au traitement dans le cadre de la CRPC, mais il pourrait être utile également à d’autres fins dans des milieux différents patients. Analyse CN sur cfDNA présente plusieurs avantages : il est non invasif, rapide et facile à exécuter, et il commence à partir d’un petit volume de matière de sérum ou de plasma.
Introduction
Cellulaire gratuit ADN (cfDNA) dans le sang en circulation a été démontrée pour être une source optimale de biomarqueurs pour le diagnostic du cancer, pronostic, surveillance et prévision de traitement resistance1,2. De nombreuses études ont montré une bonne concordance entre les altérations de l’ADN (mutations, exemplaire numéros variations, modifications épigénétiques dans les tissus) et ceux que l'on trouve dans le plasma échantillons correspondant1, confirmant que l’ADN de tumeur (ADNct) en circulation est instructif pour les tumeurs primaires et métastatiques tissu altérations3. La possibilité d’étudier ADNct permet ainsi à la reconstruction des réarrangements génomiques et variations de numéro (CNV) copie spécifique oncogènes4, identifier les cellules potentiellement métastatiques clonales et subclonal. ADNct s’est avéré être cliniquement utile surtout pour le suivi des traitements du cancer car il abrite des mutations spécifiques et CNV, associés à des thérapies ciblées spécifiques5,6. Il surmonte la nécessité pour les biopsies tissulaires et permet des résultats pouvant être obtenus à des moments différents au cours d’un traitement de cancer spécifique de façon non invasive.
En ce qui concerne le cancer de la prostate, une corrélation significative entre la circulation acellulaire androgène CNVs récepteur (AR) et traitement réponse à abiratérone et enzalutamide il a été établi, indiquant nombre copies gène AR (CN) en cfDNA peut être un biomarqueur prometteur capable de prévoir le traitement résistance7,8,9,10,11. CNV de gènes spécifiques dans ADNct peut être évaluée à l’aide de différentes approches avec sensibilité différente, coût et rapidité (e.g. PCR en temps réel, numérique et Next Generation Sequencing).
Nous décrivons ici une approche simple et rapide, basée sur les analyses de duplex dans la technologie PCR en temps réel, pour l’évaluation de CN AR en cfDNA du sérum et du plasma échantillons7,8. Nous avons examiné deux différentes épreuves PCR conçus sur deux différentes régions génomiques dans l’intron 5 d' AR (Xq12) et deux autres gènes, comme des gènes de référence standard interne connus pour avoir un statut de numéro de copie normale dans le cancer de la prostate (RNaseP, Situé sur la 14q11 ; Il Y A1, situé sur 1 p 34). Nous avons sélectionné des gènes de référence deux, plutôt qu’un, pour augmenter la précision et la sensibilité des résultats. Une quantité d’ADN de 60 ng a été amplifié pour chaque combinaison de test (test combiné pour AR-assay_1 + RNaseP et AR-assay_2+ ans1). Trois échantillons d’ADN sérum ou le plasma des hommes en bonne santé ont été mis en commun et utilisés comme un étalon. Nous avons examiné les seuils de > 1,5 pour le gain de l’AR et < 0,5 pour la suppression. L’un des principaux avantages de cette méthode est qu’elle est souple et que des autres gènes peuvent aussi être évalués, changer les gènes de référence interne, sur la base du type de tumeur et caractéristiques.
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Protocol
Le protocole consiste en l’isolement de l’ADN d’échantillons de sérum ou de plasma pour effectuer la PCR en temps réel pour l’analyse nombre de copie. Extraction d’ADN, contrôle de quantité d’ADN (spectrophotomètre) et la PCR en temps réel pour des objectifs spécifiques ont été réalisés. Dans la Figure 1, un résumé des procédures et des délais sont signalés.
Le protocole suit les directives de l’IRST Human Research Ethics Committee.
1. traitement et collecte de sérum
- Recueillir environ 5 mL de sang total dans un tube de sérum sans anticoagulant pour obtenir sérum. Maintenir les tubes de sang à 4 ° C jusqu’au traitement.
- Tubes à centrifuger à 1 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
- Transvaser avec soin sérum dans tubes de 2 mL.
- Jeter le tube collecteur et congeler immédiatement le surnageant à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
2. traitement et collecte de plasma
- Recueillir environ 10 mL de sang total dans un tube à plasma EDTA pour obtenir le plasma. Remplir le tube et puis inverser 8 fois. Maintenir les tubes de sang à 4 ° C jusqu’au traitement.
