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Biology

Arabidopsis बीजों के उच्च प्रवाह नसबंदी के लिए मानकीकृत विधि

Published: October 17, 2017 doi: 10.3791/56587
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 1
1Arabidopsis Biological Resource Center, Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University, 2Department of Molecular Genetics, Center for Applied Plant Sciences, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन का उद्देश्य बाँझ मीडिया पर उगाए गए Arabidopsis पादी की श्रेणी के बीजों के अंकुरण पर ब्लीच और क्लोरीन गैस नसबंदी के प्रभाव का निर्धारण करना था. संतोषजनक बीज उत्तरजीविता प्रदान करते हुए माइक्रोबियल संदूषणों के विकास को रोकने के लिए अनुकूलित नसबंदी प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं ।

Abstract

Arabidopsis थालियाना (Arabidopsis) अंकुर प्रायः बाँझ मीडिया पर उगाए जाने की आवश्यकता है. इस बीज की सतह पर मौजूद माइक्रोबियल दूषित पदार्थों की वृद्धि को रोकने के लिए पूर्व बीज नसबंदी की आवश्यकता होती है । वर्तमान में, Arabidopsis बीज शर्तों में दो अलग नसबंदी तकनीक है कि प्रयोगशालाओं के बीच थोड़ा अलग और मानकीकृत नहीं किया गया है का उपयोग कर निष्फल रहे हैं, अक्सर केवल आंशिक रूप से प्रभावी नसबंदी या अत्यधिक बीज मृत्यु दर में जिसके परिणामस्वरूप । इन विधियों में से अधिकांश भी आसानी से विविध पादी के बीज लाइनों की एक बड़ी संख्या को स्केलेबल नहीं हैं । Arabidopsis के उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए प्रौद्योगिकियों के रूप में पैदा के लिए जारी, विभिंन पादी के बीजों की बड़ी संख्या में बंध्याकरण के लिए मानकीकृत तकनीक प्रयोगों के इन प्रकारों के संचालन के लिए आवश्यक होते जा रहे हैं । दो अलग नसबंदी तकनीकों के लिए Arabidopsis लाइनों के एक नंबर की प्रतिक्रिया बीज अंकुरण दर और रोगाणुओं और अन्य रोगजनकों के साथ बीज संदूषण के स्तर के आधार पर मूल्यांकन किया गया था । उपचार Arabidopsis बीज नसबंदी के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए संयुक्त, एजेंटों और जोखिम के समय बंध्याकरण के विभिन्न सांद्रता शामिल थे । अनुकूलित प्रोटोकॉल दो अलग नसबंदी विधियों के लिए विकसित किया गया है: ब्लीच (तरल-चरण) और क्लोरीन (सीएल2) गैस (वाष्प चरण), दोनों उच्च बीज अंकुरण दर और कम माइक्रोबियल संदूषण में जिसके परिणामस्वरूप । इन प्रोटोकॉल की उपयोगिता अंकुरण क्षमता की एक सीमा के साथ दोनों जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती बीज के परीक्षण के माध्यम से सचित्र था । हमारे परिणाम बताते है कि बीज प्रभावी रूप से अत्यधिक बीज मृत्यु दर के बिना या तो विधि का उपयोग कर निष्फल किया जा सकता है, हालांकि नसबंदी के हानिकारक प्रभाव इष्टतम अंकुरण क्षमता से कम के साथ बीज के लिए मनाया गया । इसके अलावा, एक समीकरण के लिए शोधकर्ताओं ने विभिंन आकारों के वाटरप्रूफ कंटेनरों को मानकीकृत क्लोरीन गैस नसबंदी शर्तों को लागू करने के लिए सक्षम विकसित किया गया था । प्रोटोकॉल यहां वर्णित Arabidopsis लाइनों की एक बड़ी संख्या के लिए आसान, कुशल, और सस्ती बीज नसबंदी की अनुमति देते हैं ।

Introduction

Arabidopsis थालियाना (Arabidopsis) संयंत्र जीव विज्ञान1,2,3में बुनियादी और अनुप्रयुक्त अनुसंधान के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव है । जबकि Arabidopsis वृद्धि के लिए मानक शर्तों को अच्छी तरह से स्थापित किया गया है4, बीज व्यवहार्यता पर बीज नसबंदी के प्रभाव का कड़ाई से परीक्षण नहीं किया गया है । प्लेटों या बक्से में ठोस मीडिया नियमित रूप से एक अलग आबादी में homozygous घातक म्यूटेंट की पहचान के रूप में कई प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए Arabidopsis अंकुर के विकास की सुविधा के लिए प्रयोग किया जाता है, जल्दी में गोली मार और जड़ phenotypes का अवलोकन चरणों, रोगज़नक़ के अलगाव मुक्त ऊतक, अंकुरित ऊतक की बड़ी मात्रा का संग्रह, transformants या दवा प्रतिरोधी पौधों का चयन और अंकुरण के मूल्यांकन1,2,3,4 . एक ग्रीनहाउस या विकास चैंबर में उगाया पौधों से काटा बीज कभी-कभार सूक्ष्मजीवों और धूल के साथ दूषित कर रहे हैं । बाँझ मीडिया के विभिन्न प्रकार पर Arabidopsis अंकुरों की वृद्धि बीज की सतह पर मौजूद कवक और बैक्टीरिया जैसे माइक्रोबियल संदूषणों को दूर करने के लिए पूर्व बीज नसबंदी की आवश्यकता है । एक प्रभावी बीज नसबंदी शासन का उपयोग उच्च अंकुरण, न्यूनतम संदूषण, और जोरदार संयंत्र के विकास के एक संतुलन के लिए महत्वपूर्ण है ।

