Summary
כתב יד זה מתאר את עותק מספר וריאציה ניתוח שבוצעה ב- DNA סרום או פלסמה, באמצעות גישה PCR בזמן אמת. שיטה זו מתאימה נבואתו של עמידות לתרופות בחולי סרטן הערמונית עמיד סירוס, אבל זה יכול להיות אינפורמטיבי גם למחלות אחרות.
Abstract
סרום ותא פלזמה DNA חופשי (cfDNA) הוכח כמקור אינפורמטיבי, לא פולשנית של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של עמידות לטיפול. החל מההיפותזה אנדרוגן קולטן (AR) ג'ין עותק מספר (CN) לזכות הינו אירוע תכופים סירוס גרורתי עמידות סרטן הערמונית (mCRPC), אנו מציעים לנתח אירוע זה ב- cfDNA כמו סמן ניבוי פוטנציאליים.
אנחנו הערכה CN AR ב- cfDNA באמצעות 2 מבחני ה-PCR שונים בזמן אמת ו- 2 גנים התייחסות (RNaseP לפני1). כמות ה-DNA של 60 ng שימש עבור כל שילוב וזמינותו. AR CN רווח אושר באמצעות PCR דיגיטלית כמו שיטה מדויקת יותר. CN וריאציה ניתוח כבר הוכח כדי להיות אינפורמטיבי לחיזוי ההתנגדות טיפול בסביבה של mCRPC, אבל זה יכול להיות שימושי גם למטרות אחרות בהגדרות שונות של המטופל. CN ניתוח על cfDNA יש כמה יתרונות: זה לא פולשנית, מהירה וקלה לביצוע, זה מתחיל מאמצעי אחסון קטן של חומר סרום או פלסמה.
Introduction
במחזור התא DNA חופשי (cfDNA) בדם הוכח להיות מקור אופטימלי של סמנים אבחון סרטן, הפרוגנוזה, ניטור של חיזוי של טיפול ההתנגדות1,2. מחקרים רבים הוכיחו קונקורדנציה טוב בין DNA השינויים (מוטציות, העתק מספר וריאציות, שינויים epigenetic ברקמות) ואלה נמצאו המתאימים פלזמה דגימות1, המאשר כי במחזור הגידול דנ א (ctDNA) הוא אינפורמטיבי עבור שינויים רקמת הגידול העיקרי ולא גרורתי3. האפשרות של הלומדים ctDNA ובכך מאפשר את שיקומה של rearrangements גנומית, העתק מספר וריאציות (CNVs) oncogenes ספציפית4, זיהוי פוטנציאל גרורתי תאים המשובטים ו- subclonal. CtDNA הוכח כיעיל קלינית. במיוחד עבור סרטן טיפול ניטור כמו זה בנמלים מוטציות ספציפיות, CNVs, הקשורים ספציפית טיפולים ממוקדים5,6. גם הוא מתגבר על הצורך ביופסיות רקמות ומאפשר את תוצאות ניתן להשיג במועדים שונים במהלך טיפול בסרטן ספציפי בצורה לא פולשנית.
לגבי סרטן הערמונית, מובהק בין מחזורי ללא תא אנדרוגן קולטן (AR) CNVs וטיפול בתגובה abiraterone, enzalutamide הוכח, כמסמן AR ג'ין עותק מספר (CN) ב- cfDNA יכול להיות סמן המבטיחים יכולת חיזוי טיפול ההתנגדות7,8,9,10,11. CNVs של גנים ספציפיים ב- ctDNA ניתן להעריך באמצעות גישות שונות עם רגישות שונה, עלות במהירות (למשל-PCR בזמן אמת, דיגיטלי, קביעת רצף הדור הבא).