- Centrifuger le tube à 1 800 g pendant 15 min à température ambiante avec aucun réglage du frein sur la centrifugeuse.
- Transvaser avec soin la partie supérieure du plasma dans des tubes de 2 mL. Répétez le transfert, en laissant au moins 1 mL du surnageant au-dessus de la couche leucocytaire.
NOTE : Transfert de la partie supérieure du liquide surnageant réduit le risque de contamination par des cellules ou des débris cellulaires. - Jeter le tube collecteur et congeler immédiatement le surnageant à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
3. isolement du sérum ou du Plasma
NOTE : Isolement de l’ADN du sérum ou du plasma doit être effectuée en utilisant le protocole commercial modifié dans les étapes suivantes.
- Décongeler une aliquote (contenant de 0,5 à 2 mL) de sérum ou de plasma à la température ambiante.
- Vortex et mélanger l’échantillon et transférer 0,5 mL de sérum ou de plasma dans un tube transparent de 1,5 mL. Congeler le reste du matériel à-80 ° C.
- Ajouter 50 µL de protéinase k (20 mg/mL) directement dans l’échantillon.
- Ajouter 0,5 mL de tampon de lyse à l’échantillon et mélanger bien en pipettant également.
- Fermer les tubes et les incuber les échantillons à 56 ° C pendant 15 min dans le bloc chauffant.
- Ajouter la quantité d’éthanol 100 % indiquée au tampon de lavage 1 et 2, comme indiqué par le fabricant.
- Ramener les échantillons à la température ambiante et ajouter 0,5 mL d’éthanol absolu et mélanger bien en pipettant également.
- Ajouter 650 µL du mélange obtenu à l’étape de 3,7 à la colonne de séparation et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.
- Jeter le tube contenant le débit à travers et placer la colonne sur un nouveau tube de prélèvement propre. Répétez les étapes 3.8 et 3.9 une fois de plus.
- Ajouter 500 µL de tampon de lavage 1, sans mouiller le rebord de la colonne et centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min.
- Jeter le tube contenant le débit à travers et remplacez-le avec un nouveau tube de prélèvement propre.
- Ajouter 500 µL de tampon de lavage 2, sans mouiller le rebord de la colonne et centrifuger à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 3 min.
- Jeter le tube contenant le débit à travers et remplacez-le avec un nouveau tube de prélèvement propre.
- Centrifuger à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 3 min enlever n’importe quel tampon de lavage résiduelle.
- Placer la colonne dans un tube propre 1,5 mL. Ajouter 150 µL de tampon d’élution et attendre 7 min afin d’assurer que cette mémoire tampon mouille la colonne.
- Centrifuger à 8 000 x g pendant 1 min.
- Pipetter l’élution de l’étape 3.16 encore une fois dans la même colonne et centrifuger à pleine vitesse (20 000 x g) pendant 1 minute afin de garantir une récupération maximale de l’ADN.
4. dilution et Quantification de l’ADN
- Effectuer la quantification de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre. Utiliser 2 µL de l’échantillon sur un spectrophotomètre de table selon les instructions du fabricant.
Remarque : Si la quantité d’ADN ne suffit pas de procéder à la PCR en temps réel (au moins 120 ng), effectuer un nouveau processus d’isolement de l’ADN. - Diluer l’ADN du sérum ou du plasma à 2,5 ng/µL dans un volume suffisant pour tous les Real-time PCR (environ 50 µL).
5. Real-time PCR
- Dégel copie numéros tests, test de gène de référence, des échantillons d’ADN dilué et calibrateurs regroupés au sein de la glace. Équilibrer à température ambiante le mélange maître qui est stocké à 4 ° C.
- Préparer un mélange de 1 µL de dosage cible 1 µL de test de gène de référence et 10 µL du mélange maître pour 3 répétitions de chaque échantillon et calibrateurs mis en commun. Préparer le mélange, y compris un contrôle négatif (eau) et 2 échantillons supplémentaires.
- Dans une plaque 96 puits, aliquote 12 µL du mélange dans chaque puits. Ne pas les tubes pipette ou spin.