दो सबसे आम Arabidopsis बीज नसबंदी के लिए इस्तेमाल किया तरीकों वाणिज्यिक ब्लीच (तरल चरण) और क्लोरीन गैस (वाष्प चरण) पर आधारित हैं । तरल चरण नसबंदी1,4,5,6,7,8,9 के लिए विभिन्न प्रक्रियाओं को नियोजित किया गया है , 10 और वाष्प-चरण नसबंदी के Arabidopsis बीज8,10,11,12,13,14,15 ,16. हालांकि, जबकि इन प्रक्रियाओं का उपयोग पादी के बीज नसबंदी को पूरा करने में प्रभावी है, विभिन्न पादी के बीजों पर विभिन्न नसबंदी उपचार के प्रभाव का एक विस्तृत विश्लेषण रिपोर्ट नहीं किया गया है. इसलिए, इन नसबंदी प्रक्रियाओं के अनुकूलन की शर्तों को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है जिसमें उच्च अंकुरण दर के साथ कुशल नसबंदी संयोजित की जाती है.

Arabidopsis जैविक संसाधन केंद्र (ABRC) विशिष्ट एक के लिए तैनात है) संग्रह और ख में विभिंन पादी की एक किस्म का परीक्षण बीज व्यवहार्यता) आंतरिक रूप से लागू गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रियाओं का लाभ ले और उपयोगकर्ता प्रतिक्रिया के जवाब में बीज अंकुरण के बारे में । यहाँ प्रस्तुत प्रयोगों के उद्देश्यों में Arabidopsis पादी की एक सीमा के बीज अंकुरण पर विभिन्ना नसबंदी विधियों के प्रभाव का निर्धारण किया गया. अनुकूलित नसबंदी प्रक्रियाओं जो उच्च बीज अंकुरण दर में परिणाम है, जबकि न्यूनतम रोगजनक संदूषण को बनाए रखने ब्लीच और क्लोरीन गैस नसबंदी दोनों के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1.1x Murashige और Skoog (एमएस) मध्यम

  1. ms बेसल नमक मिश्रण, 10 ग्राम सुक्रोज और 2 के ०.५ ग्राम के ४.३१ ग्राम जोड़ें-(एन Morpholino) ethanesulfonic एसिड (एमईएस) आसुत पानी की ०.८ एल युक्त एक चोंच के लिए और भंग करने के लिए हलचल । जांच करें और 1 एम पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH) का उपयोग कर ५.७ के लिए पीएच समायोजित । 1 L.
    2. बनाने के लिए आसुत जल जोड़ें
  2. दो 1 एल बोतलें, ५०० मिलीलीटर प्रत्येक में मीडिया विभाजित । प्रत्येक बोतल को आगर के 5 ग्राम जोड़ें । ढक्कन ढीला रखें ।
  3. आटोक्लेव 20 मिनट के लिए १२१ & #176; सी, 15 साई बोतल में एक चुंबकीय हलचल पट्टी के साथ.
  4. के बाद autoclaving, बोतलों को कम गति से एक हलचल प्लेट पर रखें, और MS मीडियम को 45-50 & #176 तक ठंडा होने दें; C (जब तक बोतल नंगे हाथों से रखी जा सकती है).
  5. इस कदम से शुरू, एक लामिना प्रवाह हुड में बाँझ परिस्थितियों में सभी चरणों का प्रदर्शन । Add ५०० & #181; L Gamborg & #39; एस प्रत्येक बोतल के लिए विटामिन समाधान और एमएस माध्यम को समान रूप से विटामिन समाधान वितरित हलचल ।
    6. प्लेट की गहराई के लगभग आधे कवर करने के लिए प्लेटों में पर्याप्त मीडिया डालना
  6. .
  7. के बारे में 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर शांत करने के लिए आगर जमना के लिए अनुमति देने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: अगर प्लेटों का तुरंत इस्तेमाल नहीं किया जाए तो उन्हें प्लास्टिक और स्टोर में लपेट कर 4 & #176; सी (फ्रिज का तापमान) पर रखें । कवर प्लेटें, बक्से, या ट्यूब जम आगार के साथ 4 में कई हफ्तों के लिए संग्रहित किया जा सकता & #176; C एक हवा बद कंटेनर में ।
< p class = "jove_title" > 2. नसबंदी के साथ Arabidopsis के बीजों का ब्लीच

