Summary
हम अस्थि मज्जा कोशिकाओं और BSA फैटी एसिड conjugates तैयार करने के लिए एक सरल विधि से murine प्राथमिक मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए एक सीधे आगे की विधि उदाहरण देकर स्पष्ट करना । तो फिर हम प्रदर्शन कि संतृप्त फैटी एसिड macrophage कोशिका मौत पैदा कर सकते हैं, और इस तरह के सेल मौत सकारात्मक ceramide के स्तर के सेलुलर संचय के साथ जुड़ा हुआ है ।
Abstract
मैक्रोफेज अत्यधिक एक्सप्रेस एपिडर्मल फैटी एसिड-बाइंडिंग प्रोटीन और वसा फैटी एसिड-बाइंडिंग प्रोटीन । वे सक्रिय रूप से ले संतृप्त और unसंतृप्त फैटी एसिड होता है, जो उनकी प्रतिरक्षा कार्यों को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । कई अध्ययनों से पता चला है कि विभिंन फैटी एसिड, संतृप्त या unसंतृप्त, सेल विकास और समारोह पर विभिंन प्रभावों के अधिकारी हो सकता है । हालांकि, फैटी एसिड की तैयारी के लिए इस्तेमाल किया दृष्टिकोण बदलती हैं, जो गैर शारीरिक परिणाम के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । सीरम एल्ब्युमिन, स्तनधारी परिधीय रक्त में फैटी एसिड के लिए एक प्राकृतिक वाहक, फैटी एसिड की सोडियम नमक के साथ एक संयुग्म जटिल बनाने के लिए सिफारिश की है स्तनधारी कोशिकाओं में फैटी एसिड समारोह का अध्ययन, इस प्रकार फैटी एसिड साबुन की विषाक्तता को कम करने । इस प्रकार, एक सरल, अपेक्षाकृत त्वरित हीटिंग और sonicating विधि विकसित की है और यहां BSA-फैटी एसिड संयुग्म गठन के लिए प्रस्तुत किया । हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन संतृप्त फैटी एसिड का उपयोग, विशेष रूप से stearic एसिड माउस अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज में गंभीर कोशिका मौत पैदा करने के लिए । हम आगे कि संतृप्त फैटी एसिड प्रेरित कोशिका मृत्यु सकारात्मक संचित सेलुलर ceramide के स्तर के साथ जुड़ा हुआ है कि प्रदर्शन करते हैं । इस विधि अंय स्तनधारी कोशिकाओं पर फैटी एसिड के प्रभाव के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है ।
Introduction
फैटी एसिड ऊर्जा चयापचय में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है और कोशिकाओं के विभिंन प्रकार में झिल्ली फॉस्फोलिपिड के संश्लेषण में । फैटी एसिड एक कम जलीय घुलनशीलता है । फैटी एसिड की उचित तैयारी स्तनधारी कोशिकाओं में फैटी एसिड के जैविक कार्यों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है । जब फैटी एसिड इथेनॉल के साथ तैयार कर रहे हैं, कई फैटी एसिड होता है उनके विषाक्त साबुन (डिटर्जेंट) कोशिका झिल्ली पर प्रभाव, यहां तक कि अपेक्षाकृत कम सांद्रता1पर दिखा सकते हैं । सीरम में मुक्त फैटी एसिड के लिए एक प्राकृतिक, प्रमुख ट्रांसपोर्टर के रूप में, सीरम एल्ब्युमिन फैटी एसिड समारोह परख2,3,4के लिए इन विट्रो में फैटी एसिड वितरण के लिए एक अच्छा वाहक माना जाता है । हालांकि, फैटी एसिड और सीरम एल्ब्युमिन संयुग्म की तैयारी का ब्यौरा आमतौर पर उपलब्ध नहीं है, भले ही कई शोध पत्र फैटी एसिड का उपयोग कर प्रकाशित किया गया है ।
