Summary
इस पांडुलिपि की नकल संख्या भिंनता सीरम या प्लाज्मा वास्तविक समय पीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग कर डीएनए में प्रदर्शन विश्लेषण का वर्णन है । इस विधि बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर रोगियों में दवा प्रतिरोध की भविष्यवाणी के लिए उपयुक्त है, लेकिन यह भी अंय बीमारियों के लिए जानकारीपूर्ण जा सकता है ।
Abstract
सीरम और प्लाज्मा सेल नि: शुल्क डीएनए (cfDNA) एक जानकारीपूर्ण, कैंसर निदान, रोग का निदान, निगरानी, और उपचार प्रतिरोध की भविष्यवाणी के लिए गैर इनवेसिव मार्क्स के स्रोत के रूप में दिखाया गया है । इस परिकल्पना से शुरू कि एण्ड्रोजन रिसेप्टर (AR) जीन प्रति संख्या (CN) लाभ मेटास्टेटिक बधिया प्रतिरोध प्रोस्टेट कैंसर (mCRPC) में एक लगातार घटना है, हम एक संभावित पूर्वानुमान के रूप में cfDNA में इस घटना का विश्लेषण करने का प्रस्ताव है ।
हम 2 अलग वास्तविक समय पीसीआर परख और 2 संदर्भ जीन (RNaseP और पहले1) का उपयोग कर cfDNA में एआर CN मूल्यांकन किया । ६० एनजी की डीएनए राशि प्रत्येक परख संयोजन के लिए इस्तेमाल किया गया था । AR CN लाभ एक अधिक सटीक विधि के रूप में डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर पुष्टि की गई थी । CN भिन्नता विश्लेषण पहले से ही mCRPC की सेटिंग में उपचार प्रतिरोध की भविष्यवाणी के लिए जानकारीपूर्ण किया जा करने के लिए प्रदर्शित किया गया है, लेकिन यह भी विभिन्न रोगी सेटिंग्स में अन्य प्रयोजनों के लिए उपयोगी हो सकता है. cfDNA पर CN विश्लेषण कई फायदे हैं: यह गैर इनवेसिव, तेजी से और प्रदर्शन करने के लिए आसान है, और यह सीरम या प्लाज्मा सामग्री की एक छोटी मात्रा से शुरू होता है ।
Introduction
सेल मुक्त डीएनए (रक्त में cfDNA) परिसंचारी कैंसर निदान, रोग का निदान, निगरानी के लिए एक इष्टतम स्रोत का प्रदर्शन किया गया है, और उपचार के प्रतिरोध की भविष्यवाणी1,2। कई अध्ययनों से पता चला है डीएनए परिवर्तन के बीच एक अच्छा सामंजस्य (उत्परिवर्तनों, कॉपी संख्या रूपांतरों, epigenetic संशोधनों) ऊतकों में और उन इसी प्लाज्मा नमूनों में पाया1, पुष्टि की है कि परिसंचारी ट्यूमर डीएनए (ctDNA) है प्राथमिक और मेटास्टेटिक ट्यूमर ऊतक परिवर्तन3के लिए जानकारीपूर्ण । ctDNA का अध्ययन करने की संभावना इस प्रकार जीनोमिक पुनर्व्यवस्थाओं के पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है और विशिष्ट oncogenes4पर प्रतिलिपि संख्या रूपांतरों (CNVs), संभावित मेटास्टेटिक क्लोनिंग और उपक्लोनिंग कोशिकाओं की पहचान. CtDNA को नैदानिक रूप से उपयोगी कैंसर के इलाज के लिए निगरानी के रूप में यह विशिष्ट उत्परिवर्तनों और CNVs, विशिष्ट लक्षित उपचारों से संबंधित5,6बंदरगाह दिखाया गया है । यह भी ऊतक बायोप्सी के लिए की जरूरत पर काबू पा और परिणाम एक गैर इनवेसिव तरीके से एक विशिष्ट कैंसर के इलाज के दौरान अलग समय पर प्राप्त किया जा करने के लिए अनुमति देता है ।
