Summary
Bu el yazması kopya numarası varyasyon analizi serum veya plazma DNA gerçek zamanlı PCR yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilen açıklar. Bu yöntem için tahmin kastrasyon dayanıklı prostat kanseri hastalarda ilaç direnci uygundur, ama aynı zamanda diğer hastalıklar için bilgilendirici olabilir.
Abstract
Serum ve Plazma hücre ücretsiz DNA (cfDNA) biyolojik kanser tanısı, prognoz, izleme ve tedavi direnci tahmini için bir bilgilendirici, non-invaziv kaynağı olarak gösterilmiştir. Androjen reseptör (AR) Gen kopya numarası (CN) kazanç varsayımını başlayarak sık olay metastatik kastrasyon direnç prostat kanseri (mCRPC), bu durumda cfDNA bir potansiyel akıllı biyomarker olarak analiz etmek önerdiğimiz.
Biz AR CN 2 farklı gerçek zamanlı PCR deneyleri ve 2 başvuru genler (RNaseP ve önce1) kullanarak cfDNA olarak değerlendirildi. DNA bir miktar olan 60 ng her tahlil birleşim için kullanıldı. AR CN kazanç dijital PCR daha doğru bir yöntemle doğrulandı. CN varyasyon analizi zaten tedavi direnci mCRPC ortamda tahmin için bilgilendirici olmak kanıtlanmıştır, ama aynı zamanda farklı hasta ortamlarda başka amaçlar için yararlı olabilir. CfDNA CN analiz çeşitli avantajları vardır: non-invaziv, hızlı ve gerçekleştirmek kolay ve serum veya plazma malzeme küçük bir birimden başlar.
Introduction
Hücre ücretsiz DNA (cfDNA) kan dolaşan biyolojik kanser tanısı, prognoz, izleme ve tedavi direnci1,2tahmini için en iyi bir kaynağı olmak kanıtlanmıştır. Birçok çalışma DNA değişiklikler (mutasyonlar, kopya numarası varyasyonları, dokularda epigenetik değişiklikler) ve tümör DNA (ctDNA) dolaşan olduğunu teyit karşılık gelen plazma örnekleri1' de bulunanlar arasında iyi bir uyum göstermiştir birincil ve metastatik tümör doku değişiklikleri3için bilgilendirici. CtDNA eğitim imkanı böylece genomik düzenlemeler ve kopya numarası varyasyonları (CNVs) belirli oncogenes4potansiyel metastatik klonal ve subclonal hücreleri tanımlayan, yeniden inşası için izin verir. CtDNA belirli mutasyonlar ve özel hedeflenmiş tedaviler5,-6ile ilgili CNVs, limanlar gibi özellikle kanser tedavi izlemek için klinik olarak yararlı olabilir göstermiştir. Ayrıca doku biyopsisi ihtiyacını üstesinden gelir ve non-invaziv bir şekilde belirli kanser tedavisi sırasında farklı zamanlarda elde edilecek sonuçlar sağlar.
Prostat kanseri, boş hücre androjen dolaşan arasında önemli bir bağıntı ile ilgili olarak reseptör (AR) CNVs ve tedavi yanıt-e doğru abiraterone ve enzalutamide gösterilen, gösteren AR Gen kopya numarası (CN) cfDNA-ebilmek var olmak bir umut verici biyomarker tedavi direnci7,8,9,10,11tahmin yeteneğine sahip. CNVs ctDNA belirli genlerin değerlendirilen farklı duyarlılık, maliyet ve hız ile farklı yaklaşımlar kullanarak (örn. gerçek zamanlı, dijital PCR ve sonraki nesil sıralama).
