Summary
Эта рукопись описывает копии номер вариационный анализ выполняется в сыворотке или плазме ДНК методом ПЦР в реальном времени. Этот метод подходит для прогнозирования лекарственной устойчивости в устойчивые кастрация рак предстательной железы пациенты, но это может быть информативным и для других заболеваний.
Abstract
Сыворотки и плазмы клеток бесплатные ДНК (cfDNA) было показано, как информативный, неинвазивная источник биомаркеров для диагностики рака, прогнозирования, мониторинга и прогнозирования лечение сопротивления. Начиная от гипотезы, что андрогенных рецепторов (Ар) ген копии номер (CN) получить частые события в метастатических кастрация сопротивления предстательной железы (mCRPC), мы предлагаем для анализа этого события в cfDNA как потенциальный интеллектуального биомаркеров.
Мы оценивали AR CN в cfDNA с помощью 2 различных реального времени анализы ПЦР и 2 ссылку генов (RNaseP и Аго1). Количество ДНК в 60 ng был использован для каждой комбинации assay. AR CN прирост был подтвержден с помощью цифровой PCR как метод более точного. CN вариационный анализ уже была продемонстрирована быть информативным для прогноза лечения сопротивления в параметре mCRPC, но это может оказаться полезным также для других целей в различных пациентов. CN анализ на cfDNA имеет ряд преимуществ: это неинвазивный, быстро и легко выполнять, и она начинается с небольшой объем сыворотки или плазмы материала.
Introduction
Циркулирующих клеток бесплатные ДНК (cfDNA) в крови было продемонстрировано оптимальным источником биомаркеров для диагностики рака, прогноз, мониторинг и прогноз лечения сопротивление1,2. Многие исследования показали хороший соответствий между ДНК изменения (мутации, копии номер вариации, эпигеномные изменения в тканях) и тех, кто в соответствующий плазмы образцы1, подтверждающее, что распространение опухоли ДНК (ctDNA) информативна для первичных и метастатических опухолей ткани изменения3. Таким образом, возможность обучения ctDNA позволяет для реконструкции геномных перестроек и скопировать номер вариации (CNVs) на определенных онкогенов4, выявления потенциально метастатического клоновых и subclonal клетки. CtDNA было показано, быть клинически полезным, особенно для рака лечение мониторинг как он укрывает специфических мутаций и CNVs, связанные с конкретной целевой терапии5,6. Он также преодолевает потребность биопсия тканей и позволяет результаты должны быть получены в разное время лечения конкретных рака неинвазивным способом.
Что касается рака простаты, существенная корреляция между циркулирующих клеток свободных андрогенов рецепторов (Ар) CNVs и лечения ответ на abiraterone и enzalutamide было показано, число копии гена показывающее AR (CN) в cfDNA может быть перспективным биомаркер способны прогнозировать лечение сопротивления7,8,9,10,11. CNVs конкретных генов в ctDNA может оцениваться с использованием различных подходов с разной чувствительностью, стоимости и оперативности (например. ПЦР в реальном времени, цифровой и следующего поколения последовательности).
Здесь мы опишем простой и быстрый подход, основанный на дуплекс анализов в реальном времени технологии PCR, для оценки AR CN в cfDNA7,образцы сыворотки и плазмы8. Мы рассмотрели два различных анализы ПЦР, разработан в двух различных регионах геномной Интрон 5 AR (Xq12) и два других генов, как внутренние стандартных генов, известно, что число статус обычных копирования рака простаты (RNaseP, расположен на 14q11; Назад1, расположенный на 1 p 34). Мы выбрали два ссылку генов, а не один, чтобы увеличить точность и чувствительность результатов. ДНК, количество 60 ng был усилен для каждой комбинации пробирного (комбинированные проба для AR-assay_1 + RNaseP и AR-assay_2 + AGO1). Три образцы ДНК сыворотки или плазмы, от здоровых мужчин были объединены и используется как калибратора. Мы рассматривали предохранители от > 1.5 для AR выгоды и < 0.5 для удаления. Одним из главных преимуществ этого метода является, что он является гибким и что другие гены может также оцениваться, изменять стандартную внутреннюю ссылку генов, на основе типа опухоли и характеристики.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол состоит из изоляции ДНК пробах сыворотки или плазмы для выполнения копирования номер анализа ПЦР в реальном времени. Были исполнены экстракции ДНК, ДНК количество управления (Спектрофотометр) и ПЦР в реальном времени для конкретных целей. На рисунке 1сообщается резюме процедуры и сроки.