प्रोस्टेट कैंसर के संबंध में, परिसंचारी सेल के बीच एक महत्वपूर्ण सहसंबंध मुक्त एण्ड्रोजन रिसेप्टर (AR) CNVs और abiraterone और enzalutamide के लिए उपचार प्रतिक्रिया दिखाया गया है, एआर जीन की प्रतिलिपि संख्या (CN) cfDNA में संकेत हो सकता है एक होनहार उपचार प्रतिरोध7,8,9,10,11की भविष्यवाणी करने में सक्षम मार्कर । ctDNA में विशिष्ट जीन के CNVs अलग संवेदनशीलता, लागत, और तेजी के साथ अलग दृष्टिकोण का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है (उदावास्तविक समय, डिजिटल पीसीआर, और अगली पीढ़ी अनुक्रमण) ।
यहां हम वास्तविक समय पीसीआर प्रौद्योगिकी में द्वैध परख के आधार पर एक सरल और तेजी से दृष्टिकोण का वर्णन, एआर CN से cfDNA में सीरम और प्लाज्मा नमूनों7,8के मूल्यांकन के लिए । हम दो अलग पीसीआर एआर (Xq12) और दो अंय जीन के 5 intron के भीतर दो अलग जीनोमिक क्षेत्रों पर डिजाइन पर विचार किया, आंतरिक मानक संदर्भ जीन के रूप में जाना जाता है प्रोस्टेट कैंसर में एक सामांय प्रतिलिपि संख्या स्थिति (RNaseP, 14q11 पर स्थित है; पहले1, 1p34 पर स्थित) । हम दो संदर्भ जीन का चयन किया, बल्कि एक से, परिशुद्धता और परिणामों की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए । ६० एनजी के एक डीएनए राशि प्रत्येक परख संयोजन के लिए प्रवर्धित किया गया था ( ar-assay_1 + RNaseP के लिए और ar-assay_2 + AGO1के लिए संयुक्त परख) । स्वस्थ पुरुषों से तीन सीरम या प्लाज्मा डीएनए नमूने परित और एक औजार के रूप में इस्तेमाल किया गया । हमने माना की कटऑफ & #62; १.५ के लिए AR गेन और & #60; ०.५ को हटाने के लिए । इस विधि का मुख्य लाभ में से एक यह है कि यह लचीला है और अंय जीन भी मूल्यांकन किया जा सकता है, मानक आंतरिक संदर्भ जीन बदलने, ट्यूमर प्रकार और विशेषताओं के आधार पर ।
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Protocol
प्रोटोकॉल सीरम या प्लाज्मा नमूनों से डीएनए के अलगाव की नकल संख्या विश्लेषण के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन के होते हैं । डीएनए निष्कर्षण, डीएनए मात्रा नियंत्रण (spectrophotometer) और विशिष्ट लक्ष्यों के लिए वास्तविक समय पीसीआर प्रदर्शन किया गया । चित्रा 1में, प्रक्रियाओं और समय रेखा का एक सारांश रिपोर्ट कर रहे हैं ।
प्रोटोकॉल IRST ह्यूमन रिसर्च एथिक्स कमेटी के दिशानिर्देशों का पालन करता है ।
1. सीरम संग्रह और प्रसंस्करण
- सीरम प्राप्त करने के लिए थक्कारोधी बिना एक सीरम ट्यूब में लगभग 5 मिलीलीटर पूरे रक्त ले लीजिए । प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रक्त ट्यूबों बनाए रखें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए १,००० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक ।
- ध्यान से 2 मिलीलीटर ट्यूबों में सीरम हस्तांतरण ।
- इकट्ठा ट्यूब को त्यागें और तुरंत supernatant पर-८० ° c उपयोग तक फ्रीज ।
2. प्लाज्मा संग्रह और प्रसंस्करण
- प्लाज्मा प्राप्त करने के लिए EDTA के साथ एक प्लाज्मा ट्यूब में लगभग 10 मिलीलीटर पूरे रक्त ले लीजिए । पूरी तरह से ट्यूब भरें और फिर इसे 8 बार पलटना । प्रसंस्करण तक 4 डिग्री सेल्सियस पर रक्त ट्यूबों बनाए रखें ।
- केंद्रापसारक पर कोई ब्रेक की स्थापना के साथ कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए १,८०० x g पर ट्यूब ।
- ध्यान से 2 मिलीलीटर ट्यूबों में प्लाज्मा के ऊपरी भाग हस्तांतरण । स्थानांतरण दोहराएँ, सफेद कोशिका परत के ऊपर supernatant के कम से कम 1 मिलीलीटर छोड़ने.
