Summary
Este manuscrito describe el análisis de variación número de la copia realizado en la DNA del suero o plasma utilizando el método PCR en tiempo real. Este método es adecuado para la predicción de resistencia a medicamentos en pacientes con cáncer de próstata resistente a castración, pero podría ser informativa también para otras enfermedades.
Abstract
Suero y plasma de la célula ADN libre (cfDNA) se ha mostrado como una fuente informativa, no-invasivo de biomarcadores para el diagnóstico de cáncer, pronóstico, seguimiento y predicción de la resistencia al tratamiento. A partir de la hipótesis de que el aumento del número de copias de genes andrógenos receptor (AR) (CN) es un evento frecuente en cáncer de próstata de resistencia de castración metastático (mCRPC), nos proponemos analizar este evento en cfDNA como un biomarcador predictivo potencial.
Se evaluaron AR CN en cfDNA con 2 diferentes ensayos PCR en tiempo real y 2 genes de referencia (RNaseP y hace1). Cantidad de ADN de 60 ng fue utilizado para cada combinación de ensayo. AR Aumento de las CN se confirmó mediante PCR Digital como un método más preciso. Análisis de variación de CN ya ha demostrado para ser informativo para la predicción de la resistencia al tratamiento en el ajuste de mCRPC, pero podría ser útil también para otros fines en diferentes contextos de paciente. Análisis CN en cfDNA tiene varias ventajas: es no invasivo, rápido y fácil de realizar, y se parte de un pequeño volumen de suero o plasma.
Introduction
ADN libre de la célula (cfDNA) en la sangre que circula ha demostrado ser una fuente óptima de biomarcadores para el diagnóstico de cáncer, pronóstico, seguimiento y predicción de tratamiento resistencia1,2. Muchos estudios han demostrado una buena concordancia entre alteraciones del ADN (mutaciones, variaciones de número de copia, las modificaciones epigenéticas en los tejidos) y los que se encuentran en el correspondiente plasma las muestras1, confirmando que circula ADN del tumor (ctDNA) es informativo para el tumor primario y metastático tejido alteraciones3. Así, la posibilidad de estudiar ctDNA permite la reconstrucción de los cambios de genomic y variaciones de número de copia (CNVs) en oncogenes específicos4, identificación de células clonales y subclonal potencialmente metastásicas. CtDNA ha demostrado ser clínicamente útil para el cáncer tratamiento seguimiento alberga mutaciones específicas y CNVs, relacionadas con las terapias dirigidas específicas5,6. También supera la necesidad de biopsias de tejido y permite resultados obtenidos en diferentes momentos durante un tratamiento de cáncer específico de forma no invasiva.
En relación con el cáncer de próstata, una correlación significativa entre la circulación libre de células andrógeno CNVs receptor (AR) y el tratamiento se ha demostrado respuesta a abiraterona y enzalutamide, que indica AR gen número de copia (CN) en cfDNA puede ser un prometedor biomarcador capaz de predecir el tratamiento resistencia7,8,9,10,11. CNVs de genes específicos en ctDNA pueden evaluarse utilizando diferentes enfoques con diferente sensibilidad, costo y rapidez (ej. PCR en tiempo real, Digital y secuenciación de próxima generación).
Aquí describimos un enfoque simple y rápido, basado en ensayos de duplex en tecnología PCR en tiempo real, para la evaluación de la AR CN en cfDNA de de7,de las muestras de suero y plasma8. Se consideraron dos diferentes ensayos PCR diseñados en dos diferentes regiones genómicas dentro del intrón 5 de AR (Xq12) y dos otros genes, como genes de referencia estándar interna sabidos que tiene un estatus de número de copia normal en el cáncer de próstata (RNaseP, situado en 14q11; AGO1, situado en 1 p 34). Se seleccionaron los genes de referencia dos, en lugar de uno, para aumentar la precisión y la sensibilidad de los resultados. Una cantidad de ADN de 60 ng fue amplificado para cada combinación de ensayo (ensayo combinado de AR-assay_1 + RNaseP y de AR-assay_2 + AGO1). Tres muestras de ADN de suero o plasma de varones sanos se agruparon y utilizadas como calibrador. Se consideraron los atajos de > 1.5 para ganancia de AR y < 0.5 para su eliminación. Una de las principales ventajas de este método es que es flexible y que se pueden evaluar también otros genes, cambiando los genes de referencia interna, sobre la base de características y tipo tumoral.