Протокол следует принципам IRST человека Комитет по этике исследований.
1. сыворотка сбор и обработка
- Собирают около 5 мл цельной крови в сыворотке крови трубки без антикоагулянта для получения сыворотки. Поддерживать Трубы крови при температуре 4 ° C до обработки.
- Пробирок на 1000 x g 15 мин при 4 ° C.
- Тщательно передачи сыворотки в 2 мл пробирок.
- Отказаться от сбора трубки и немедленно заморозить супернатант в-80 ° C до использования.
2. плазмы сбор и обработка
- Соберите около 10 мл цельной крови в плазме трубки с ЭДТА получить плазмы. Полностью заполнить трубу и затем инвертировать его 8 раз. Поддерживать Трубы крови при температуре 4 ° C до обработки.
- Центрифуга трубки на 1800 g x 15 мин при комнатной температуре с параметра нет тормозов на центрифуге.
- Тщательно перенесите в верхней части плазмы в 2 мл пробирок. Повторите передачу, оставляя по крайней мере 1 мл супернатант над слоем белых клеток.
Примечание: Перенос в верхней части супернатант уменьшает риск загрязнения клетки или клетки мусора. - Отказаться от сбора трубки и немедленно заморозить супернатант в-80 ° C до использования.
3. ДНК изоляции от сыворотки или плазмы
Примечание: Изоляции ДНК из сыворотки или плазмы должно производиться с использованием коммерческих протокола, изменения в следующих шагах.
- Размораживать один Алиготе (содержащие от 0,5 до 2 мл) сыворотки или плазмы при комнатной температуре.
- Вортекс и перемешивают образец и передачи 0,5 мл сыворотки или плазмы в ясно 1,5 мл трубку. Заморозить остальные материала при температуре-80 ° C.
- Добавьте 50 мкл протеиназы k (20 мг/мл) непосредственно в образце.
- Добавить 0,5 мл буфера lysis образца и смешайте хорошо закупорить.
- Закройте трубы и Проинкубируйте образцы на 56 ° C в течение 15 мин в блоке тепла.
- Добавьте указано количество 100% этанола в мыть буфер 1 и 2, как указано в инструкции изготовителя.
- Принести образцы обратно до комнатной температуры и добавить 0,5 мл абсолютного этанола и смешайте хорошо закупорить.
- 650 мкл смеси, полученного на шаге 3.7 разделения столбцов и центрифуги на 6000 x g за 1 мин.
- Отменить трубка, содержащая через поток и столбце на новой чистой коллекции трубки. Повторите шаги 3.8 и 3.9 еще один раз.
- Добавьте 500 мкл буфера мытья 1, без смачивания краю столбца и центрифуги на 6000 x g за 1 мин.
- Отменить трубка, содержащая через поток и заменить ее новой коллекции чистый трубки.
- Добавьте 500 мкл буфера мытья 2, без смачивания краю столбца и центрифуги на полной скорости (20000 x g) 3 мин.
- Отменить трубка, содержащая через поток и заменить ее новой коллекции чистый трубки.
- Центрифуга на полной скорости (20000 x g) 3 мин для удаления любых остаточных Отмывающий буфер.
- Место столбца в чистой 1,5 мл трубку. Добавить 150 мкл буфера и ждать 7 мин, чтобы убедиться, что буфер смачивает столбец.
- Центрифуга на 8000 x г за 1 мин.
- Пипетка elute от шага 3.16 снова в тот же столбец и центрифуги на полной скорости (20000 x g) за 1 мин для обеспечения максимального восстановления ДНК.
4. ДНК количественной и разбавления
- Выполняют количественного определения ДНК с помощью спектрофотометра. Используйте 2 мкл пример на скамейке Топ спектрофотометром в соответствии с инструкциями изготовителя.
Примечание: Если количество ДНК не является достаточно, чтобы продолжить с ПЦР в реальном времени (по крайней мере 120 ng), выполнения новый процесс изоляции ДНК. - Разбавляют ДНК из сыворотки или плазмы до 2,5 нг/мкл в окончательном объеме, достаточном для всех реальном масштабе времени PCR (около 50 мкл).