नोट: supernatant के ऊपरी भाग को स्थानांतरित करने से कोशिकाओं या कोशिका के मलबे के संक्रमण का खतरा कम हो जाता है । - इकट्ठा ट्यूब को त्यागें और तुरंत supernatant पर-८० ° c उपयोग तक फ्रीज ।
3. सीरम या प्लाज्मा से डीएनए अलगाव
नोट: सीरम या प्लाज्मा से डीएनए का अलगाव निम्न चरणों में संशोधित वाणिज्यिक प्रोटोकॉल का उपयोग किया जाना चाहिए.
- गल एक aliquot (०.५ से 2 मिलीलीटर से युक्त) कमरे के तापमान पर सीरम या प्लाज्मा ।
- भंवर और मिश्रण नमूना और एक स्पष्ट १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सीरम या प्लाज्मा के ०.५ मिलीलीटर स्थानांतरण । -८० ° c पर सामग्री के बाकी फ्रीज ।
- proteinase k (20 मिलीग्राम/एमएल) के ५० µ एल जोड़ें सीधे नमूने के लिए ।
- नमूना के लिए lysis बफर की ०.५ मिलीलीटर जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
- हीट ब्लॉक में 15 मिनट के लिए ट्यूबों और ५६ डिग्री सेल्सियस पर मशीन नमूने बंद करें ।
- 1 और 2, के रूप में निर्माता के निर्देशों के द्वारा संकेत दिया धोने बफर पर १००% इथेनॉल की संकेत राशि जोड़ें ।
- नमूनों को वापस कमरे के तापमान पर लाने और पूर्ण इथेनॉल के ०.५ मिलीलीटर जोड़ने और pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
- जोड़ें ६५० µ जुदाई स्तंभ के लिए ३.७ चरण में प्राप्त मिश्रण के l और 1 मिनट के लिए ६,००० x g पर केंद्रापसारक ।
- के माध्यम से प्रवाह युक्त ट्यूब त्यागें और एक नया साफ संग्रह ट्यूब पर कॉलम जगह है । चरण ३.८ और ३.९ एक बार दोहराएँ ।
- जोड़ें ५०० µ एल धोने के बफर 1, कॉलम के रिम गीला बिना और 1 मिनट के लिए ६,००० x g पर केंद्रापसारक ।
- के माध्यम से प्रवाह युक्त ट्यूब त्यागें और यह एक नया साफ संग्रह ट्यूब के साथ बदलें ।
- जोड़ें ५०० µ धोने बफर 2 के एल, कॉलम के रिम गीला बिना और पूरी गति से केंद्रापसारक (२०,००० x g) 3 मिनट के लिए ।
- के माध्यम से प्रवाह युक्त ट्यूब त्यागें और यह एक नया साफ संग्रह ट्यूब के साथ बदलें ।
- पूरी गति से केंद्रापसारक (२०,००० x g) 3 मिनट के लिए किसी भी अवशिष्ट धोने बफर हटाने के लिए ।
- कॉलम को साफ १.५ एमएल ट्यूब में रखें । जोड़ें १५० µ रेफरेंस बफर के एल और 7 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें कि बफर कॉलम wets ।
- 1 मिनट के लिए ८,००० x g पर केंद्रापसारक ।
- पिपेट चरण ३.१६ से elute फिर से एक ही कॉलम में और पूरी गति (२०,००० एक्स जी) के लिए 1 मिनट के लिए डीएनए की अधिकतम वसूली सुनिश्चित करने के लिए केंद्रापसारक ।
4. डीएनए ठहराव और कमजोर पड़ने
- एक spectrophotometer का उपयोग डीएनए के ठहराव प्रदर्शन । निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक बेंच-टॉप spectrophotometer पर नमूना के 2 µ l का उपयोग करें ।
नोट: यदि डीएनए मात्रा वास्तविक समय पीसीआर के साथ आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त नहीं है (कम से १२० एनजी), एक नया डीएनए अलगाव की प्रक्रिया करते हैं । - सभी वास्तविक समय पीसीआर (लगभग ५० µ एल) के लिए पर्याप्त एक अंतिम मात्रा में २.५ एनजी/µ एल के लिए सीरम या प्लाज्मा से डीएनए पतला ।
5. वास्तविक समय पीसीआर
- गल कॉपी संख्या परख, संदर्भ जीन परख, डीएनए पतला नमूने, और रोलर्स बर्फ में परित । कमरे के तापमान पर Equilibrate 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाता है कि मास्टर मिश्रण ।
- लक्ष्य परख, 1 µ संदर्भ जीन परख के एल के 1 µ एल का एक मिश्रण तैयार है, और 3 के लिए मास्टर मिश्रण के 10 µ एल प्रत्येक नमूने और औजार की प्रतिकृतियां परित । एक नकारात्मक नियंत्रण (पानी) और 2 अतिरिक्त नमूनों सहित मिश्रण तैयार करें ।