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Protocol
El protocolo consiste en el aislamiento de ADN de muestras de suero o plasma para realizar PCR en tiempo real para el análisis del número de copia. Se realizaron la extracción de ADN, control de la cantidad de ADN (espectrofotómetro) y PCR en tiempo real para objetivos específicos. En la figura 1, se informó un resumen de los procedimientos y la línea de tiempo.
El protocolo sigue las pautas del primer Comité de ética de investigación humana.
1. suero recopilación y el procesamiento
- Recoger aproximadamente 5 mL sangre entera en un tubo de suero sin anticoagulante para obtener suero. Mantener los tubos de sangre a 4 ° C hasta el procesamiento.
- Tubos de centrífuga a 1.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
- Cuidadosamente transfiera suero en tubos de 2 mL.
- Deseche el tubo colector y congelar inmediatamente el sobrenadante a-80 ° C hasta su uso.
2. plasma recopilación y el procesamiento
- Recoger aproximadamente 10 mL sangre entera en un tubo de plasma con EDTA para obtener plasma. Llenar completamente el tubo y luego lo invertir 8 veces. Mantener los tubos de sangre a 4 ° C hasta el procesamiento.
- Centrifugar el tubo a 1.800 x g durante 15 min a temperatura ambiente con ningún ajuste de freno de la centrifugadora.
- Transferir cuidadosamente la parte superior del plasma en tubos de 2 mL. Repetir a la transferencia, dejando al menos 1 mL del sobrenadante por encima de la capa de leucocitos.
Nota: Transferencia de la parte superior del sobrenadante reduce el riesgo de contaminación por células o restos celulares. - Deseche el tubo colector y congelar inmediatamente el sobrenadante a-80 ° C hasta su uso.
3. ADN aislado de suero o Plasma
Nota: Aislamiento de ADN de suero o plasma debe realizarse utilizando el Protocolo comercial modificado en los siguientes pasos.
- Descongelar una alícuota (que contienen de 0,5 a 2 mL) de suero o plasma a temperatura ambiente.
- Vórtice y mezcle la muestra y transferir 0,5 mL de suero o plasma en un tubo de 1,5 mL claro. Congelar el resto de material a-80 ° C.
- Añadir 50 μl de proteinasa k (20 mg/mL) directamente a la muestra.
- Añadir 0,5 mL de tampón de lisis a la muestra y mezclar por pipeteo.
- Cerrar los tubos e incubar las muestras a 56 ° C durante 15 min en el bloque de calor.
- Añadir la cantidad de etanol al 100% en el tampón de lavado 1 y 2, como se indica en las instrucciones del fabricante.
- Traer las muestras a temperatura ambiente y añadir 0,5 mL de etanol absoluto y mezclar por pipeteo.
- Añadir 650 μl de la mezcla obtenida en el paso 3.7 a la columna de la separación y centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto.
- Desechar el tubo que contiene el flujo a través y coloque la columna en un tubo de recogida limpio nuevo. Repita los pasos del 3.8 y 3.9 una vez más.
- Añadir 500 μl de tampón de lavado 1, sin mojar el borde de la columna y centrifugar a 6.000 x g durante 1 minuto.
- Desechar el tubo que contiene el flujo a través y reemplazarlo con un nuevo tubo de recogida limpio.