  1. प्रोटोकॉल की धारा 1 के अनुसार एमएस प्लेट तैयार करें । एमएस मीडिया के रूप में एक ही समय में आसुत जल के १०० मिलीलीटर आटोक्लेव । इस पर बाद में कुल्ला पानी के रूप में उपयोग और बीज को निलंबित करने में मदद करने के लिए चढ़ाना में सहायता ।
    नोट: यदि वांछित, ०.८% आगर मिश्रण (डब्ल्यू/वी) ( उदा phytagar) भी इस चरण में autoclaved जा सकता है । आगर मिश्रण चढ़ाना के दौरान आसुत पानी के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है (कदम 2.5.3.) । आगर मिश्रण के अतिरिक्त चिपचिपाहट यह आसान यदि आवश्यक हो तो पंक्तियों में प्लेट या संयंत्र पर अंतरिक्ष बीज के लिए बनाता है ।
  2. तैयार ५०% (वी/वी) ब्लीच समाधान के लिए बीज बंध्याकरण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । ब्लीच को पतला करने के लिए, १०० मिलीलीटर ब्लीच की १०० मिलीलीटर से आसुत जल जोड़ें । जोड़ ५० & #181; के बीच के एल ब्लीच समाधान के लिए 20 डिटर्जेंट.
    नोट: तैयार ब्लीच समाधान के लिए एक महीने के रूप में जब तक यह केवल बाँझ स्थितियों में खोला जाता है के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. Aliquot १०० बीज में एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब.
  4. एक ५०% ब्लीच समाधान का उपयोग कर बीज निष्फल । एक लामिना फ्लो हुड में
    1. , जोड़ ५०० & #181; एल microcentrifuge ट्यूब के बीजों से युक्त ५०% ब्लीच समाधान । ब्लीच समाधान में बीजों को निलंबित करने के लिए ट्यूब के नीचे टैप करें ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक रोटेटर या प्लेटफ़ॉर्म शेखर को बीजों को निलंबित रखने के लिए उपयोग किया जा सकता है.
  5. ट्यूब से ब्लीच सॉल्यूशन कुल्ला.
    1. 10 मिनट के बाद, microcentrifuge ट्यूब से ब्लीच समाधान एक पिपेट या एक aspirator सिरे पर एक पिपेट टिप के साथ सज्जित का उपयोग कर निकालें ।
    2. Add ५०० & #181; म L बाँझो आसुत जल के ट्यूब को. मिश्रण करने के लिए ट्यूब और पलटना बंद करें । बीज ट्यूब के नीचे करने के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें । एक बार बीज ट्यूब के नीचे तक ध्यान से pipetting द्वारा ब्लीच समाधान को दूर करने के लिए बस गए हैं । इस कुल्ला प्रक्रिया को 6 बार दोहराएं ।
    3. बीज को निलंबित करने के लिए ट्यूब के लिए autoclaved आसुत पानी की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. प्लेट एमएस प्लेट्स पर निष्फल बीज ।
    1. एक लामिना फ्लो हुड में, शेयर नाम और वर्तमान दिनांक के साथ एमएस प्लेट के नीचे लेबल.
    2. microcentrifuge ट्यूब से एमएस प्लेट पर बीज डालो । एक बाँझ, एकल उपयोग inoculating पाश या एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग कर एमएस प्लेट के आसपास बीज फैलाओ.
      नोट: यदि बीजों को पंक्तियों में बोया जाना है, तो २०० & #181 के साथ एक पिपेट; L tip को व्यक्तिगत रूप से इच्छित पदों पर बीज रखने के लिए उपयोग किया जा सकता है । बीज के प्रवाह में सुधार करने के लिए, पिपेट टिप के अंत में कैंची का उपयोग करके 3-5 mm छंटनी की जा सकती है । किसी भी विस्थापित बीज या बीज के समूहों तो स्थिति या एक बाँझ एकल उपयोग inoculating पाश का उपयोग कर अलग किया जा सकता है.
    3. जगह एमएस प्लेट ढक्कन आधा बंद के साथ लामिना फ्लो हूड के पीछे के स्थान पर । अतिरिक्त पानी एमएस प्लेट से वाष्पीकरण करने के लिए अनुमति दें ।
    4. को एमएस प्लेट पर ढक्कन लगाएं । सूक्ष्मदर्शी पेपर सर्जिकल टेप के साथ प्लेट लपेटकर एमएस प्लेट सील (सामग्री के तालिका देखें).
< p class = "jove_title" > 3. क्लोरीन गैस के साथ Arabidopsis बीज की नसबंदी