5. в реальном масштабе времени PCR
- Оттепель копировать количество анализов, ссылка гена пробирного, образцы ДНК разбавленный и калибраторы, объединили в лед. Сбалансировать при комнатной температуре мастер смесь, которая хранится на 4 ° C.
- Подготовка смесь 1 мкл целевого анализа, 1 мкл ссылка гена пробирного и 10 мкл мастер смеси для 3 реплицирует каждого образца и калибраторы пуле. Подготовка смеси, в том числе отрицательного контроля (вода) и 2 дополнительных образцов.
- В 96 хорошо пластины, аликвота 12 мкл смеси в каждой скважине. Сделать не пипеткой или спин трубы.
- Мкл 8 (концентрация 2,5 нг/мкл) каждого образца ДНК и калибраторы, объединили в каждой скважине. Сделать не пипеткой или спин трубы. Изменение подсказки для каждой скважины.
Примечание: 30 образцов ДНК могут быть обработаны для каждого реального времени эксперимент с использованием 96-луночных пластины: образцы 30 x 3 + 1 x 3 калибраторы пуле + отрицательный контроль = 94. - Кратко вращаться вниз пластину на 1000 x g.
- Запустите пластину, используя следующий протокол: провести этап на 95 ° C в течение 10 мин, 40 циклов при 95 ° C 15 s и 60 ° C в течение 1 мин.
6. анализ данных и интерпретации
- В разделе «опции», ниже результатов амплификации сюжета, установите порог Ct на 0,2 для первого целевого гена проанализированы. Повторите набор для каждой целевой объект или ссылку генов. Чтобы экспортировать в реальном времени PCR в расширение .txt, нажмите «Экспорт» в панели инструментов. Флаг только «результаты» в окне Выбор данных для экспорта → выбрать как тип файла расширение .txt → нажмите «начать экспорт» → закрыть средство экспорта.
- Откройте программное обеспечение для анализа и импорта файла .txt (инструментов → импорта).
- Выберите имя файла для анализа и выбора анализа параметр на панели инструментов (играть символ).
- Укажите калибровочных образцов и известное количество экземпляров целевого объекта (например, 1 копия гена AR ). Нажмите «Применить».
- Для каждого образца Опустите один колодец с различными Дельта Ct (ΔCt) по сравнению с другими скважин.
- Повторный анализ эксперимента (пресс играть символ).
- Оцените результаты по номеру копирования бар сюжет или таблицы.
Примечание: Таблица результатов содержит множество параметров, как доверие, Z-скор и реплицирует проанализированы, которые могут быть полезны для интерпретации результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Общая cfDNA концентрация была количественно методом спектрофотометрии для всех образцов, анализ, показаны медиана 6.12 нг/мкл (диапазон: 2.00-23.71 нг/мкл) для образцов сыворотки и медианные 3.21 нг/мкл (диапазон: 2.31-8.49 нг/мкл) для образцов плазмы. Мы проанализировали в общей сложности 115 образцов в реальном масштабе времени PCR экспериментов.
Чувствительность теста была оценена с помощью ДНК смешанного сыворотки от пациентов с высокой или низкой прибыли для ARи ДНК от здоровых доноров, которые также используются как калибровочных образцов для копирования номер анализа. Как представлено на рисунке 2, AR CN достаточно обнаруживается в 0,375% ДНК от пациентов с gain AR , смешанной с здоровых доноров ДНК получить ген прибыль обнаружению (рис. 2). Таким образом этот подход обнаружен очень низкое количество номер получить копию. Стандартное отклонение ΔCt в CN анализов для каждого пациента были рассчитаны (средний ± SD = 0.1, диапазон: 0.00 - 0,36). Мы использовали медиана значений стандартного отклонения для выбора копии номер получить отсечки.
Мы проанализировали копировать количество Ар в пациентов с abiraterone (n = 53), нахождение 16 больных (30,2%) выставлены AR выигрыш7. Аналогичным образом, мы проанализировали количество вариации копии гена AR в пациентов с enzalutamide (n = 59), нахождение AR выигрыш в 21 (36%) пациентов8.
Кроме того мы оценивали связь между AR CN и клинические исходы, с помощью метода Каплана-Мейера и лог ранг тест и обнаружили значительные ассоциации. В частности, abiraterone пациентов серии случаев с gain гена AR показал средний прогрессии безрецидивная выживаемость (PFS) 2.8 против 9,5 месяцев случаев не получили (p < 0.0001). Ниже общей выживаемости (OS) сообщалось также в больных с AR CN gain (p < 0.0001).