मैक्रोफेज अत्यधिक एक्सप्रेस एपिडर्मल फैटी एसिड-बाध्यकारी प्रोटीन और वसा फैटी एसिड-बाइंडिंग प्रोटीन5,6,7,8. वे सक्रिय रूप से ले संतृप्त और संतृप्त फैटी एसिड होता है जो उनकी प्रतिरक्षा कार्यों को विनियमित कर सकते हैं । मैक्रोफेज और अंय कोशिकाओं पर फैटी एसिड के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, फैटी एसिड की तैयारी के विभिंन तरीकों1,7,9लागू किए गए थे । macrophage फ़ंक्शन पर फैटी एसिड के प्रभाव की जांच करने के लिए उपयुक्त रूप से तैयार फैटी एसिड/सीरम एल्ब्युमिन conjugates का उपयोग करना जैविक रूप से सार्थक डेटा प्राप्त करने में महत्वपूर्ण महत्व रखता है । macrophage समारोह पर फैटी एसिड के प्रभाव पर अध्ययन बुनियादी ज्ञान और संभावित चिकित्सीय macrophage-शामिल रोगों में फैटी एसिड चयापचय से संबंधित लक्ष्य प्रदान कर सकते हैं ।
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Protocol
- Euthanize एक 6-से 8 सप्ताह पुराने, स्वस्थ जंगली प्रकार माउस का उपयोग सह 2 । यह एक फोम बोर्ड को नीचे पिन और यह ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे जब तक यह लथपथ है । टिबिया/फीमर हड्डियों को संदंश और कैंची से हटा दें । उन्हें 5 एमएल 1x फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) के साथ एक पेट्री डिश में डाल दिया । सभी प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के अंतर्गत निष्पादित करें ।
- कट एक बाँझ ऊतक संस्कृति हूड में एक कैंची के साथ टिबिया/फीमर की हड्डी के दोनों सिरों को खोलने. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में पंजाब + 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ एक 25 ग्राम सुई के साथ हड्डी फ्लश ।
- ५०० x g पर अस्थि मज्जा कोशिकाओं केंद्रापसारक, 4 & #176; C 5 min. के लिए
- 1 मिलीलीटर लाल रक्त कोशिका lysis बफर के लिए लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) से कम 1 min. 9 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ तुरंत पतला करने के लिए सेल गोली reसस्पेंड । १.३ चरण में के रूप में फिर से केंद्रापसारक । supernatants.
- 10 मिलीलीटर 1x पंजाब में सेल गोली reसस्पैंड, एक बाँझ के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर ४० & #956; m & #160; एक और 15 मिलीलीटर ट्यूब में नायलॉन जाल सेल मलबे को हटाने के लिए/ १.३ में के रूप में फिर से केंद्रापसारक । supernatants.
- 15 एमएल रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टीट्यूट मीडियम (RPMI) १६४० में 5% FBS और 10 & #956 के साथ सेल गोली reसस्पेंड; जी/एमएल gentamicin, प्लेट एक १००-mm ऊतक संस्कृति डिश में ३७ ओ सी मशीन में कोशिकाओं ६० मिनट के लिए । धीरे से पकवान घूमता है, बाहर ले खाक कोशिकाओं, और उंहें गिनती ।
- प्लेट 6x10 6 कोशिकाओं में एक १०० मिमी डिश के साथ 12 मिलीलीटर macrophage अंतर मीडिया (RPMI १६४० के साथ 5% FBS और 10 & #956; g/ml gentamicin, 30% L929 कंडीशन्ड मीडिया < सुप क्लास = "xref" > 10 ) के साथ मिलाकर 10 एनजी/एमएल संयोजक माउस macrophage के साथ 2 दिनों के लिए कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (एम-सीएसएफ)
- में 2 दिनों के लिए संवर्धन के बाद ३७ & #176; सी मशीनर 5% कं 2 के साथ, प्रत्येक डिश के साथ 6 मिलीलीटर ताजा macrophage अंतर मीडिया के साथ फ़ीड 10 एनजी/ 5 दिन पर
- , पुराने मीडिया के 8 मिलीलीटर बाहर कोशिकाओं परेशान बिना बाहर ले और 10 मिलीलीटर ताजा macrophage 10 एनजी/ के साथ मीडिया अंतर जोड़ने