כאן נתאר בגישה פשוטה ומהירה, על סמך מבחני דופלקס בטכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת, להערכת CN AR ב- cfDNA מסרום ופלסמה דגימות7,8. שקלנו שני מבחני ה-PCR שונה תוכנן על שני אזורים גנומית שונים בתוך אינטרון 5 של AR (Xq12), שני גנים אחרים, כמו גנים התייחסות תקן פנימי ידוע יש מצב מספר עותק נורמלי סרטן הערמונית (RNaseP, ממוקם על 14q11; לפני1, מלון ב 1 p 34). בחרנו גנים התייחסות שני, במקום אחד, כדי להגביר את הדיוק ואת הרגישות של התוצאות. כמות ה-DNA של 60 ng היה מוגבר עבור כל שילוב assay (assay משולב עבור AR-assay_1 + RNaseP , AR-assay_2 + AGO1). שלושה סרום או פלזמה דגימות דנ א גברים בריאים היו איחדו ומשמש כיל. שקלנו המכנסונים של > 1.5 לרווח AR , < 0.5 למחיקה. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא כי הוא גמיש וכי כי גנים אחרים גם ניתן להעריך, שינוי הגנים להפניה פנימית רגילה, על בסיס סוג הגידול ומאפיינים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול מורכב הבידוד של דנ א מן הדוגמאות סרום או פלזמה לבצע PCR בזמן אמת לצורך ניתוח מספר עותק. הפקת דנ א, בקרת כמות ה-DNA (ספקטרופוטומטרים) ו- PCR בזמן אמת עבור מטרות ספציפיות בוצעו. איור 1, תקציר של נהלים, קו זמן מדווחים.
הפרוטוקול מנחים את ועדת אתיקה במחקר IRST אנושי.
1. סרום איסוף ועיבוד
- לאסוף כ מ ל דם בצינור סרום ללא קרישה כדי לקבל סרום. לשמור על צינורות הדם ב 4 ° C עד עיבוד.
- צנטריפוגה צינורות ב 1,000 x g למשך 15 דקות ב 4 º C.
- להעביר בזהירות סרום לתוך צינורות 2 מ"ל.
- למחוק את הצינור איסוף ומקפיאים מיד את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
2. פלזמה איסוף ועיבוד
- לאסוף כ 10 מ ל דם בצינור פלזמה עם EDTA להשיג פלזמה. ממלאים את הצינור לחלוטין, ואז היפוך זה 8 פעמים. לשמור על צינורות הדם ב 4 ° C עד עיבוד.
- Centrifuge את הצינור ב g x 1,800 למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עם אין ההגדרה בלם לצנטריפוגה.
- להעביר בזהירות את החלק העליון של הפלזמה לתוך צינורות 2 מ"ל. חזור על ההעברה, משאיר לפחות 1 מ"ל של תגובת שיקוע מעל שכבת תאים לבנים.
הערה: העברת החלק העליון של תגובת שיקוע מפחיתה את הסיכון של זיהום על ידי תאים או שאריות תאים. - למחוק את הצינור איסוף ומקפיאים מיד את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
3. דנ א בידוד סרום או פלזמה
הערה: בידוד של דנ א סרום או פלזמה צריכה להתבצע באמצעות פרוטוקול מסחרי שונה בשלבים הבאים.
- הפשרת aliquot אחד (המכיל מ- 0.5 עד 2 מ"ל) של סרום או פלזמה בטמפרטורת החדר.
- מערבולת, לערבב המדגם ולהעביר 0.5 מ"ל של סרום או פלזמה לתוך צינור נקי mL 1.5. להקפיא את שאר חומר ב-80 מעלות צלזיוס.
- להוסיף 50 µL של proteinase k (20 מ"ג/מ"ל) ישירות הדגימה.
- להוסיף 0.5 מ של פירוק מאגר המדגם ומערבבים היטב על ידי pipetting.
- סגור את הצינורות, דגירה דגימות ב 56 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות גוש חום.
- להוסיף הסכום המצוין של 100% אתנול מאגר שטיפת 1 ו- 2, כפי שמציין הוראות היצרן.
- להחזיר את הדגימות בטמפרטורת החדר, להוסיף 0.5 מ"ל אתנול מוחלטת ולערבב היטב על ידי pipetting.
- הוסף µL 650 של תערובת שהושג בשלב 3.7 ההפרדה עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.
- למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ומניחים את העמודה על צינור נקי אוסף חדש. חזור על שלבים 3.8 ו- 3.9 עוד פעם אחת.
- להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 1, בלי להרטיב את החישוק של עמודה, צנטריפוגה ב 6,000 x g עבור 1 דקות.
- למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ולהחליף אותו עם צינור נקי אוסף חדש.
- להוסיף 500 µL שטיפת מאגר 2, בלי להרטיב את החישוק של עמודה, צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות.
- למחוק את הצינור המכיל את הזרימה ולהחליף אותו עם צינור נקי אוסף חדש.
- צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) למשך 3 דקות להסיר את כל מאגר כביסה שיורית.
- מקם את העמודה לתוך צינור נקי mL 1.5. להוסיף 150 µL • תנאי מאגר והמתן 7 דקות כדי להבטיח שאת המאגר מרטיב את העמודה.
- צנטריפוגה ב 8000 g x עבור 1 דקות.
- Pipette את elute מהשלב 3.16 שוב לתוך באותה עמודה צנטריפוגה במלוא המהירות (20,000 x g) עבור 1 דקות להבטיח מקסימלית התאוששות של ה-DNA.
4. DNA כמת, דילול
- לבצע כימות של הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. השתמש µL 2 מדגם ספקטרופוטומטרים ספסל-העליון לפי הוראות היצרן.
הערה: אם הכמות הדנ א אינה מספיקה להמשיך עם ה-PCR בזמן אמת (לפחות 120 ng), לבצע תהליך חדש של בידוד ה-DNA. - לדלל DNA סרום או פלזמה כדי 2.5 ng/µL באמצעי הסופי אחסון מספיק עבור PCR הכל בזמן אמת (כ 50 µL).
5. PCR בזמן אמת
- הפשרה עותק מספר מבחני התייחסות ג'ין assay, דגימות די אן איי מדולל, כיילים איחדו בקרח. Equilibrate בטמפרטורת החדר המיקס ראשי המאוחסן ב- 4 מעלות צלזיוס.
- להכין תערובת של 1 µL של היעד assay, µL 1 של הפניה ג'ין assay 10 µL של מיקס מאסטר 3 ושכפול של כל כיילים איחדו ולדגום. מכינים את תערובת כולל פקד שלילי (מים) ודוגמאות נוספות 2.
- ב- 96 טוב בצלחת, aliquot 12 µL של המיקס כל טוב. האם לא צינורות פיפטה או ספין.
- הוסף 8 µL (ריכוז של 2.5 ng/µL) של כל. דנ א ו כיילים איחדו לבאר כל. האם לא צינורות פיפטה או ספין. לשנות את המידע עבור כל טוב.
הערה: דגימות די אן איי 30 ניתן לעבד עבור כל הניסוי בזמן אמת באמצעות הלוח 96-ובכן: 30 x 3 דוגמאות + שליטה במאגר + שלילי כיילים 1 x 3 = 94. - בקצרה ספין למטה הצלחת ב 1,000 x g.
- הפעל את הצלחת באמצעות פרוטוקול הבאים: להחזיק הבמה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 40 מחזורי ב 95 ° C 15 s, ו- 60 ° C עבור 1 דקות.
6. נתונים ניתוח ופרשנות
- בסעיף "אפשרות", להלן התוצאות מגרש הגברה, לקבוע סף Ct 0.2 עבור הגן היעד הראשון מנותח. חזור על הסט עבור כל הגנים היעד או הפניה. כדי לייצא את הקובץ ה-PCR בזמן אמת בסיומת. txt, לחץ "לייצא" לתוך הכלים. דגל רק "תוצאות" בחר נתונים לייצא ← בחר כסוג קובץ סיומת. txt ← לחץ "התחל ייצוא" ← קרוב בכלי ייצוא.
- פתח את תוכנת ניתוח, לייבא את קובץ. txt (סרגל כלים ← ייבוא).