Аналогичным образом, для enzalutamide случае серии, мы нашли медиана PFS 2.4 против 4.0 месяцев для пациентов с AR выигрыш против пациентов с не получить (p = 0.0004). Кроме того, медиана OS пациентов с AR CN прирост был 6.1 против 14,1 месяцев для тех, кто без выгоды (p = 0.0003). Все AR CN получить результаты, полученные от реального времени PCR подхода были подтверждены с помощью других методов, включая цифровые ПЦР (рис. 3).
Рисунок 1. Рабочий процесс и сроки. Метод рабочий процесс делится на различные этапы и раз. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Чувствительность подхода для обнаружения AR CN, проверяется с помощью 2 различных бассейнов (примеры 1 и 2) ДНК от здоровых доноров и ЦЗПП пациентов, накопленный гена AR , смешанной в различных концентрациях. Пациент ДНК были смешанные на процент 0.375, 0,75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50 и 100, в отношении всего ДНК. Красная линия: отсечки для усиления AR CN (1.5). Эта цифра была изменена от Сальви и др. 7
Рис. 3. AR CN результаты сравнения между ПЦР в реальном времени (ПЦР) и цифровой ПЦР (dPCR) для нескольких пациентов (ось x). Черная линия: отсечки для усиления AR CN (1.5). Эта цифра была изменена от Сальви и др. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AR CN анализа в сыворотке и плазме крови образец представляет собой новый, неинвазивная подход для стратификации пациентов рака простаты устойчивы кастрация (УПК). Недавно было продемонстрировано, что AR CN способна прогнозировать результаты в УПК пациентов с abiraterone и enzalutamide, до и после химиотерапии7,8,9,10.
Главным преимуществом нашего подхода является, что протокол является очень простой для выполнения, состоящий из только процесс изоляции ДНК, один анализ ПЦР в реальном времени и интерпретации данных легко. Кроме того, тест может быть быстро выполняемых в 1 рабочий день, и процедура недорогой ($20 USD для каждого образца, примерно). Мы продемонстрировали, что этот метод является весьма воспроизводимость и полученные результаты соответствуют целям, исходя из более дорогих и точных методов, включая цифровые ПЦР7,8. Кроме того мы обнаружили, аналогичные AR получить частоты обнаружены с целенаправленных подходов NGS на образцах плазмы, относились с abiraterone9,10. Другим важным преимуществом является, что такой подход является гибкой и может применяться для других заболеваний, в которых ген AR имеет важную роль. Кроме того другие цели и ссылку генов может быть выбирается на основании болезни интерес.
CN-анализа гена AR в сыворотке имеет также некоторые ограничения. Во-первых метод спектрофотометрические количественного определения ДНК часто является неточным и могут быть заменены другими, более точные флуориметрический подходов. Более точную количественную оценку можно дать более точные результаты CN. Во-вторых некоторые исследования показали, что она может быть лучше для анализа плазмы ДНК вместо сыворотки ДНК. Как правило, выше в сыворотке, чем в плазме12,13, из-за свертывания белых кровяных клеток в сыворотке крови, предполагая, что сыворотка является потенциально хуже источником для анализа ДНК опухоль – специфичные количество циркулирующих клеток бесплатные ДНК из-за возможного присутствия одичал типа ДНК.
На 112 УПК пациентов был выполнен анализ CN гена AR в сыворотке, используя подходы ПЦР в режиме реального времени, прежде чем они начали лечение с enzalutamide или abiraterone. Наши данные показали, что AR CN на cfDNA это мощный генетических биомаркеров клинических исходов и устойчивость к abiraterone и enzalutamide и может использоваться для выявления мужчин, которые могли бы воспользоваться априори от анти -AR терапии или химиотерапия с помощью быстрого и дешевого ПЦР анализа. Эти выводы подчеркивают полезность изучения крови как минимально инвазивной метод допроса механизмы терапевтического сопротивления в как ранние, так и продвинутых УПК. В будущем перспективных и более крупные исследования следует стратифицировать пациентов путем распространения AR статус с учетом последующего различия в клинических исходов и лечение реакции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Chiara Молинари и Мартиньяно Filippo за поддержку в области анализа данных.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