- पर 7 दिन, फसल अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMDMs) एक सेल लिफ्टर का उपयोग कर ।
नोट: संलग्न मैक्रोफेज भी 5 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ दो बार फ्लोट सेल और वाशिंग प्लेट को हटाने के बाद 5 से 10 मिनट के लिए 1x पंजाब में 5 मिलीलीटर 1 मिमी EDTA के साथ असंबद्ध जा सकता है । के रूप में चरण १.३., में उंहें ताजा macrophage अंतर मीडिया में reसस्पेंड, और उंहें एक hemocytometer के साथ गिनती कोशिकाओं केंद्रापसारक ।- पुि BMDMs & #39; phenotype द्वारा प्रवाह cytometry बताए गए < सुप class = "xref" > 5 . निंनलिखित अध्ययनों के लिए एक निश्चित एकाग्रता में व्युत्पंन माउस मैक्रोफेज तैयार करें ।
- बाँझ पंजाबियों में 2 मिमी BSA तैयार करते हैं । उदाहरण के लिए, वजन ६.६५ g BSA, भंग करने के लिए 30 एमएल 1x पंजाबियों जोड़ें, तो ५० मिलीलीटर तक अधिक पंजाबियों जोड़ने के लिए, स्केलिंग घटकों 1x पंजाब में 2 मिमी BSA बनाने के लिए ।
- 2 मिमी BSA में फैटी एसिड के 5 मिमी व्यक्तिगत सोडियम नमक तैयार करते हैं । ३७ के लिए हीट & #176; सी या उच्चतर, यदि आवश्यक हो, और एक स्पष्ट समाधान प्राप्त होने तक फैटी एसिड के 2 मिमी BSA और सोडियम नमक का मिश्रण sonicate.
नोट: unसंतृप्त फैटी एसिड की तुलना में, संतृप्त फैटी एसिड एक उच्च तापमान और अधिक sonication समय भंग करने के लिए की जरूरत है । - फ़िल्टर फैटी-एसिड-BSA समाधान के माध्यम से एक ०.२२ & #956; मी फिल्टर, aliquot यह १.५ मिलीलीटर बाँझ microcentrifuge ट्यूबों में, और उन पर स्टोर 4 & #176; c अल्पावधि उपयोग के लिए या at-20 & #176; c लॉन्ग टर्म स्टोरेज के लिए । फ्रिज में 4 & #176; C पर भंडारण के बाद कोई वर्षा नहीं होना चाहिए ।
- प्लेट एक 24-well टिशू कल्चर प्लेट में BMDMs के साथ ०.४ x 10 6 /mL में macrophage अंतर मीडिया.
- ०.४ मिमी palmitic एसिड और stearic एसिड के साथ कोशिकाओं के इलाज के लिए एक ३७ & #176 पर 16 से 24 ज; सी मशीन के साथ 5% कं 2 । नकारात्मक नियंत्रण के रूप में BSA का उपयोग करें ।
- उपचार के बाद एक सेल लिफ्टर के साथ कोशिकाओं को फसल और ५०० x g पर कोशिकाओं नीचे स्पिन, 4 & #176; C for 5 min.
- दाग Annexin v-Alexa ४८८ और 7-aminoactinomycin D (7-AAD) के साथ कोशिकाओं १०० & #956; एल Annexin V बाध्यकारी बफर के लिए 15 मिनट कमरे के तापमान पर ।
- २०० & #181 के साथ नमूना पतला; annexin-बाध्यकारी बफर के एल, धीरे मिश्रण है, तो गर्मी की अवधि के बाद बर्फ पर नमूने रखने के लिए ।
- प्रवाह द्वारा जितनी जल्दी हो सके दाग कोशिकाओं का विश्लेषण करें cytometry < सुप वर्ग = "xref" > ५ . Annexin V-Alexa ४८८ FITC चैनल में पाया जाता है और 7-AAD PerCP/PerCP-cy 5.5 चैनल में पाया जाता है ।
- फैटी एसिड उपचार के बाद, ३.३ चरण में के रूप में कोशिकाओं फसल । फिर 30 min. के लिए 4% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक करें
- 1 मिलीलीटर 1x पंजाबियों के साथ नमूना धो, ३.३ में कदम के रूप में नीचे स्पिन, और supernatant. नहीं कर सकते
- विरोधी ceramide प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं दाग (1:200 कमजोर पड़ने) १०० & #956 में; एल 1x permeabilization बफर के लिए 30 min.