- Añadir 500 μl de tampón de lavado 2, sin mojar el borde de la columna y centrifugar a máxima velocidad (20.000 x g) durante 3 minutos.
- Desechar el tubo que contiene el flujo a través y reemplazarlo con un nuevo tubo de recogida limpio.
- Centrifugar a máxima velocidad (20.000 x g) durante 3 minutos eliminar cualquier tampón de lavado residual.
- Coloque la columna en un tubo limpio de 1.5 mL. Añadir 150 μL de tampón de elución y esperar 7 minutos para asegurar que eso almacenador intermediario de orina en la columna.
- Centrifugue a 8.000 x g durante 1 minuto.
- Pipetear la elute de paso 3.16 otra vez en la misma columna y centrifugar a máxima velocidad (20.000 x g) durante 1 minuto garantizar la máxima recuperación de ADN.
4. dilución y cuantificación de ADN
- Realizar la cuantificación de ADN utilizando un espectrofotómetro. Utilice 2 μl de muestra en un espectrofotómetro de mesa por las instrucciones del fabricante.
Nota: Si la cantidad de ADN no es suficiente para proceder con la PCR en tiempo real (por lo menos 120 ng), realizar un nuevo proceso de aislamiento de ADN. - Diluir el DNA de suero o plasma a 2,5 ng/μL en un volumen final suficiente para PCR en tiempo real de todo (aproximadamente 50 μL).
5. en tiempo real PCR
- Descongele la copia número ensayos, análisis de genes de referencia, muestras de ADN diluido y calibradores agrupados en hielo. Equilibrar a temperatura ambiente la mezcla principal que se almacena a 4 ° C.
- Preparar una mezcla de 1 μl de análisis objetivo, 1 μl de análisis del gen de referencia y 10 μl de la mezcla principal para 3 repeticiones de cada muestra y calibradores agrupados. Preparar la mezcla como un control negativo (agua) y 2 muestras adicionales.
- En una placa bien 96, alícuota 12 μl de la mezcla en cada pocillo. Hacer tubos no pipeta o spin.
- Añadir 8 μl (concentración de 2,5 ng/μL) de cada muestra de ADN y calibradores agrupados en cada pozo. Hacer tubos no pipeta o spin. Cambiar la punta para cada pozo.
Nota: se pueden procesar 30 muestras de ADN para cada experimento en tiempo real usando la placa de 96 pocillos: muestras de 30 x 3 + 1 x 3 Calibradores combinados + negativo control = 94. - Girar brevemente por la placa a 1.000 x g.
- Ejecutar la placa con el siguiente protocolo: Mantenga etapa a 95 ° C durante 10 min, 40 ciclos a 95 ° C por 15 s y 60 ° C durante 1 minuto.
6. interpretación y análisis de datos
- En la sección "opción", a continuación los resultados de la parcela de amplificación, ajuste el umbral de la Ct en 0.2 para el primer gen del destino analizado. Repetir el conjunto de los genes de cada objetivo o de referencia. Para exportar el archivo en tiempo real de PCR de extensión .txt, pulsar "Exportar" en la barra de herramientas. Bandera sólo "resultados" en la que seleccionar los datos a exportar → elección como tipo de archivo la extensión .txt → prensa "Inicio de la exportación" → cerrar la herramienta de exportación.
- Abra el software de análisis e importar el archivo .txt (barra de herramientas → la importación).
- Seleccione el nombre del archivo a analizar y seleccionar la configuración de análisis por la barra de herramientas (símbolo de juego).
- Especificar la muestra calibrador y el conocido número de copias de la blanco (e.g., 1 copia para el gene de AR ). Pulse "aplicar".
- Para cada muestra, omitir un pozo con diferentes delta Ct (ΔCt) en comparación con otros pozos.
- Volver a analizar el experimento (prensa juego símbolo).
- Evaluar los resultados por el número de copia parcela o la tabla.
Nota: La tabla de resultados contiene numerosos parámetros como confianza, Z-score y repeticiones analizados que podrían ser útiles para la interpretación de resultados.