- Ajouter 8 µL (concentration de 2,5 ng/µL) de chaque échantillon d’ADN et les calibrateurs mis en commun dans chaque puits. Ne pas les tubes pipette ou spin. Changer le cône pour chaque puits.
Remarque : 30 échantillons d’ADN peuvent être traitées pour chaque expérience en temps réel à l’aide de la plaque à 96 puits : 30 x 3 échantillons + contrôle de mise en commun + négatif calibrateurs de 1 x 3 = 94. - Tourner brièvement vers le bas de la plaque à 1 000 x g.
- Exécutez la plaque en utilisant le protocole suivant : tenir la scène à 95 ° C pendant 10 min, 40 cycles à 95 ° C pendant 15 s et 60 ° C pendant 1 min.
6. interprétation et analyse des données
- Dans la section « option », sous les résultats de terrain amplification, définissez le seuil de Ct à 0,2 pour le premier gène cible analysé. Répétez l’ensemble pour les gènes de chaque cible ou de référence. Pour exporter le fichier PCR en temps réel dans l’extension .txt, appuyez sur « Exporter » dans la barre d’outils. Drapeau que les « résultats » dans la sélection des données à exporter → choisissent comme type de fichier l’extension .txt → presse « démarrer l’exportation » → fermer l’outil d’exportation.
- Ouvrez le logiciel d’analyse et importez le fichier .txt (importation → barre d’outils).
- Sélectionnez le nom du fichier à analyser et sélectionner le paramètre d’analyse de la barre d’outils (symbole de jeu).
- Spécifier l’échantillon étalon et le nombre d’exemplaires de la cible (par exemple, 1 exemplaire pour le gène AR ) connu. Appuyez sur « appliquer ».
- Pour chaque échantillon, omettre un puits avec différent delta Ct (ΔCt) en comparaison avec d’autres puits.
- Effectuez une nouvelle analyse de l’expérience (press play symbole).
- Évaluer les résultats par le nombre de copies bar parcelle ou de la table.
NOTE : Le tableau de résultats contient de nombreux paramètres comme la confiance, de Z-score et répétitions analysées qui pourraient être utiles pour l’interprétation des résultats.
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Representative Results
Total cfDNA concentration était quantifiable par spectrophotométrie pour tous les échantillons analysés, apparaître une médiane de 6,12 ng/µL (gamme : 2.00-23,71 ng/µL) pour les échantillons de sérum et une médiane de 3,21 ng/µL (gamme : 2.31-8,49 ng/µL) pour les échantillons de plasma. Nous avons analysé un total de 115 échantillons par des expériences PCR en temps réel.
La sensibilité du test a été évaluée à l’aide de sérum mixte ADN provenant de patients avec gain élevé ou faible pour ARet ADN provenant de donneurs sains, qui sont également utilisées comme échantillons de calibrateur pour analyse nombre de copie. Comme représenté dans la Figure 2, AR CN est suffisamment détecté à 0,375 % de l’ADN de patients avec AR gain mélangé avec donneur sain ADN afin d’obtenir un gain génétique décelable (Figure 2). Ainsi, cette approche a détecté une très faible quantité de gain numéro de copie. L’écart-type de ΔCt dans les essais CN pour chaque patient ont été calculés (moyenne ± écart-type = 0,1, gamme : 0.00 - 0,36). Nous avons utilisé une valeur médiane de l’écart-type des valeurs de choisir copie numéro gain de coupure.
Nous avons analysé le nombre de copies d’AR chez les patients traités avec l’abiratérone (n = 53), trouver 16 (30,2 %) patients présentait AR gain7. De même, nous avons analysé la variation numéro de copie pour le gène AR chez les patients traités avec enzalutamide (n = 59), pour trouver des AR gain à 21 (36 %) des patients8.
En outre, nous avons évalué l’association entre le CN de l’AR et les résultats cliniques à l’aide de la méthode de Kaplan-Meier et log-rank test et trouvé une association significative. En particulier, abiratérone une série de dossiers patients traités avec un gain de gène AR ont montré une survie sans progression médiane (PFS) de 2.8 vs 9,5 mois de cas non acquise (p < 0,0001). Une plus faible survie globale (OS) a également été signalée chez les patients avec un gain CN AR (p < 0,0001).