- धो और स्पिन फिर से नीचे के रूप में चरण ४.२.
- विरोधी माउस के साथ कोशिकाओं दाग आईजीएम माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500 कमजोर पड़ने) १०० & #956 में; एल 1x permeabilization बफर के लिए 30 min.
- के रूप में चरण ४.२ में फिर से धो और स्पिन कोशिकाओं को फिर से । Add २५० & #956; L 1x पंजाबियों और प्रवाह द्वारा सना हुआ कोशिकाओं का विश्लेषण cytometry < सुप वर्ग = "xref" > ५ .
नोट: विस्तृत एजेंट सूची में उपकरण और एजेंट की तालिका देखें ।
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Representative Results
मोटापा सीरम में मुक्त फैटी एसिड सांद्रता बढ़ जाती है । पेशेवर फ़ैगोसाइट के रूप में, मैक्रोफेज सक्रिय रूप से ऊपर फैटी एसिड लेने के लिए मेजबान homeostasis बनाए रखने के । इन प्रक्रियाओं के दौरान, अतिभारित लिपिड macrophage कोशिका मृत्यु के लिए प्रेरित हो सकता है । इस अंत करने के लिए, हम आहार फैटी एसिड के मोटापे से ग्रस्त स्तर के साथ इन विट्रो में BMDMs कल्चरित और प्रवाह cytometric धुंधला का उपयोग कर macrophage कोशिका मौत मापा । BSA नियंत्रण की तुलना में, संतृप्त फैटी एसिड, विशेष रूप से stearic एसिड में, BMDMs की महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु प्रेरित । मृत कोशिकाओं डबल सकारात्मक Annexin वी और 7-AAD (चित्र 1a-बी) से सना हुआ आबादी के रूप में दिखाया गया था । नोट की, unसंतृप्त फैटी एसिड महत्वपूर्ण macrophage कोशिका मृत्यु5प्रेरित नहीं किया । डेटा vivo मेंनि: शुल्क संतृप्त फैटी एसिड के स्तर में वृद्धि के विषाक्त प्रभाव का सुझाव ।
इसी प्रकार, एक macrophage सेल लाइन जिसका व्यवहार्यता या तो palmitic एसिड या stearic एसिड5के उपचार के लिए अतिसंवेदनशील था का उपयोग कर, हमने पाया है कि मैक्रोफेज ' palmitic एसिड प्रेरित कोशिका मृत्यु को संवेदनशीलता भी कोशिकाओं की संख्या से प्रभावित था संस् कृति (चित्र 2a) । सीधे शब्दों में कहें, एक ही सांस्कृतिक स्थितियों के तहत, कुओं में अधिक मैक्रोफेज, फैटी एसिड से प्रेरित कम कोशिका मौत । इसके अलावा, palmitic एसिड प्रेरित सेल मौत सकारात्मक सेलुलर ceramides के संचित स्तर (चित्रा बीसी) के साथ जुड़ा हुआ था । जब मैक्रोफेज एक उच्च घनत्व हालत में संस्कृति थे, मध्यम पोषक तत्वों तेजी से ऊर्जा चयापचय के लिए समाप्त हो गए थे, इन कोशिकाओं को कम palmitic एसिड प्रेरित कोशिका मौत के लिए अतिसंवेदनशील थे मैक्रोफेज एक कम घनत्व हालत में संस्कृति की तुलना में । इसके विपरीत, जब कोशिकाओं को एक पोषक तत्व समृद्ध हालत (जैसे, मोटापा) को उजागर किया गया, अतिरिक्त फैटी एसिड विषाक्त ceramides का उत्पादन करने के लिए metabolized जा सकता है, जिससे फैटी एसिड प्रेरित कोशिका मौत के लिए अग्रणी । इस प्रकार, कोशिका सांस्कृतिक स्थितियों संतृप्त फैटी एसिड प्रेरित कोशिका मौत के परिणामों के लिए भिंनता ला सकता है ।