Burada serum ve plazma örnekleri7,8cfDNA AR CN değerlendirmek için gerçek zamanlı PCR teknolojisinde çift yönlü deneyleri temel basit ve hızlı bir yaklaşım açıklar. Biz iki farklı genomik Berisi Bölgeler Klasiği intron 5 AR (Xq12) ve iki diğer genler, prostat kanseri (RNaseP, normal kopya numarası durumundaki bilinen iç standart referans genler olarak tasarlanmış iki farklı PCR deneyleri kabul 14q11 üzerinde bulunan; 1'de yer alan önce1, p 34). Biz bir duyarlık ve sonuçları duyarlılığını artırmak için yerine, iki referans genler seçildi. Bir DNA miktar olan 60 ng her tahlil birleşimi (kombine tahlil ve AR-assay_2 + AGO1 AR-assay_1 + RNaseP için) için güçlendirilmiş. Sağlıklı erkek üç serum veya plazma DNA örnekleri havuza alınmış ve bir Kalibratör kullanılır. Biz cutoffs, kabul > AR kazanç için 1.5 ve < 0,5 silinmek. Bu yöntemin ana avantajlarından biri bu esnek ve diğer genler Ayrıca, standart iç başvuru genler, tümör tipi ve özellikleri temelinde değiştirme değerlendirilebilir olduğunu olmasıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DNA izolasyonu kopya numara analiz için gerçek zamanlı PCR gerçekleştirmek için serum veya plazma numuneleri, protokol oluşur. DNA ekstraksiyon, DNA miktar denetimi (Spektrofotometre) ve gerçek zamanlı PCR belirli hedefleri için yapıldı. Şekil 1' de, zaman çizgisi ve yordamlar bir özetini bildirilir.
Protokol IRST insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.
1. serum toplama ve işleme
- Yaklaşık 5 mL tam kan serum elde etmek için antikoagülan olmadan bir serum tüp toplamak. Kan tüpleri 4 ° C'de işleme kadar korumak.
- Santrifüj tüpleri, 1000 x g 4 ° C'de 15 dakika
- Dikkatle serum 2 mL tüpler içine aktarın.
- Toplama tüp atmak ve hemen süpernatant-80 ° c kadar kullanmak dondurma.
2. plazma toplama ve işleme
- Yaklaşık 10 mL tam kan plazma elde etmek için EDTA ile plazma tüp içinde toplamak. Tüp tamamen doldurmak ve sonra 8 kere tersine çevirin. Kan tüpleri 4 ° C'de işleme kadar korumak.
- Tüp 1800 x g oda sıcaklığında 15 dakika santrifüj hiçbir fren ayarı ile santrifüj kapasitesi.
- Dikkatle plazma üst kısmındaki 2 mL tüpler içine aktarın. En az 1 mL süpernatant beyaz hücre katmanı üzerinde bırakarak transferi, tekrarlayın.
Not: üst kısmındaki süpernatant aktarma hücreleri veya hücre artıkları bulaşma riskini azaltır. - Toplama tüp atmak ve hemen süpernatant-80 ° c kadar kullanmak dondurma.
3. Serum veya plazma DNA izolasyonu
Not: Aşağıdaki adımlarda modifiye ticari iletişim kuralını kullanarak serum veya plazma DNA izolasyonu uygulanmalıdır.
- (0,5 2 mL içeren) bir aliquot serum veya plazma oda sıcaklığında erimek.
- Girdap ve örnek mix ve 0.5 mL serum veya plazma net 1.5 mL tüp içine aktarın. Geri kalan malzeme-80 ° C'de dondurmak
- 50 µL İndinavir k (20 mg/mL) doğrudan örneğine ekleyin.
- 0.5 mL lizis arabelleği için örnek ve de pipetting tarafından karıştırın.
- Tüpler kapatın ve örnekleri 56 ° c ısı blok 15 dk için kuluçkaya.
- % 100 etanol belirtilmiş miktarı yıkama arabellek 1 ve 2, üreticinin yönergelerini tarafından belirtildiği şekilde eklenir.
- Örnekleri geri oda sıcaklığına getirmek ve mutlak etanol 0.5 mL ve de pipetting tarafından karıştırın.
- 650 µL adım 3.7 ayrılık sütun ve 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj elde karışımı ekleyin.
- Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve sütun yeni bir temiz toplama tüp yerleştirin. Adım 3.8 ve 3,9 bir kez daha yineleyin.
- 500 µL yıkama tampon 1, sütun ve 1 dk. için 6.000 x g, santrifüj kenarında ıslatmadan ekleyin.
- Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve eski yerine koymak o ile yeni bir temiz toplama tüp.
- 500 µL yıkama tampon 2, sütun ve 3 dak için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kenarında ıslatmadan ekleyin.
- Aracılığıyla akış içeren tüp atın ve eski yerine koymak o ile yeni bir temiz toplama tüp.
- Herhangi bir kalıntı çamaşır arabellek kaldırmak için 3 dakika için tam hızda (20.000 x g) santrifüj kapasitesi.
- Sütun bir temiz 1.5 mL tüp içine yerleştirin. 150 µL elüsyon arabelleği ekleyin ve bu arabellek sütun ıslatıyor emin olmak için 7 dk. bekleyin.