  1. के अनुसार एमएस प्लेट्स तैयार करना & #160; प्रोटोकॉल की धारा 1. एमएस मीडिया के रूप में एक ही समय में आसुत जल के १०० मिलीलीटर आटोक्लेव; यह बाद में मदद करने के लिए बीज चढ़ाना में सहायता निलंबित इस्तेमाल किया जाएगा ।
    नोट: यदि वांछित, ०.८% आगर मिश्रण (डब्ल्यू/वी) ( उदा phytagar) भी इस चरण में autoclaved जा सकता है । आगर मिश्रण चढ़ाना के दौरान आसुत पानी के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है (कदम 3.6.2.) । आगर मिश्रण के अतिरिक्त चिपचिपाहट यह आसान यदि आवश्यक हो तो पंक्तियों में प्लेट या संयंत्र पर अंतरिक्ष बीज के लिए बनाता है ।
  2. नसबंदी शुरू करने से पहले, क्लोरीन गैस का उत्पादन करने के लिए आवश्यक ब्लीच और हाइड्रोक्लोरिक एसिड (HCl) की मात्रा की गणना.
    1. नसबंदी के लिए आवश्यक ६.१% सीएल 2 उत्पादन करने की आवश्यकता एचसीएल की राशि की गणना.
    2. निम्न सूत्र का उपयोग करें:
      < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg"/>
      ७,००० एमएल के साथ नसबंदी कंटेनर की मात्रा के रूप में और ६.१% Cl 2 के रूप में; एचसीएल की मात्रा 3 एमएल होने की गणना की जाती है ।
      नोट: एक स्प्रेडशीट के कंटेनर और% Cl 2 के विभिंन संस्करणों के लिए गणना बाहर ले जाने के लिए क्रमादेशित पूरक तालिका 1 के रूप में प्रदान की जाती है ।
  3. Aliquot १०० बीज में ०.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब । प्रत्येक शीशी के लिए टोपियां बंद, एक प्लास्टिक की रैक में शीशियों जगह और अलग सेट ।
    नोट: बीज समय की एक विस्तारित अवधि के लिए इस बिंदु पर जब तक वे उचित परिस्थितियों में जमा हो जाती है के लिए संग्रहित किया जा सकता है । स्टोरेज की स्थिति Rivero और सहकर्मियों द्वारा प्रोटोकॉल की धारा 3.3.2 में पाई जा सकती है < सुप क्लास = "xref" > 4 . ९६-खैर प्लेट प्रारूप भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. क्लोरीन गैस नसबंदी करने के लिए आवश्यक सामग्री तैयार करते हैं.
    1. अपने भंडारण स्थानों से ब्लीच और एचसीएल प्राप्त करते हैं.
    2. बड़े तेल फिल्म की एक पट्टी में कटौती (सामग्री के तालिका देखें) के लिए कदम 3.5.3 में उपयोग करें । नसबंदी कंटेनर को सील करने के लिए ।
    3. जगह प्लास्टिक कंटेनर जिसमें एक धुएं हुड के अंदर नसबंदी जगह ले जाएगा ढक्कन के साथ । सभी बीज शीशियों पर टोपियां खोलें और प्लास्टिक कंटेनर के अंदर पूरे बीज रैक जगह है ।
  5. कमरे के तापमान पर क्लोरीन गैस नसबंदी करते हैं ।
    सावधानी: ब्लीच और एसिड के साथ अलग से काम करें. या तो बोतल छोड़ नहीं गिरा के जोखिम को कम करने के लिए छाया हुआ । दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट सहित उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का प्रयोग करें । यदि या तो ब्लीच या दस्ताने पर एसिड बौछार, अंय सामग्री से निपटने से पहले दस्ताने बदल जाते हैं । हमेशा ब्लीच या एसिड संदूषण के मामले में धुएं डाकू में दस्ताने निकालें ।
    1. कंटेनर के अंदर एक २५० मिलीलीटर चोंच और ब्लीच के १०० मिलीलीटर डालें ।
      नोट: एचसीएल और ब्लीच के बीच की रिएक्शन ब्लीच के कम से 22 वॉल्यूम अतिरिक्त की आवश्यकता है । प्रतिक्रिया में सोडियम क्लोराइड (NaCl) और शोधकार्य के रूप में पानी के साथ सीएल 2 गैस जारी करने से एचसीएल और ब्लीच का उपभोग होगा । ब्लीच के एक बड़े अतिरिक्त का उपयोग अतिरिक्त एचसीएल डी की खपत की अनुमति देता हैuring वेंट अवधि, जो सोडियम बिकारबोनिट की मात्रा कम हो जाती है (NaHCO 3 ) निपटान के लिए समाधान बेअसर करने के लिए आवश्यक.
      सावधानी: यूरिन ब्लीच + एचसीएल का कुल तरल मात्रा में कम से दो बार होना चाहिए । यह अगले कदम है, जो बीज, ब्लीच कपड़े, या उजागर त्वचा को जला कर सकते है नुकसान के दौरान चोंच बचने बौछार रोकता है ।
    2. ब्लीच युक्त यूरिन के लिए एचसीएल के 3 एमएल जोड़ें.
      चेतावनी: प्रारंभिक प्रतिक्रिया बुलबुले का उत्पादन होगा, विशेष रूप से गैस सांद्रता पर अधिक से अधिक ६.१% । एक लंबी बाजू प्रयोगशाला कोट इस कदम के लिए आवश्यक है ।
    3. नसबंदी कंटेनर को बंद कर उसे आयल फिल्म के साथ तुरंत सील कर दें ।
    4. नसबंदी समय के दौरान नसबंदी कंटेनर की निगरानी गैस संचय सुनिश्चित करने के लिए; क्लोरीन गैस का संचय कंटेनर के अंदर बेहोश पीली धुंध के रूप में दिखाई देना चाहिए ।
      चेतावनी: समय पर नसबंदी कंटेनर की जांच सुनिश्चित करने के लिए कि दबाव के अंदर ढक्कन या तेल फिल्म नहीं है । अगर ढक्कन नहीं आ गया है या तेल फिल्म ढीली आ गया है, ढक्कन बंद करो और ध्यान से तेल फिल्म की एक अतिरिक्त परत के साथ कंटेनर लपेट ।
      5. १ एच नसबंदी काल के बाद
    5. ने आयल फिल्म निकालकर कंटेनर खोल कर एक कोने पर ढक्कन खोल कर रख लिए. कंटेनर 3 ज के लिए वेंट करने के लिए प्रतिक्रिया को पूरा करने और क्लोरीन गैस को खत्म करने की अनुमति दें ।
    6. बीज रैक में सभी microcentrifuge ट्यूबों की टोपियां बंद करें ।
      नोट: निष्फल बीज जब तक वे सूखी हालत में जमा हो जाती है के रूप में चढ़ाना के समय तक संग्रहित किया जा सकता है ।
    7. बीज रैक निकालें और यह एक लामिना प्रवाह हुड में जगह है ।
    8. बेअसर क्लोरीन गैस की रिएक्शन
      1. जोड़ें १.५ g NaHCO 3 पाउडर ब्लीच/एचसीएल सॉल्यूशन युक्त चोंच को धीरे से और एक ग्लास रॉड के साथ हलचल करने के लिए NaHCO समाधान में 3 भंग । NaHCO 3 जब तक कार्बन डाइऑक्साइड (कं 2 ) गैस बुलबुले बनाने बंद कर दिया है जोड़ना जारी रखें ।
        चेतावनी: धीरे जोड़ें बौछार को रोकने के लिए । दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट सहित उपयुक्त पीपीई का उपयोग करें ।
      2. पीएच स्ट्रिप्स या पीएच मीटर का उपयोग कर समाधान का पीएच परीक्षण । अतिरिक्त NaHCO 3 अगर समाधान का पीएच तटस्थ (पीएच ७.०) है जब तक आवश्यक जोड़ें । इस बिंदु पर समाधान धुएं डाकू से हटाया जा सकता है और सभी लागू निपटान दिशानिर्देश के अनुसार का निपटारा ।
        चेतावनी: यदि कोई गंध निपटान के दौरान देखा है, तो समाधान तुरंत धुएं डाकू को लौट जाना चाहिए ।
  6. प्लेट एमएस प्लेट्स पर निष्फल बीज ।
    1. एक लामिना फ्लो हुड में, शेयर नाम और वर्तमान दिनांक के साथ एमएस प्लेट के नीचे लेबल.
    2. Add ५०० & #181; L निष्फल आसुत जल के प्रत्येक microcentrifuge ट्यूब बीज को निलंबित करने के लिए । एमएस प्लेट पर बीज डालो और एक बाँझ, एकल उपयोग inoculating पाश या एक बाँझ पिपेट टिप का उपयोग कर प्लेट के आसपास समान रूप से बीज फैल.
    3. जगह एमएस प्लेट ढक्कन आधा बंद के साथ लामिना फ्लो हूड के पीछे के स्थान पर । अतिरिक्त पानी एमएस प्लेट से वाष्पीकरण करने के लिए अनुमति दें ।
    4. को एमएस प्लेट पर ढक्कन लगाएं । सूक्ष्मदर्शी पेपर सर्जिकल टेप के साथ प्लेट लपेटकर एमएस प्लेट को सील कर दीजिये ।
< p class = "jove_title" > 4. एमएस प्लेट्स पर Arabidopsis की ग्रोथ