चित्रा 1: फैटी एसिड की उच्च एकाग्रता, विशेष रूप से stearic एसिड, macrophage कोशिका मौत प्रेरित । BMDMs (7 दिवस) ०.४ x 106/mL के रूप में ताजा macrophage अंतर मीडिया में चढ़ाया गया । ०.५-1 एच के लिए सेल लगाव के बाद, BMDMs 24 एच मीडिया अकेले और BSA नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया के लिए प्रत्येक फैटी एसिड के नामित एकाग्रता के साथ इलाज कर रहे थे । उपचार के बाद, कोशिकाओं को उठा लिया और काटा गया था, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए ५०० ग्राम में नीचे घूमती है । कोशिकाओं 7-AAD और Annexin V Alexa ४८८ में १०० μL Annexin-15 मिनट के लिए बाध्यकारी बफर के साथ दाग थे । फिर प्रवाह cytometry विश्लेषण करने से पहले प्रत्येक नमूने के लिए एक और २०० μL annexin-बाइंडिंग बफ़र जोड़ें । (क) फैटी एसिड द्वारा प्रेरित कोशिकाओं के प्रवाह cytometry डेटा का प्रदर्शन. (ख) फैटी एसिड द्वारा प्रेरित कोशिका मृत्यु का सारांश । त्रुटि पट्टी नमूना SD का प्रतिनिधित्व करता है । सेल palmitic एसिड (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) और विशेष रूप से stearic एसिड (एसए) द्वारा प्रेरित मौत सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है BSA है नियंत्रण की तुलना में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: मीडिया पोषक तत्वों की उपलब्धता प्रभावों मैक्रोफेज ' palmitic एसिड प्रेरित सेल मौत को संवेदनशीलता । (क) कोशिका पोषण स्थिति संतृप्त फैटी एसिड प्रेरित तनाव के लिए अपनी सहिष्णुता प्रभावों । (ख) कोशिका संवेदनशीलता को संतृप्त फैटी-एसिड प्रेरित कोशिका मृत्यु अत्यधिक ceramide के संचित सेलुलर स्तर के साथ संबंधित है । मीडिया पोषक तत्व ढाल 1m, 2 एम, 4M और 8M पर जंगली प्रकार macrophage सेल लाइन संवर्धन द्वारा प्राप्त किया गया था (M = 1x106) 6 मिमी पेट्री व्यंजन के साथ 6 मिलीलीटर RPMI १६४० के साथ 5% FBS और 10 μg/एमएल gentamicin के लिए 18 hr. मीडिया का रंग अधिक मात्रा में पोषक तत्वों की वजह से अधिक पीला होता है जब अधिक से अधिक संख्या में कोशिकाएं व्यंजन में कल्चर्ड होती हैं । कोशिकाओं के ९०% से अधिक अभी भी बहुत व्यवहार्य हैं । संलग्न व्यवहार्य कोशिकाओं pipetting द्वारा 5 मिनट के लिए पंजाब में बैठने के बाद और फिर से हटा दिया गया 0.2 x106/mL में ताजा मीडिया में 24 अच्छी तरह से प्लेटों में तुरंत संस्कृति । कोशिकाओं को 18 एच के लिए ०.४ mM palmitic एसिड के साथ तुरंत इलाज किया गया प्रत्येक स्रोत (कोशिकाओं के पोषक ढाल) के लिए नियंत्रण के रूप में BSA का उपयोग कर । फिर सभी इलाज कोशिकाओं को काटा गया और 7 के साथ दाग-सेल मौत के लिए AAD या intracellular ceramide के साथ दाग । सहज कोशिका मृत्यु (७-AAD +) प्रतिशत ८.६ से कम थी. उपचार विशिष्ट कोशिका मृत्यु 7 में% अंतर के रूप में अनुमान लगाया गया था-AAD + उपचार और अपने स्वयं के BSA नियंत्रण के बीच (a)। उपचार विशिष्ट ceramide स्तर का अनुमान प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) उपचार और अपने स्वयं के BSA नियंत्रण के बीच अंतर के रूप में किया गया था (b)। यह प्रयोग दोहराया गया था, और प्रतिनिधि डेटा प्रस्तुत कर रहे हैं । त्रुटि पट्टी का प्रतिनिधित्व करता है नमूना SD. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