- एक ९६ अच्छी तरह से थाली में, aliquot एक अच्छी तरह से में मिश्रण के 12 µ एल । पिपेट या स्पिन ट्यूब मत करो ।
- जोड़ें 8 µ एल (२.५ एनजी/µ एल की एकाग्रता) प्रत्येक डीएनए नमूना और एक अच्छी तरह से में परित औजार । पिपेट या स्पिन ट्यूब मत करो । प्रत्येक कुआं के लिए टिप बदलें ।
नोट: 30 डीएनए नमूने प्रत्येक वास्तविक समय प्रयोग के लिए संसाधित किया जा सकता ९६-well थाली का उपयोग: 30 x 3 नमूने + 1 एक्स 3 औजार परित + नकारात्मक नियंत्रण = ९४ । - संक्षेप में १,००० x जी पर प्लेट नीचे स्पिन
- निंनलिखित प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्लेट भागो: ९५ डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट, ४० चक्र के लिए ९५ ° c पर 15 एस के लिए चरण पकड़ो, और 1 मिनट के लिए ६० ° c ।
6. डेटा विश्लेषण और व्याख्या
- खंड में "विकल्प", प्रवर्धन भूखंड परिणाम नीचे, ०.२ पर पहला लक्ष्य जीन के लिए सीटी दहलीज सेट विश्लेषण किया । प्रत्येक लक्ष्य या संदर्भ जीन के लिए सेट दोहराएं । txt एक्सटेंशन में रीयल-टाइम पीसीआर फ़ाइल निर्यात करने के लिए, टूलबार में "निर्यात करें" दबाएं । निर्यात करने के लिए डेटा का चयन करें में केवल "परिणाम" फ्लैग करें → फ़ाइल प्रकार के रूप में चुनें एक्सटेंशन. txt → प्रेस "निर्यात प्रारंभ करें" → निर्यात उपकरण बंद करें ।
- विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें और file. txt (टूलबार → आयात) आयात करें ।
- विश्लेषण के लिए फ़ाइल नाम का चयन करें और उपकरण पट्टी (प्रतीक चलाएं) द्वारा विश्लेषण सेटिंग का चयन करें ।
- औजार का नमूना और ज्ञात संख्या (उदा., AR जीन के लिए 1 प्रतिलिपि) लक्ष्य की प्रतियां निर्दिष्ट करें । प्रेस "लागू करें."
- प्रत्येक नमूने के लिए, एक अच्छी तरह से अन्य कुओं के साथ तुलना में अलग डेल्टा सीटी (ΔCt) के साथ छोड़.
- प्रयोग (प्रेस प्ले प्रतीक) reश्लेष ।
- प्रतिलिपि संख्या पट्टी प्लॉट या तालिका द्वारा परिणामों का मूल्यांकन करें ।
नोट: परिणाम तालिका विश्वास, Z-स्कोर की तरह कई मापदंडों शामिल हैं, और प्रतिकृति विश्लेषण किया है कि परिणाम की व्याख्या के लिए उपयोगी हो सकता है ।
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Representative Results
कुल cfDNA एकाग्रता सभी नमूनों के लिए spectrophotometry द्वारा quantifiable था, का एक औसत दिखा रहा है ६.१२ एनजी/µ एल (रेंज: २.००-२३.७१ एनजी/µ एल) सीरम नमूनों के लिए और एक औसत के ३.२१ एनजी/µ एल (रेंज: २.३१-८.४९ एनजी/µ एल) प्लाज्मा नमूनों के लिए । हमने रीयल-टाइम पीसीआर प्रयोगों द्वारा कुल ११५ नमूनों का विश्लेषण किया ।
परीक्षण संवेदनशीलता के लिए उच्च या कम लाभ के साथ रोगियों से मिश्रित सीरम डीएनए का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था AR, और स्वस्थ दाताओं, जो भी नकल संख्या विश्लेषण के लिए औजार के नमूने के रूप में इस्तेमाल कर रहे है से डीएनए । जैसा कि चित्र 2में दर्शाया गया है, ar CN का ०.३७५% डीएनए में ar प्राप्त करने के लिए स्वस्थ दाता डीएनए के साथ मिश्रित रोगियों से एक जीन लाभ detectable (चित्रा 2) प्राप्त करने के लिए पर्याप्त रूप से पाया जाता है । इस प्रकार, इस दृष्टिकोण की नकल संख्या लाभ का एक बहुत कम राशि का पता लगाया । प्रत्येक रोगी के लिए CN परख में ΔCt के मानक विचलन (माध्य ± एसडी = ०.१, रेंज: ०.००-०.३६) की गणना की गई । हम कॉपी संख्या लाभ cutoff चुनने के लिए मानक विचलन मूल्यों का एक औसत इस्तेमाल किया.