  1. के लिए शीर्ष पर ढक्कन के साथ प्लेटें जगह पर तीन & #160;d ays पर 4 & #730; C और परिवेश आर्द्रता.
    नोट: इस प्रक्रिया को स्तरीकरण कहा जाता है और व्यक्तिगत बीजों के अंकुरण को सिंक्रनाइज़ करने के लिए कार्य करता है ।
  2. वृद्धि वातावरण के लिए प्लेटों हस्तांतरण ।
    1. तापमान को बनाए रखने में 23 & #176; सी और हल्की तीव्रता पर १२०-१५० & #181; मॉल/मी 2 एस विथ 16 एच लाईट/8 एच डार्क photoperiod. शीर्ष पर ढक्कन के साथ बढ़ने के वातावरण में फ्लैट प्लेट प्लेस तो जड़ों मध्यम में हो जाना ।
  3. प्लेटों पर अंकुरों को 8 दिन के लिए बढ़ने दें ।
    नोट: एक 8 दिन बढ़ती अवधि देर से अंकुरित बीज अंकुरित होने की अनुमति देता है । यदि सभी बीज अंकुरित हो तो प्लेटें 8 दिनों से अधिक समय तक बनाए जा सकते हैं ।
  4. स्कोर अंकुरण दर.
    1. बीज की संख्या है कि अंकुरित है और अंकुरित नहीं किया है रिकॉर्ड । प्लेट पर बीजों की कुल संख्या से अंकुरित बीजों की संख्या को विभाजित करके अंकुरण दर की गणना करें ।
      नोट: अंकुरण की गणना उस समय की जाती है जब radicle ने बीज कोट के बाहर प्रोजेक्ट किया है और दो cotyledons दिखाई दे रहे हैं ।
    2. भी मोल्ड से प्रभावित बीजों की संख्या की गणना करने के लिए नसबंदी की स्थिति की प्रभावशीलता का निर्धारण ।

Representative Results

Arabidopsis बीज एक खुले मैदान से एकत्र, ग्रीनहाउस या विकास चैंबर कभी-1,4कवक और बैक्टीरिया की तरह विभिन्न सूक्ष्मजीवों द्वारा दूषित कर रहे हैं । इस प्रकार, बाँझ मीडिया पर अंकुरण बीज विशेष रूप से प्लेटों के संदूषण के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर जब बीज की आपूर्ति सीमित है । दोनों ब्लीच और क्लोरीन गैस नसबंदी के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल, परिणाम जिनमें से नीचे प्रस्तुत कर रहे हैं, इस समस्या को कम करता है और उच्च प्रवाह अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक बीज की व्यवहार्यता को बरकरार रखता है ।