- בחר את שם הקובץ כדי לנתח ולבחור את הגדרת ניתוח באמצעות סרגל הכלים (סמל משחק).
- לציין את הדגימה כיל ידוע מספר העותקים של המטרה (למשל, 1 עותק עבור AR ג'ין). לחץ על "החל".
- עבור כל דגימה, להשמיט באר אחת עם דלתא שונים Ct (ΔCt) בהשוואה םש.
- לנתח מחדש את הניסוי (הקש הפעל סמל).
- הערכת התוצאות לפי מספר עותק בר מגרש או הטבלה.
הערה: טבלת התוצאות מכילה פרמטרים רבים כמו ביטחון, Z-ציון משכפל מנותח זה יכול להיות שימושי עבור תוצאות פרשנות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CfDNA הכולל ריכוז היה לכימות באמצעות ספקטרופוטומטר עבור כל הדגימות ניתח, מציג החציוני של 6.12 ng/µL (טווח: 2.00-23.71 ng/µL) ועבור הדוגמאות סרום החציוני של 3.21 ng/µL (טווח: 2.31-8.49 ng/µL) עבור דגימות פלסמה. ניתחנו את סך של דגימות 115 על ידי ניסויים PCR בזמן אמת.
מבחן רגישות הוערכה באמצעות DNA סרום מעורב מחולים עם רווח גבוה או נמוך עבור AR, ו- DNA מתורמים מאוד בריאים, אשר משמשים גם כיל דוגמאות לניתוח מספר עותק. כפי שמוצג באיור2, AR CN מזוהה מספיק 0.375% של ה-DNA מחולים עם AR לרווח מעורבב עם בריא התורם דנ א כדי להשיג רווח ג'ין לזיהוי (איור 2). לפיכך, גישה זו זיהה סכום נמוך מאוד של רווח מספר עותק. חישוב סטיית התקן של ΔCt ב CN מבחני עבור כל מטופל (חציון ± SD = 0.1, טווח: 0.00 - 0.36). השתמשנו החציוני של הערכים סטיית התקן עבור בחירת העתק מספר רווח הפסקת.
ניתחנו את המספר עותק של AR בחולים שטופלו abiraterone (n = 53), מציאת 16 חולים (30.2%) הציג AR לרווח7. באופן דומה, ניתחנו את וריאציית מספר עותק עבור AR ג'ין בחולים שטופלו enzalutamide (n = 59), מציאת AR לרווח 21 (36%) של חולים8.
יתר על כן, בדקנו את הקשר בין AR CN ו התוצאות הקליניות בשיטת קפלן-מאייר, יומן-דרגה בדיקה ומצאו קשר משמעותי. בפרט, abiraterone מטופלים חולים סדרת במקרה עם AR ג'ין רווח הראה ההישרדות ללא התקדמות החציוני (PFS) של 2.8 לעומת 9.5 חודשים מהמקרים שאינם השיגה (p < 0.0001). ההישרדות הכוללת נמוכה יותר (OS) דווחה גם בחולים עם AR CN רווח (p < 0.0001).
באופן דומה, עבור סדרת במקרה enzalutamide, מצאנו חציון PFS של 2.4 לעומת חודשים 4.0 עבור חולים עם AR לרווח לעומת חולים עם אין רווח (p = 0.0004). יתר על כן, חציון OS של חולים עם AR CN רווח היה 6.1 לעומת חודשים 14.1 לאלה ללא רווח (p = 0.0003). כל התוצאות AR CN לרווח המתקבל הגישה PCR בזמן אמת אומתו בשיטות אחרות, כולל PCR דיגיטלי (איור 3).