हम abiraterone (n = ५३) के साथ इलाज रोगियों में ar की प्रतिलिपि संख्या का विश्लेषण, 16 ढूंढना (३०.२%) रोगियों एआर लाभ का प्रदर्शन7। इसी तरह, हम enzalutamide (n = ५९) के साथ इलाज रोगियों में एआर जीन के लिए प्रतिलिपि संख्या भिन्नता का विश्लेषण किया, 21 में AR लाभ ढूंढना (रोगियों की ३६%)8.
इसके अलावा, हमने कापलान-Meier विधि और लॉग-रैंक परीक्षण का उपयोग करके AR CN और नैदानिक परिणामों के बीच संबद्धता का मूल्यांकन किया और एक महत्वपूर्ण संबद्धता पाई । विशेष रूप से, abiraterone एआर जीन लाभ के साथ मामले श्रृंखला रोगियों का इलाज एक औसत प्रगति मुक्त जीवन रक्षा (PFS) गैर के ९.५ महीने बनाम प्राप्त मामलों (पी & #60; ०.०००१) दिखाया । AR CN लाभ (p & #60; ०.०००१) के साथ रोगियों में एक कम समग्र अस्तित्व (OS) भी बताया गया ।
इसी प्रकार, enzalutamide मामले श्रृंखला के लिए, हम कोई लाभ (पी = ०.०००४) के साथ एआर गेन बनाम रोगियों के साथ रोगियों के लिए २.४ बनाम ४.० महीने की एक औसत PFS पाया । इसके अलावा, एआर CN लाभ के साथ रोगियों के औसत ओएस ६.१ बनाम लाभ (पी = ०.०००३) के बिना उन लोगों के लिए १४.१ महीने था । सभी AR CN प्राप्त परिणाम रीयल-टाइम पीसीआर दृष्टिकोण से डिजिटल पीसीआर (चित्र 3) सहित अंय विधियों के उपयोग की पुष्टि की गई ।
चित्र 1. कार्यप्रवाह और समयरेखा. विधि वर्कफ़्लो विभिन्न चरणों और समय में विभाजित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. 2 विशिष्ट पूल (नमूना 1 और नमूना 2) स्वस्थ दाताओं से डीएनए के और सीआरपीसी के रोगियों से, एआर जीन, अलग सांद्रता में मिश्रित के लिए प्राप्त का उपयोग कर परीक्षण के लिए ar CN डिटेक्शन के लिए संवेदनशीलता रोगी डीएनए कुल डीएनए के संबंध में ०.३७५, ०.७५, १.५, 3, 6, 12, 25, ५०, और १०० के प्रतिशत में मिलाया गया था । लाल रेखा: AR CN लाभ (१.५) के लिए कटऑफ । इस आंकड़े को सालवी एट अल से संशोधित किया गया है । 7
चित्र 3. AR CN कई रोगियों (x-अक्ष) के लिए रीयल-टाइम पीसीआर (qPCR) और डिजिटल पीसीआर (dPCR) के बीच तुलना परिणाम । ब्लैक लाइन: AR CN लाभ (१.५) के लिए कटऑफ । इस आंकड़े को सालवी एट अल से संशोधित किया गया है । 7
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Discussion
AR CN विश्लेषण में सीरम और प्लाज्मा नमूना बधिया प्रतिरोधी प्रोस्टेट कैंसर (सीआरपीसी) रोगियों के स्तरीकरण के लिए एक नया, गैर इनवेसिव दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है । यह हाल ही में प्रदर्शित किया गया है कि AR CN सीआरपीसी में परिणामों की भविष्यवाणी करने में सक्षम है abiraterone और enzalutamide के साथ इलाज, पहले और कीमोथेरेपी के बाद7,8,9,10।