Arabidopsis कर्नल के अंकुरण पर ब्लीच नसबंदी के प्रभाव-0 बीज

ब्लीच कई प्रजातियों के पौधे में बीज नसबंदी के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया एजेंट है । बंध्याकरण एजेंट और जोखिम समय की इष्टतम एकाग्रता प्रजातियों के बीच बदलता है । कई प्रोटोकॉल Arabidopsis बीज की नसबंदी के लिए ब्लीच का उपयोग कर नियोजित किया गया है1,4,5,6,7,8,9 , 10. चार पांच अलग जोखिम समय अवधि के साथ ब्लीच के विभिंन सांद्रता का परीक्षण किया गया और परिणाम चित्रा 1में प्रस्तुत कर रहे हैं । उपचार कोलंबिया वंय प्रकार (कर्नल-0) के बीज के लिए लागू किया गया । कर्नल की अंकुरण पर ब्लीच एकाग्रता का प्रभाव-0 बंध्याकरण के समय के आधार पर विभिंन प्रकार के रूप में ब्लीच एकाग्रता और नसबंदी के समय के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत द्वारा प्रदर्शित बीज (चित्रा 1, पी & #60; ०.००१, ANOVA-प्रसरण का विश्लेषण).

5 और 10 मिनट के बीच नसबंदी के समय के साथ प्रयोग में, सभी ब्लीच सांद्रता के साथ उपचार कर्नल के समान रूप से उच्च अंकुरण दर के परिणामस्वरूप-0 बीज (चित्रा 1) । उच्च अंकुरण दर ४०% और सभी बंध्याकरण समय के लिए ५०% की घरेलू ब्लीच सांद्रता के लिए भी मनाया गया । 10 मिनट से अधिक समय के लिए ८०% और १००% ब्लीच के साथ उपचार अंकुरण की दर में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप कम भिगोने टाइंस की तुलना में (P & #60; ०.०१, ANOVA) । इसके अलावा, दोनों के लिए ८०% और १००% ब्लीच उपचार 20 मिनट के लिए, अंकुरण इसी ४०% और ५०% ब्लीच उपचार (P & #60; ०.००१, ANOVA) की तुलना में काफी कमी आई थी ।

बीज 15 मिनट या उससे अधिक समय के लिए उच्च ब्लीच सांद्रता का उपयोग करते समय ब्लीचिंग और shriveling के विभिंन स्तरों प्रदर्शित । अपेक्षाकृत उच्च के अलावा (३२%) बीज मृत्यु दर, अंकुरित इन स्थितियों में निष्फल बीज अक्सर विकास दोष दिखाई दिया, cotyledons और जैसे की विफलता में परिलक्षित और बढ़ाव, विकासात्मक गिरफ्तारी में जिसके परिणामस्वरूप । अधिकांश उपचार (20 में से 14) पूरी तरह से मोल्ड मुक्त थे, ०.२१% ± ०.००३ (तालिका 1) के समग्र मोल्ड स्तर औसत में जिसके परिणामस्वरूप ।

५०% ब्लीच और 10 मिनट के एक भिगोने समय के साथ एक इलाज सबसे अच्छा नसबंदी शासन के रूप में चुना गया था क्योंकि यह सतह रोगज़नक़ विकास के अच्छे निषेध के साथ उच्च अंकुरण प्रतिशत । इस उपचार के लिए नीचे वर्णित के रूप में अलग उत्परिवर्ती लाइनों पर ब्लीच नसबंदी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए चुना गया था ।

कर्नल-0 बीजों के अंकुरण पर क्लोरीन गैस नसबंदी का प्रभाव

क्लोरीन गैस नसबंदी की स्थिति का अनुकूलन करने के लिए, क्लोरीन गैस की तीन अलग सांद्रता दो समय (तालिका 2) के लिए कर्नल 0 बीज को निष्फल करने के लिए उपयोग किया गया था । गैस एकाग्रता की गणना केंद्रित एचसीएल की मात्रा और निम्न समीकरण का उपयोग कर नसबंदी कंटेनर की मात्रा के आधार पर की गई थी:

Equation 2

यह समीकरण आदर्श गैस १२.३ एम एचसीएल, 23 डिग्री सेल्सियस और १०१.३ केपीए के मानक वायुमंडलीय दबाव के तापमान संभालने कानून का उपयोग कर व्युत्पंन था ।

स्तंभ-0 बीजों के अंकुरण पर क्लोरीन गैस की एकाग्रता का प्रभाव समय और एकाग्रता के कारकों (चित्र 2a, P & #60; ०.०१, ANOVA) के बीच एक महत्वपूर्ण बातचीत द्वारा संकेत के रूप में नसबंदी के समय पर निर्भर करने के लिए दिखाया गया था . क्लोरीन गैस एकाग्रता स्तंभ के अंकुरण पर कोई महत्वपूर्ण प्रभाव था 0 1 एच नसबंदी के अधीन बीज । इस नसबंदी के समय के साथ, क्लोरीन गैस की सभी सांद्रता इसी प्रकार अंकुरण के उच्च स्तर को बढ़ावा, ८५% से ऊपर (पी & #62; ०.०५, ANOVA) । दूसरी ओर, 3 एच लंबी नसबंदी के परिणामस्वरूप क्लोरीन गैस की उच्चतम एकाग्रता के लिए अंकुरण दर में उल्लेखनीय कमी, दो निचली गैस सांद्रता के साथ तुलना में (P & #60; ०.०५, ANOVA) । इन परिणामों से संकेत मिलता है कि Arabidopsis के बीजों का परीक्षण क्लोरीन गैस सांद्रता के साथ 1 एच के लिए, या 3 एच के लिए १६.५% से नीचे गैस सांद्रता के साथ, समान रूप से बीज व्यवहार्यता संरक्षण में प्रभावी रहे है के बाद से अंकुरण दर हमेशा अधिक थे ८२% से । हालांकि, १६.५% गैस के साथ 3 एच के लिए बीज बंध्याकरण बीज अंकुरण के लिए हानिकारक था ।