फैटी एसिड समाधान की उचित तैयारी महत्वपूर्ण महत्व की है फैटी एसिड के जैविक समारोह का अध्ययन । फैटी एसिड के बेअसर जलीय समाधान में अपनी घुलनशीलता बढ़ जाती है । हालांकि, फैटी एसिड की सोडियम लवण, विशेष रूप से संतृप्त फैटी एसिड, पानी या पंजाब में कम घुलनशीलता की अभी भी कर रहे है के रूप में हम मनाया । एक विधि के लिए ९५-१००% इथेनॉल का उपयोग करने में मदद फैटी एसिड1भंग है । इस विधि का उपयोग करना, कोशिकाओं को उच्च विषाक्तता कम विषाक्त unसंतृप्त फैटी एसिड के लिए कम सांद्रता पर भी मनाया जा सकता है । एक अंय तरीका है फैटी एसिड समाधान तैयार करने के लिए एक वितरण प्रणाली के रूप में मिथाइल-β-cyclodextrin का उपयोग इतना है कि फैटी एसिड इष्टतम स्थिति है, उनके monomeric रूप में समाधान में शेष9,11। फैटी ऐसी विधि के साथ तैयार एसिड के लिए सामांय कार्य किया है, लेकिन विधि का आयोजन जटिल है दिखाई दिया । कोशिका वृद्धि पर मिथाइल-β-cyclodextrin का प्रभाव यह है कि उच्च एकाग्रता कोशिका मृत्यु12के लिए नेतृत्व कर सकता है । संतृप्त stearic और palmitic एसिड के लिए, एक उच्च तापमान (६० ओसी) solubilization के साथ मदद करने के लिए प्रयोग किया जाता है9.
के बाद से सीरम एल्ब्युमिन extracellular द्रव में एक प्रमुख फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन है, जो लसीका और संवहनी प्रणालियों में फैटी एसिड के परिवहन में एड्स, यह फैटी एसिड के कार्यात्मक अध्ययन के लिए प्राकृतिक वाहक के रूप में इष्ट है । जलीय समाधान में फैटी एसिड नमक की कम घुलनशीलता से बचने के लिए, sonication बहुत BSA के साथ फैटी एसिड की विकार की सुविधा होगी, इस प्रकार फैटी एसिड solubilization में सहायता । यह अधिक समय लगता है (घंटे) के लिए संतृप्त फैटी एसिड से संतृप्त फैटी एसिड की मात्रा और एकाग्रता की एक ही राशि के साथ (30 मिनट) solubilize । हालांकि हीटिंग और sonication BSA-फैटी एसिड विकार के लिए महत्वपूर्ण हैं, एक उच्च तापमान (कम से ५० oC) प्राप्त करने के लिए सुझाव दिया है स्पष्ट BSA-PA, BSA-SA संयुग्म समाधान, और एक कम तापमान दृढ़ता से solubilizing के लिए अनुशंसित है संतृप्त फैटी उच्च तापमान पर ऑक्सीकरण के लिए अपनी संवेदनशीलता के कारण एसिड होता है । BSA के लिए फैटी एसिड की 5:2 दाढ़ अनुपात 3:1 या 6:1 दाढ़ अनुपात है कि7प्रकाशित किया गया था की तुलना में अच्छा माना जाता है । यह कम पूरी तरह से फैटी एसिड साबुन की विषाक्तता से बचने के समाधान में मुक्त फैटी एसिड सुनिश्चित कर सकते हैं । BSA-फैटी एसिड इस तरह से तैयार करने के लिए स्थिर समाधान दिखाई देते है (कोई वर्षा नहीं, ंयूनतम पर) 4 डिग्री सेल्सियस से कम 3 महीने के रूप में macrophage कोशिका मृत्यु पर उनकी कार्यक्षमता में दिखाया गया है । ट्यूब की टोपी सील अगर तैयार फैटी एसिड के लिए समय की एक लंबी अवधि के लिए इस्तेमाल किया जा नहीं कर रहे हैं ।
जब BSA का स्पष्ट समाधान-पंजाब में फैटी एसिड प्राप्त होता है, फैटी एसिड उपचार से सुसंगत परिणाम अधिक होने की संभावना है । हालांकि, भूख से मर और अच्छी तरह से खिलाया मैक्रोफेज फैटी एसिड उपचार के लिए काफी अलग जवाब, विशेष रूप से संतृप्त फैटी एसिड होता है । अधिक पोषक तत्वों के साथ मैक्रोफेज और भूख से मर या भूखे लोगों की तुलना में संतृप्त फैटी एसिड प्रेरित कोशिका मृत्यु के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, क्योंकि कोशिकाओं चयापचय अपने अस्तित्व और विकास के अनुरोध के कारण संतृप्त फैटी एसिड detoxify कर सकते हैं । ऐसे सेल मौत अत्यधिक संचित सेलुलर ceramide स्तरों के साथ जुड़ा हुआ है । ध्यान रहे, ceramide विषाक्तता तभी होती है जब intracellular ceramide का स्तर एक निश्चित सीमा तक पहुँच जाता है. फैटी एसिड इलाज मैक्रोफेज या कोशिकाओं के किसी भी अंय प्रकार से सुसंगत परिणाम सुनिश्चित करने के लिए, कोशिकाओं को बहुतायत पोषक तत्वों के साथ ताजा मीडिया के साथ संस्कृति होना चाहिए । किसी भी उप-इष्टतम कक्ष संस्कृति शर्तों उप-इष्टतम डेटा में परिणाम हो सकता है ।