हमारे दृष्टिकोण का मुख्य लाभ यह है कि प्रोटोकॉल बहुत प्रदर्शन करने के लिए सरल है, केवल एक डीएनए अलगाव की प्रक्रिया से मिलकर, एक वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण और आसान डेटा व्याख्याओं । इसके अलावा, परीक्षण जल्दी से 1 कार्य दिवस में प्रदर्शन किया जा सकता है, और प्रक्रिया (प्रत्येक नमूने के लिए $२० अमरीकी डालर, लगभग) सस्ती है । हमने यह दर्शाया है कि यह विधि अत्यधिक प्रतिलिपि है और प्राप्त किए गए परिणाम डिजिटल पीसीआर7,8सहित अधिक खर्चीले और सटीक तरीकों से आने वाले लोगों के साथ कतार में हैं । इसके अलावा, हम एक समान AR लाभ आवृत्ति abiraterone9,10के साथ इलाज प्लाज्मा नमूनों पर लक्षित NGS दृष्टिकोण के साथ पता चला पाया । एक अंय महत्वपूर्ण लाभ यह है कि इस दृष्टिकोण लचीला है और अंय बीमारियों जिसमें AR जीन एक महत्वपूर्ण भूमिका है के लिए लागू हो सकता है । इसके अलावा, अंय लक्ष्य और संदर्भ जीन ब्याज की बीमारी के आधार पर चुना जा सकता है ।
एआर जीन के सीरम में CN विश्लेषण भी कुछ सीमाएं हैं । सबसे पहले, डीएनए स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक ठहराव विधि अक्सर गलत है और अंय के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और अधिक सटीक fluorometric दृष्टिकोण । अधिक सटीक ठहराव अधिक सटीक CN परिणाम दे सकता है । दूसरे, कुछ अध्ययनों से यह सुझाव दिया है कि यह सीरम डीएनए के बजाय प्लाज्मा डीएनए का विश्लेषण करने के लिए बेहतर हो सकता है । सेल नि: शुल्क डीएनए परिसंचारी की मात्रा आम तौर पर12,13प्लाज्मा में सीरम की तुलना में अधिक है, सीरम में सफेद रक्त कोशिकाओं के थक्के के कारण, सुझाव है कि सीरम संभावित ट्यूमर विशेष डीएनए विश्लेषण के लिए एक बदतर स्रोत है क्योंकि जंगली प्रकार डीएनए की संभावित उपस्थिति के ।
enzalutamide या abiraterone के साथ उपचार शुरू करने से पहले, वास्तविक समय पीसीआर दृष्टिकोण का उपयोग कर सीरम में एआर जीन का CN विश्लेषण ११२ सीआरपीसी के रोगियों पर किया गया है । हमारे डेटा से पता चला है कि ar CN cfDNA पर नैदानिक परिणाम और abiraterone और enzalutamide के प्रतिरोध की एक शक्तिशाली आनुवंशिक अगोचर है, और उन लोगों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो एंटी-एआर उपचारों से एक प्राथमिकताओं को लाभ पहुंचा सकते है या एक तेजी से और कम लागत वाली पीसीआर परख का उपयोग कीमोथेरेपी । इन निष्कर्षों दोनों जल्दी और उंनत सीआरपीसी में चिकित्सीय प्रतिरोध के तंत्र से पूछताछ के लिए एक ंयूनतम इनवेसिव विधि के रूप में रक्त का अध्ययन करने की उपयोगिता पर प्रकाश डाला । भविष्य में, भावी और बड़े अध्ययन नैदानिक परिणामों और उपचार प्रतिक्रिया में बाद के मतभेदों को ध्यान में रखते हुए एआर स्थिति परिचालित द्वारा रोगियों stratify चाहिए ।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।
Acknowledgments
डाटा एनालिसिस में सपोर्ट के लिए हम चियारा Molinari और Filippo Martignano को धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