मोल्ड की घटना भी गैस एकाग्रता और जोखिम समय पर निर्भर था । मोल्ड विकास प्रभावी ढंग से ६.१% की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता और 1 घंटे के उपचार के लिए १६.५% क्लोरीन गैस के साथ और 3 एच (चित्रा 2 बी) के लिए सभी गैस सांद्रता के साथ बाधित किया गया था ।

इन परिणामों के आधार पर, 1 घंटे (तालिका 2) के लिए ६.१% की गैस एकाग्रता के साथ एक उपचार के रूप में चयनित किया गया था सबसे अच्छा वाष्प चरण नसबंदी हालत अलग उत्परिवर्ती लाइनों पर गैस नसबंदी के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, के बाद से यह संयुक्त उच्च अंकुरण दर ( मोल्ड प्रदूषित (०.०२%) के बहुत कम स्तर के साथ ८५%) ।

विभिन्न अंकुरण क्षमता वाले बीजों पर ब्लीच और क्लोरीन गैस नसबंदी का प्रभाव

सांख्यिकीय विश्लेषण से पता चला कि नसबंदी विधियों की अंकुरण प्रतिक्रिया रेखाओं की अंकुरण क्षमता (चित्र 3ए, पी & #60; ०.०१, ANOVA) पर निर्भर थी । न तो ब्लीच और न ही क्लोरीन गैस नसबंदी उच्च अंकुरण क्षमता (समूहों 4 और 5) के साथ बीज की अंकुरण दर कम । न तो उपचार सबसे कम अंकुरण के साथ समूह के पहले से ही कम अंकुरण दर पर एक प्रभाव थासंभावित (समूह 1) । इसके विपरीत, क्लोरीन गैस नसबंदी में मध्यवर्ती अंकुरण क्षमता (समूह 2 और 3) के साथ बीजों के अंकुरण में लगभग 12-18% (P & #60; ०.०१, ANOVA) की उल्लेखनीय कमी हुई । ब्लीच नसबंदी में भी समूह 2 के 13% से अंकुरण दर में कमी आई, लेकिन यह समूह 3 के अंकुरण दर में कमी नहीं आई. हालांकि किसी भी अंकुरण समूह में ब्लीच और क्लोरीन गैस के उपचार के बीच अंकुरण दर में कोई उल्लेखनीय अंतर नहीं था (चित्रा 3ए, पी & #62; ०.४४२, ANOVA), ब्लीच का उपयोग कर निष्फल बीज एक थोड़ा अधिक है सभी अंकुरण समूहों में गैस-निष्फल बीजों की तुलना में अंकुरण दर ।

नसबंदी उपचार काफी बदल (P & #60; ०.००१, ANOVA) मोल्ड (चित्र बी) से प्रभावित बीजों का प्रतिशत । क्लोरीन गैस और ब्लीच दोनों की नसबंदी के फलस्वरूप कम मोल्ड ग्रोथ (P & #60; ०.०५, ANOVA) की तुलना में कोई नसबंदी नहीं हुई. किसी भी समूह में गैस और ब्लीच नसबंदी के बीच पाए गए मोल्ड स्तर में कोई अंतर नहीं था (चित्र बी, पी & #62; ०.४, ANOVA).

Figure 1
चित्रा 1: ब्लीच एकाग्रता और Arabidopsis कर्नल के अंकुरण पर नसबंदी समय के प्रभाव-0 बीज. मान ± एसडी प्रयोग के 5 स्वतंत्र प्रतिकृतियां से प्राप्त मतलब है । * ब्लीच सांद्रता की एक सीमा के लिए 5 मिनट भिगोने की अवधि के सापेक्ष महत्वपूर्ण मतभेदों को इंगित करता है (P & #60; ०.०१, ANOVA) । #८०% और १००% ब्लीच सांद्रता के सापेक्ष ४०% और एक 20 मिनट की अवधि के लिए ५०% के महत्वपूर्ण मतभेदों को इंगित करता है (P & #60; ०.०१, ANOVA) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: क्लोरीन गैस एकाग्रता और Arabidopsis कर्नल पर नसबंदी समय के प्रभाव-0 बीज । (क) अंकुरण दर और (ख) मोल्ड स्तर. त्रुटि पट्टियों का अर्थ है ± एसडी से प्राप्त 5 जैविक और प्रयोग के 5 तकनीकी प्रतिकृतियां । मतलब है कि एक पत्र साझा नहीं है काफी अलग है (P & #60; ०.०५, ANOVA) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न अंकुरण क्षमता वाले बीजों पर ब्लीच और क्लोरीन गैस नसबंदी के प्रभाव । (क) अंकुरण दर और (ख) मोल्ड स्तर. १०० सॉल्क टी-डीएनए लाइनों को किसी भी नसबंदी एजेंट के अभाव में अंकुरण दर के रूप में परिभाषित उनकी अंकुरण क्षमता के अनुसार पांच समूहों में वर्गीकृत किया गया. अंकुरण दर पर आधारित समूह इस प्रकार थे: ग्रुप 1 (0-20%), ग्रुप 2 (21-50%), ग्रुप 3 (51-70%), ग्रुप 4 (71-90%) और ग्रुप 5 (91-100%) । लाइनों बेतरतीब ढंग से चुना गया था और उनके अंकुरण क्षमता जीनोटाइप पर निर्भर नहीं था । मान ± एसडी प्रयोग के तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियां से प्राप्त मतलब है । प्रत्येक मान के ऊपर अक्षर ("a", "ab", "c" आदि) श्रेणी के सांख्यिकीय समूहीकरण का संकेत देते हैं । मतलब है कि एक पत्र साझा नहीं है काफी अलग है (P & #60; ०.०५, ANOVA) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