- 1 dk. için 8000 x g de santrifüj kapasitesi.
- Elute DNA'ın en büyük kurtarma sağlamak 1 dk için tekrar aynı sütun ve santrifüj tam hızda (20.000 x g) içine 3,16 adım pipette.
4. DNA miktar ve seyreltme
- Miktar DNA bir Spektrofotometre kullanarak gerçekleştirin. Örnek 2 µL tezgah üstü Spektrofotometre başına üreticinin yönergelerini kullanın.
Not: Eğer DNA miktar gerçek zamanlı PCR ile devam etmek yeterli değildir (en az 120 ng), yeni bir DNA izolasyon işlemi gerçekleştirin. - DNA için son hacim (yaklaşık 50 µL) tüm gerçek zamanlı PCR yeterli 2.5 ng/µL serum veya plazma sulandırmak.
5. gerçek zamanlı PCR
- Tezcan kopya numarası deneyleri, referans gen tahlil, seyreltilmiş DNA örnekleri ve buzun içinde havuzlu KALİBRATÖRLER. Oda sıcaklığında 4 ° C'de depolanan ana mix equilibrate
- Hedef tahlil, referans gen testin 1 µL ve ana Mix 10 µL 1 µL karışımı her örnek ve KALİBRATÖRLER havuzlu 3 çoğaltır için hazırlar. Negatif kontrol (su) ve 2 ilave örnekler de dahil olmak üzere karışımı hazırlayın.
- 96'plaka, aliquot 12 µL her kuyuya karışımı iyi. Pipet ya da spin tüpleri var.
- Her DNA örneği ve her kuyuya havuzlu KALİBRATÖRLER 8 µL (2.5 ng/µL konsantrasyon) ekleyin. Pipet ya da spin tüpleri var. Her şey için belgili tanımlık uç değiştirin.
Not: 96-şey plaka kullanarak gerçek zamanlı her deneme için 30 DNA örnekleri işlenebilir: 30 x 3 örnekleri + 1 x 3 KALİBRATÖRLER havuza alınan + negatif kontrol 94 =. - Kısaca spin plaka 1000 x g de aşağı.
- Aşağıdaki iletişim kuralını kullanarak plakayı araştırmanı: 40 devredir 15 95 ° C'de 10 dakika, 95 ° C'de sahne tutun s ve 60 ° C için 1 dakika.
6. veri analizi ve yorumu
- Amplifikasyon arsa sonuçları altındaki "seçeneği" bölümünde, analiz ilk hedef gen için 0.2 Ct eşik ayarlayın. Kümedeki her hedef veya başvuru genler için yineleyin. .Txt uzantısı gerçek zamanlı PCR dosyasında dışa aktarmak için araç çubuğu'na "Dışa Aktar" tuşuna basın. Sadece "sonuçlar" Seç bayrak → verilecek veriyi uzantısı .txt → basın "start verme" → yakın dosya türü olarak verme aracını seçin.
- Analiz yazılımı açın ve dosyayı .txt (araç çubuğu → alma) alın.
- Analiz ve araç çubuğu (oyun sembol) tarafından analiz ayarı seçmek için dosya adını seçin.
- Kalibratör örnek ve hedef (Örneğin, 1 AR gen için kopya) kopya bilinen sayısını belirtin. Basın "uygulanır."
- Her örnek için farklı delta Ct (ΔCt) ile karşılaştırıldığında diğer wells ile bir şey atlayın.
- Deney (basın oyun sembol) yeniden çözümle.
- Arsa veya tablo bar kopya sayısıyla sonuçlarını değerlendirmek.
Not: Güven, Z-score ve sonuçları yorumlama için yararlı olabilir analiz çoğaltır gibi çok sayıda parametre sonuçları tablo içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Toplam cfDNA konsantrasyonu ölçülebilir spectrophotometry için tüm örneklerini analiz, 6,12 ng/µL sayılarının gösterilen tarafından (aralığı: 2,00-23.71 ng/µL) serum örnekleri ve 3.21 ng/µL ortancası (aralığı: 2.31 8,49 ng/µL) plazma numuneleri için. Gerçek zamanlı PCR deneyler tarafından Toplam 115 örnekleri analiz ettik.