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Representative Results
Concentración total cfDNA fue cuantificable por espectrofotometría para todas las muestras analizadas, mostrando un nivel medio de 6,12 ng/μl (rango: 23.71 2.00 ng/μL) para las muestras de suero y una media de 3.21 ng/μl (rango: 2.31-8.49 ng/μL) para muestras de plasma. Se analizaron un total de 115 muestras de experimentos PCR en tiempo real.
Sensibilidad de la prueba se evaluó mediante suero mezclado ADN de pacientes con alta o baja ganancia para ARy ADN de donantes sanos, que también se utilizan como muestras de calibrador para el análisis del número de copia. Según lo representado en la figura 2, AR CN se detecta suficientemente en 0.375% de ADN de pacientes con AR ganancia mezclado con donante sano del ADN para obtener una ganancia genética detectable (figura 2). Así, este método detecta una cantidad muy baja de aumento de número de copia. Se calculó la desviación estándar de ΔCt en los ensayos de CN para cada paciente (media ± SD = 0.1, rango: 0.00 - 0,36). Utilizamos una media de los valores de desviación estándar para elegir el corte de aumento de número de copia.
Se analizaron el número de copia de AR en los pacientes tratados con abiraterona (n = 53), encontrando 16 pacientes (30,2%) exhibieron AR ganancia7. Asimismo, se analizó la variación del número de copia para el gene de AR en los pacientes tratados con enzalutamide (n = 59), encontrando aumento de AR en 21 (36%) de los pacientes8.
Además, se evaluó la asociación entre la AR CN y los resultados clínicos mediante el método de Kaplan-Meier y log-rank test y encontró una asociación significativa. En particular, abiraterona series de casos de pacientes tratados con AR gen ganancia demostrada una supervivencia libre de progresión mediana (PFS) de 2.8 vs. 9,5 meses de casos no ganó (p < 0.0001). También se informó de una menor supervivencia global (OS) en pacientes con aumento de las CN de AR (p < 0.0001).
Del mismo modo, para series de casos enzalutamide, encontramos una mediana de SLP de 2.4 vs 4,0 meses para los pacientes con AR ganancia vs pacientes con ninguna ganancia (p = 0.0004). Por otra parte, mediana OS de pacientes con aumento de las CN de AR fue de 6.1 vs 14,1 meses para aquellos sin ganancia (p = 0.0003). Todos los resultados de ganancia de AR CN obtenidos desde el método PCR en tiempo real fueron confirmados mediante otros métodos, incluyendo PCR digital (figura 3).
Figura 1. Línea de tiempo y flujo de trabajo. El flujo de trabajo de método se divide en tiempos y distintas etapas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Sensibilidad de enfoque para la detección de AR CN con 2 diferentes piscinas (muestra 1 y muestra 2) de ADN de donantes sanos y de pacientes CPRP, ganados para el gene de AR , mezclado en diferentes concentraciones. ADN del paciente se mezclaron en porcentajes de 0.375, 0.75, 1.5, 3, 6, 12, 25, 50 y 100, con respecto al ADN total. Línea roja: límite de ganancia AR CN (1.5). Esta figura ha sido modificada desde Salvi et al. 7
Figura 3. AR Comparación de resultados NC entre PCR en tiempo real (qPCR) y PCR digital (dPCR) para varios pacientes (eje x). Negro línea: corte para ganancia de AR CN (1.5). Esta figura ha sido modificada desde Salvi et al. 7
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Discussion
AR Análisis CN en suero y plasma de la muestra representa un nuevo enfoque no invasivo para la estratificación de pacientes con cáncer de próstata resistente a castración (CPRP). Se ha demostrado recientemente que el CN AR es capaz de predecir los resultados en pacientes de CPRP tratados con abiraterona y enzalutamide, antes y después de quimioterapia7,8,9,10.