De même, pour enzalutamide une série de dossiers, nous avons trouvé une médiane PFS de 2,4 par rapport à 4,0 mois souffrant de gain AR vs patients avec aucun gain (p = 0,0004). En outre, médiane des patients atteints de gain AR CN était de 6,1 contre 14,1 mois pour ceux sans gain (p = 0,0003). Tous les résultats de gain AR CN, obtenus à partir de la méthode PCR en temps réel ont été confirmés par d’autres méthodes, y compris numérique PCR (Figure 3).
Figure 1. Flux de travail et de la chronologie. Le workflow de la méthode est divisé en temps et les différentes étapes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Approche de sensibilité pour la détection de AR CN testée à l’aide de 2 pools distincts (échantillon 1 et 2) de l’ADN provenant de donneurs sains et de patients de fonciers, acquises pour le gène AR , mélangés à différentes concentrations. ADN de patients ont été mélangés à des pourcentages de 0,375, 0,75, 1,5, 3, 6, 12, 25, 50 et 100, en ce qui concerne l’ADN total. Ligne rouge : coupure pour gain AR CN (1,5). Ce chiffre a été modifié par Salvi et al. 7
Figure 3. AR Comparaison de résultats CN entre PCR en temps réel (qPCR) et ACP numérique (dPCR) pour plusieurs patients (axe x). Noir ligne : coupure pour gain AR CN (1,5). Ce chiffre a été modifié par Salvi et al. 7
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Discussion
AR Analyse de la CN dans l’échantillon de sérum et le plasma représente une nouvelle approche non invasive pour la stratification des patients atteints de cancer de la prostate résistant à la castration (fonciers). Il a été démontré récemment que le CN AR est capable de prédire les résultats chez les malades fonciers avec abiratérone et enzalutamide, avant et après chimiothérapie7,8,9,10.
Le principal avantage de notre approche est que le protocole est très simple à réaliser, consistant en seulement un processus d’isolement de l’ADN, une analyse PCR en temps réel et interprétations de données facile. En outre, le test pourrait être rapidement effectués en 1 jour ouvrable, et la procédure est peu coûteuse ($20 USD pour chaque échantillon, environ). Nous avons démontré que cette méthode est très reproductible et les résultats obtenus sont conformes à celles venant de méthodes plus coûteux et plus précis, y compris numérique PCR7,8. En outre, nous avons trouvé un semblable AR gain fréquence détecté avec des approches NGS ciblées sur des échantillons de plasma traités avec abiratérone9,10. Un autre avantage important est que cette approche est souple et pourrait s’applique à d’autres maladies dans lesquelles le gène AR a un rôle important. En outre, autres gènes cibles et référence pouvaient choisir basé sur la maladie d’intérêt.
L’analyse du gène AR dans le sérum CN a également quelques limitations. Tout d’abord, la méthode de dosage spectrophotométrique de l’ADN est souvent imprécise et pourrait être remplacée par d’autres, approches fluorimétrique plus précis. Une quantification plus précise pourrait donner des résultats plus précis de CN. Deuxièmement, certaines études ont suggéré qu’il pourrait être préférable d’analyser plasma ADN au lieu du sérum ADN. La quantité de circulation cellulaire gratuit ADN est généralement plus élevée dans le sérum que dans plasma12,13, en raison de la coagulation, de globules blancs dans le sérum, ce qui suggère que le sérum est potentiellement une source de pire pour l’analyse d’ADN spécifique en raison de la présence éventuelle de l’ADN de type sauvage.
CN analyse du gène AR dans le sérum à l’aide de méthodes PCR en temps réel a été réalisée sur 112 patients fonciers avant qu’ils commencent le traitement avec enzalutamide ou abiratérone. Nos résultats montrent que le CN AR sur cfDNA est un puissant biomarqueur génétique des résultats cliniques et résistance à l’abiratérone et enzalutamide et peut être utilisé pour identifier les hommes qui pourraient bénéficier à priori deAR thérapies anti - ou chimiothérapie à l’aide d’une PCR rapide et peu coûteuse. Ces résultats mettent en évidence l’utilité de l’étude de sang comme une méthode mini-invasive pour interroger les mécanismes de résistance thérapeutique dans fonciers précoce et avancé. À l’avenir, études prospectives et plus grandes devraient répartir les patients en faisant circuler des AR État vu les différences suivantes dans les résultats cliniques et la réponse au traitement.
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Disclosures
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Nous remercions Chiara Molinari et Filippo Martignano de soutien en analyse de données.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
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