Test duyarlılık ARve DNA için yüksek veya düşük kazancı da Kalibratör örnekleri kopya numara analiz için kullanılan sağlıklı bağışçılardan hastalardan karışık serum DNA'yı kullanarak değerlendirildi. Şekil 2' de temsil edilen AR CN yeterince DNA %0.375 hastaların sağlıklı donör bir gen kazanç tespit (Şekil 2) elde etmek için DNA ile karışık AR kazancı algılandı. Bu nedenle, bu yaklaşım kopya numarası kazanç çok düşük miktarda algıladı. ΔCt CN deneyleri her hasta için standart sapması hesaplanır (Ortalama ± SD = 0.1, aralığı: 0.00 - 0,36). Biz bir medyan standart sapma değerleri kopya numarası kazanç kesim seçmek için kullanılır.
Biz abiraterone ile tedavi edilen hastaların AR kopya sayısı analiz (n = 53), 16 (% 30,2) hastalar bulma sergilenen AR kazanç7. Benzer şekilde, enzalutamide ile tedavi edilen hastaların AR geni kopya sayı değişimi analiz (n = 59), AR kazanç hastaları821 (% 36) bulma.
Ayrıca, AR CN ve Kaplan-Meier yöntemi kullanılarak klinik sonuçlar arasındaki ilişkiyi değerlendirildi ve günlük sırası ve anlamlı bir ilişki bulunamadı. Özellikle, abiraterone AR gen kazancı olmayan kazandı vakaların 9,5 ay vs 2.8 ortalama ilerleme ücretsiz hayatta kalma (PFS) gösterdi durum serisi hasta tedavi (p < 0.0001). Daha düşük bir genel sağkalım (OS) ayrıca AR CN kazanç olan hastalarda bildirildi (p < 0.0001).
Benzer şekilde, enzalutamide durum serisi için medyan 2.4 4.0 ay vs PFS hastalar vs AR kazanç kazanç ile olan hastalar için bulduk (p 0.0004 =). Ayrıca, AR CN kazanç hastalarda ortanca OS 6.1 14.1 ay kazanç olmayanlar için vs oldu (p = 0,0003). Gerçek zamanlı PCR yaklaşımdan elde tüm AR CN kazanç sonuçları dijital PCR (şekil 3) dahil olmak üzere diğer yöntemlerle teyit edildi.
Şekil 1. İş akışı ve zaman çizelgesi. Yöntem iş akışı farklı adımları ve kez ayrılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. 2 ayrı Havuzu (Örnek 1 ve örnek 2) DNA'ın sağlıklı bağışçılardan ve AR gen için elde CRPC hastalardan kullanarak test AR CN algılama için yaklaşım duyarlılık farklı konsantrasyonlarda karışık. Hasta DNA oranlarda 0.375, 0,75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50 ve 100 toplam DNA açısından, karışık. Kırmızı çizgi: AR CN kazanç (1.5) için kesme. Bu rakam Salvi vd değiştirildi 7
Şekil 3. AR CN sonuçları gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve dijital PCR (dPCR) için birden fazla hastada (x ekseni) arasında karşılaştırma. Siyah çizgi: AR CN kazanç (1.5) için kesme. Bu rakam Salvi vd değiştirildi 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AR Serum ve plazma örnek analizde CN stratifikasyon kastrasyon dayanıklı prostat kanseri (CRPC) hastaların için yeni, non-invaziv bir yaklaşım temsil eder. Son zamanlarda AR CN abiraterone ve enzalutamide, tedavi öncesi ve sonrası kemoterapi7,8,9,10CRPC hastalarda sonuçlar tahmin etmek mümkün olduğunu kanıtlanmıştır.
Bizim yaklaşım en büyük avantajı protokol gerçekleştirmek, çok basit sadece bir DNA izolasyon süreci, bir gerçek zamanlı PCR analiz ve kolay veri yorumlarını oluşan olmasıdır. Ayrıca, test içinde gerçekleştirilen 1 iş günü hızlı olabilir ve ucuz bir yöntemdir ($20 USD her örnek için yaklaşık). Bu yöntem son derece tekrarlanabilir ve elde edilen sonuçlar doğrultusunda bu dijital PCR7,8de dahil olmak üzere daha pahalı ve doğru metotlarından geliyor vardır göstermiştir. Ayrıca, benzer AR kazanmak frekans abiraterone9,10ile tedavi plazma numuneleri üzerinde hedeflenen NGS yaklaşımlarla tespit bulduk. Başka bir önemli avantaj bu yaklaşım esnek ve AR gene önemli bir rolü olan diğer hastalıklar için geçerli olabilir olmasıdır. Ayrıca, diğer hedef ve başvuru genler dayalı hastalık ilgi olarak seçilmiş.