कुल मिलाकर, इन प्रोटोकॉल अंय प्रयोगशालाओं द्वारा मैक्रोफेज पर फैटी एसिड के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए बहुत जरूरत विवरण प्रदान करते हैं । अंय तरीकों की तुलना में, यह सीधा दृष्टिकोण इथेनॉल की तरह एक अतिरिक्त विलायक का उपयोग कर के बिना BSA-फैटी एसिड conjugates उत्पंन करता है । sonication गर्मी उत्पन्न करता है और यह तापमान को नियंत्रित करने के लिए कठिन है, क्योंकि सबसे चुनौतीपूर्ण कदम सटीक, स्थिर BSA फैटी एसिड समाधान तैयार करने के लिए है । सौभाग्य से, unसंतृप्त फैटी एसिड के लिए एक कम समय में तैयार है और स्थिर रहना आसान कर रहे हैं, जबकि संतृप्त फैटी एसिड के लिए अपेक्षाकृत उच्च तापमान खड़े दिखाई देते हैं, क्योंकि वे संतृप्त और ऑक्सीकरण के लिए प्रतिरोधी रहे है ऐसी हालत में । अब तक, हम किसी भी मुद्दे या BSA के साथ सीमा-फैटी एसिड conjugates इस तरह तैयार नहीं देखा है । हमारे प्रोटोकॉल का संशोधन आवश्यक होगा यदि अधिक संवेदनशील प्रयोगों की जरूरत है ।
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Disclosures
लेखक ब्याज की कोई वित्तीय संघर्ष की घोषणा ।
Acknowledgments
यह काम आंशिक रूप से विश्वविद्यालय के Louisville स्टार्ट-अप फंड और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (बेथेस्डा, एमडी) अनुदान R01CA177679, R01CA180986 द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CPX Ultrasonic Bath | Bransonic | Model 2800 | |
| Sodium palmitate (PA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1109 | M.W. 278 |
| Sodium stearate (SA) | Nu-Chek Prep, Inc. | S-1111 | M.W. 306 |
| Bovine serum albumin (BSA), fatty acid-free | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Mouse macrophage colony stimulating factor (mM-CSF) | Cell Signaling Technology, Inc. | 5228 | |
| RPMI 1640 | VWR International | 71002-878 | |
| Annexin V, Alexa Fluor 488 conjugate | Fisher Scientific | A13201 | |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Monoclonal anti-ceramide antibody (mouse IgM) | Sigma | C8104-50TST | Clone: MID 15B4 |
| Goat Anti-Mouse IgM Antibody, µ chain, FITC conjugate | Sigma | AP128F | |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | |
| Permeabilization buffer | Ebioscience | 4307693 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Sigma | 11814389001 | |
| Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | |
| L929 cells | ATCC | CCL-1 | |
| Corning Cell Lifter | Fisher Scientific | 07-200-364 | |
| Note: M.W. is for molecular weight. |
References
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