איור 1. זרימת עבודה ובציר הזמן. שיטת זרימת העבודה מחולק צעדים שונים, פעמים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2- גישה רגישות לגילוי AR CN נבדק באמצעות 2 ברורים בריכות (לדוגמה 1, לדוגמה 2) של ה-DNA מתורמים מאוד בריאים, חולים CRPC, צבר עבור ג'ין AR , מעורבות בריכוזים שונים. DNA המטופל היו מעורבים ב אחוזי 0.375 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50, 100, בכל הנוגע DNA הכולל. הקו האדום: הקיצוץ לרווח AR CN (1.5). דמות זו שונתה מ Salvi. et al. 7
איור 3- AR CN תוצאות השוואה בין ה-PCR בזמן אמת (qPCR) ו- PCR דיגיטלי (dPCR) עבור מספר חולים (ציר x). שחור קו: הקיצוץ לרווח AR CN (1.5). דמות זו שונתה מ Salvi. et al. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AR ניתוח CN סרום ופלסמה מדגם מייצג גישה חדשה, לא פולשנית עבור השיכוב סירוס עמיד חולי סרטן הערמונית (CRPC). זה לאחרונה הוכח כי AR CN הוא מסוגל לחזות תוצאות CRPC חולים שטופלו abiraterone, enzalutamide, לפני ואחרי כימותרפיה7,8,9,10.
היתרון העיקרי של הגישה שלנו הוא שהפרוטוקול הוא פשוט מאוד לביצוע, המורכב רק בתהליך בידוד של דנ א, ניתוח ה-PCR בזמן אמת אחת, פרשנויות נתונים קל. יתר על כן, הבדיקה יכולה להיות במהירות שבוצעו ב- 1 לעבוד יום ולאחר ההליך זולה (20$ עבור כל דגימה, כ). הראו כי שיטה זו היא מאוד לשחזור, התוצאות המתקבלות עולים בקנה אחד עם אלה מגיע בשיטות יותר יקר, מדויק, כולל PCR דיגיטלית7,8. יתר על כן, מצאנו דומה AR לזכות בתדר זוהה עם גישות יישוב המיתרים על פלזמה דגימות שטופלו abiraterone9,10. יתרון חשוב נוסף הוא כי גישה זו היא גמישה, יכול להיות החלים על מחלות אחרות שבו הגן AR יש תפקיד חשוב. יתר על כן, גנים אחרים היעד והפניה יכול להיבחר בהתבסס על המחלה של ריבית.
CN ניתוח של הגן AR בסרום יש גם מספר מגבלות. ראשית, השיטה כמת spectrophotometric DNA הוא לרוב מדויק, יכול להיות מוחלף עם גישות אחרות, fluorometric מדויקת יותר. כימות מדויקת יותר יכול לתת תוצאות CN מדויקת יותר. שנית, מספר מחקרים הראו כי זה יכול להיות טוב יותר לנתח פלזמה דנ א במקום סרום דנ א. הכמות במחזור התא ללא ה-DNA הוא בדרך כלל גבוה יותר סרום מאשר פלזמה12,13, עקב קרישת של כדוריות הדם הלבנות בסרום, רומז סרום הוא פוטנציאל מקור גרוע יותר עבור ניתוח הדנ א של גידול ספציפי עקב נוכחות אפשרית של ה-DNA פראי-סוג.
CN ניתוח של הגן AR בנסיוב באמצעות גישות PCR בזמן אמת בוצעה על 112 חולים CRPC לפני שהם התחילו טיפול עם enzalutamide או abiraterone. הנתונים הראו כי AR CN-cfDNA סמן גנטי רב עוצמה של התוצאה הקלינית והתנגדות abiraterone, enzalutamide, והוא יכול לשמש כדי לזהות אנשים מי שעשוי ליהנות אפריורי מןAR טיפולים אנטי - או כימותרפיה באמצעות ה-PCR מהיר ולא נמוכים וזמינותו. ממצאים אלה מדגישים את תוכנית השירות של הלומדים דם כשיטה פולשנית עבור חוקר את מנגנוני ההתנגדות טיפולית, CRPC מוקדמת והן מתקדמות. בעתיד, מחקרים פוטנציאליים, גדול יותר צריך stratify מטופלים על ידי במחזור AR מצב על רקע ההבדלים הבאים התוצאות הקליניות והתגובה לטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים מולינרי קיארה, פיליפו Martignano על תמיכה בניתוח נתונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