Serumda AR gen analizini CN de bazı sınırlamalar vardır. Birincisi, DNA spektrofotometrik miktar yöntemi kez imprecise ve diğer, daha doğru Fluorometrik yaklaşımlar ile değiştirilebilir. Daha kesin bir miktar daha kesin CN sonuçlar verebilir. İkinci olarak, bazı çalışmalarda serum DNA yerine plazma DNA analiz etmek daha iyi olabileceğini düşündürmektedir. Hücre ücretsiz DNA dolaşımdaki miktarı genellikle beyaz kan hücreleri serum potansiyel tümör özgü DNA analizi için daha kötü bir kaynak olduğunu düşündüren Serumda pıhtılaşma nedeniyle plazma12,13, Serumda yüksek vahşi tipi DNA olası varlığı nedeniyle.
Ya enzalutamide ya da abiraterone ile tedavi başlamadan CN analiz AR gen gerçek zamanlı PCR yaklaşımları kullanarak Serumda 112 CRPC hastalar üzerinde yapılmıştır. Bizim veri gösterdi AR CN cfDNA üzerinde klinik sonuçlar ve direnç abiraterone ve enzalutamide için güçlü bir genetik biyomarker olduğunu ve bir muhtemel anti -AR terapiler üzerinden yararlanabilir erkekler tanımlamak için kullanılan veya hızlı ve düşük maliyetli PCR kullanarak kemoterapi tahlil. Bu bulgular hem erken hem de gelişmiş CRPC tedavi direnç mekanizmaları sorguya minimal invaziv bir yöntem olarak kan eğitim programı vurgulayın. Gelecekte, ileriye dönük ve daha büyük çalışmalar hastaların AR durum klinik sonuçlar ve tedaviye yanıt sonraki farklılıklar görünümünde dolaşan by tabakalaşmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.
Acknowledgments
Biz Chiara Molinari ve Filippo Martignano veri analizi desteği için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
- Salvi, S., et al. Cell-free DNA as a diagnostic marker for cancer: current insights. Onco Targets Ther. 9, 6549-6559 (2016).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B. Circulating tumor DNA as a liquid biopsy for cancer. Clin. Chem. 61 (1), 112-123 (2015).
- Murtaza, M., et al. Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature. 497 (7447), 108-112 (2013).
- Heitzer, E., Ulz, P., Geigl, J. B., Speicher, M. R. Non-invasive detection of genome-wide somatic copy number alterations by liquid biopsies. Mol. Oncol. 10 (3), 494-502 (2016).
- Diaz, L. A. Jr, et al. The molecular evolution of acquired resistance to targeted EGFR blockade in colorectal cancers. Nature. 486 (7404), 537-540 (2012).
- Dawson, S. J., et al. Analysis of circulating tumor DNA to monitor metastatic breast cancer. N. Engl. J. Med. 368 (13), 1199-1209 (2013).
- Salvi, S., et al. Circulating cell-free AR and CYP17A1 copy number variations may associate with outcome of metastatic castration-resistant prostate cancer patients treated with abiraterone. Br. J. Cancer. 112 (10), 1717-1724 (2015).
- Salvi, S., et al. Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer. Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).
- Romanel, A., et al. Plasma AR and abiraterone-resistant prostate cancer. Sci. Transl. Med. 7 (312), (2015).
- Conteduca, V., et al. Androgen receptor gene status in plasma DNA associates with worse outcome on enzalutamide or abiraterone for castration-resistant prostate cancer: a multi-institution correlative biomarker study. Ann Oncol. , (2017).
- Attard, G., Antonarakis, E. S. Prostate cancer: AR aberrations and resistance to abiraterone or enzalutamide. Nat. Rev. Urol. 13 (12), 697-698 (2016).
- Lee, T. H., Montalvo, L., Chrebtow, V., Busch, M. P. Quantitation of genomic DNA in plasma and serum samples: higher concentrations of genomic DNA found in serum than in plasma. Transfusion. 41 (2), 276-282 (2001).
- Chan, K. C., Yeung, S. W., Lui, W. B., Rainer, T. H., Lo, Y. M. Effects of preanalytical factors on the molecular size of cell-free DNA in blood. Clin. Chem. 51 (4), 781-784 (2005).