La principal ventaja de nuestro enfoque es que el protocolo es muy sencillo de realizar, que consiste en sólo un proceso de aislamiento de ADN, un análisis PCR en tiempo real e interpretaciones de datos fácil. Por otra parte, la prueba podría ser rápidamente en 1 día de trabajo, y el procedimiento es barato ($20 USD para cada muestra, aproximadamente). Hemos demostrado que este método es altamente reproducible y los resultados obtenidos están en línea con los que vienen de los métodos más caros y precisos, incluyendo digital PCR7,8. Por otra parte, encontramos una similar AR obtener frecuencia detectada con enfoques específicos de NGS en muestras de plasma tratados con abiraterona9,10. Otra ventaja importante es que este planteamiento es flexible y podría ser aplicable a otras enfermedades en que el gene de AR tiene un papel importante. Además, otros genes de referencia y destino podrían elegirse en base a la enfermedad de interés.
CN el análisis del gene de AR en suero tiene también algunas limitaciones. En primer lugar, el método de cuantificación espectrofotométrica de ADN a menudo es impreciso y podría sustituirse por otros, más precisos métodos fluorométrico. Una cuantificación más precisa podría dar resultados más precisos de la CN. En segundo lugar, algunos estudios han sugerido que podría ser mejor analizar ADN de plasma en lugar de suero ADN. La cantidad de ADN libre de células en circulación es generalmente mayor en suero que en plasma12,13, debido a la coagulación de las células blancas de la sangre en suero, lo que sugiere que el suero es potencialmente una fuente peor para el análisis de la DNA de tumor-específicas debido a la posible presencia de DNA de tipo salvaje.
Análisis CN del gene de AR en suero mediante métodos PCR en tiempo real se ha realizado en 112 pacientes CPRP antes de empezar tratamiento con enzalutamide o con abiraterona. Nuestros datos demostraron que AR CN el cfDNA es un potente biomarcador genético de evolución clínica y resistencia a la abiraterona y enzalutamide y puede utilizarse para identificar a los hombres que podrían beneficiar a priori de las terapias anti -AR o quimioterapia con un ensayo PCR rápido y de bajo costo. Estos resultados ponen de relieve la utilidad de estudiar la sangre como un método mínimamente invasivo para interrogar a mecanismos de resistencia terapéutica de CPRP tanto temprana como avanzada. En el futuro, estudios prospectivos y más grandes deben estratificar a los pacientes por circulación AR estado teniendo en cuenta las siguientes diferencias en los resultados clínicos y respuesta al tratamiento.
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Disclosures
Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Agradecemos a Chiara Molinari y Filippo Martignano apoyo en análisis de datos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer Serum Tubes | Becton Dickinson | 367814 | whole blood tube for serum |
| BD Vacutainer EDTA Tubes | Becton Dickinson | 366643 | whole blood tube for plasma |
| Ethanol absolute | VWR | the user could use also other companies | |
| TaqMan Copy Number assay | Thermo Fisher Scientific | 4400291 | Pre-designed and validated assays with FAM-dye. We used the followig assay: AR_assay1: hs04107225 adn AR_assay2: hs04511283 |
| TaqMan Copy Number assay (modified) | Thermo Fisher Scientific | 4467084 | Pre-designed assay modified with VIC-dye: AGO1: Hs02320401_cn |
| TaqMan Copy Number Reference Assay, human, RNase P | Thermo Fisher Scientific | 4403326 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4326708 | Master mix for Real Time PCR |
| QIAamp DNA Mini Kit (50) | Qiagen | 51304 | DNA extraction kit |
| MicroAmp 96-Well Plates | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | plates for realt time PCR |
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | - | the user could use also other spectrophotometric methods to quantify DNA |
| 7500 Fast Real-Time PCR System | Applied Biosystem | - | the user could use also other real time instrument |
| CopyCaller Software | Applied Biosystem | - | Software for copy number analysis |
References
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