नसबंदी समय (min) ब्लीच एकाग्रता (%)
४० ५० ८० १००
5 ०.००% ०.००% ०.००% २.१३%
8 ०.००% ०.००% ०.००% ०.००%
10 ०.००% ०.५०% ०.००% ०.३६%
15 ०.००% ०.००% ०.००% ०.६८%
20 ०.१९% ०.२८% ०.००% ०.००%

तालिका 1: ब्लीच-निष्फल कर्नल-0 बीज का मोल्ड स्तर ।

ब्लीच एचसीएल समय % क्लोरीन गैस (मॉल सीएल2/mol कुल गैस)
एमएल) एमएल) h)
25 1 1 २.१
25 1 3 २.१
१०० 3 1 ६.१
१०० 3 3 ६.१
२०० 9 1 १६.५
२०० 9 3 १६.५

तालिका 2: क्लोरीन (सीएल2) कोलंबिया जंगली प्रकार एक 7 एल कंटेनर का उपयोग कर बीज पर गैस नसबंदी उपचार ।

पूरक तालिका 1: कंटेनर और% Cl2के विभिंन संस्करणों के लिए परिकलन को पूरा करने के लिए एक स्प्रेडशीट क्रमादेशित है । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Discussion

जब बाँझ मीडिया पर Arabidopsis बीज बढ़ रहा है, नसबंदी के कुछ फार्म लागू किया जाना चाहिए. दोनों ब्लीच और क्लोरीन गैस नसबंदी उपचार समान अंकुरण दर और मोल्ड विकास निषेध में परिणाम । न तो नसबंदी विधि उच्च अंकुरण क्षमता वाले बीजों के लिए अंकुरण दर में उल्लेखनीय कमी का कारण बनती है; हालांकि, ब्लीच नसबंदी कम अंकुरण क्षमता के साथ लाइनों के लिए सिफारिश की है (20-70%), छोटे के कारण, हालांकि गैर-महत्वपूर्ण, गैस नसबंदी की तुलना में अंकुरण दर में सुधार (आंकड़ा 3ए).

10 मिनट तक के लिए 40-100% से ब्लीच सांद्रता के साथ Arabidopsis बीज बंध्याकरण संतोषजनक अंकुरण प्रतिशत और प्रभावी मोल्ड दमन प्रदान करता है । हालांकि ब्लीच सांद्रता से कम ४०% सबसे बीज बहुत सारे के लिए पर्याप्त नसबंदी प्रदान, ४०% की एकाग्रता का उपयोग या उच्च भी भारी दूषित बीज बहुत से प्रभावी नसबंदी की गारंटी देता है । यह महत्वपूर्ण है नसबंदी के 10 मिनट से अधिक नहीं जब ब्लीच सांद्रता के बराबर या अधिक ८०% का उपयोग करने के लिए उच्च बीज मृत्यु दर और अंकुर विकास में दोषों से बचने के ।

उच्च अंकुरण दरों और पर्याप्त मोल्ड उंमूलन में 1 एच परिणामों के लिए ६.१% या १६.५% की क्लोरीन गैस सांद्रता के साथ Arabidopsis बीज का इलाज । कम क्लोरीन गैस एकाग्रता (२.१%) नसबंदी की अवधि बढ़ाकर 3 एच के द्वारा सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है ।

जब कुछ लाइनों को निष्फल करने की आवश्यकता है, 10 मिनट के लिए ५०% ब्लीच के समाधान में तरल नसबंदी की सिफारिश की है । लाइनों की अधिक से अधिक संख्या के लिए, 1 घंटे के लिए ६.१% की एक गैस एकाग्रता के साथ गैस नसबंदी एक बेहतर विकल्प के बाद से कई लाइनों जल्दी और आसानी से कम हेरफेर के साथ निष्फल किया जा सकता है ।

हमारे परिणाम विभिन्न पादी के बीजों की दोनों बड़ी संख्या और कम अंकुरण क्षमता वाले बीजों को निष्फल करने के लिए मानकीकृत शर्तें प्रदान करते हैं । इन बंध्याकरण तकनीकों की ही सीमा है कि वे अंकुरण की दर से कम 20% व्यापक बीज मृत्यु के कारण के साथ बीज के लिए लागू नहीं किया जा सकता है । वैकल्पिक तरीकों, जैसे sonication17, नसबंदी के अभाव में अंकुरण दर को बढ़ाने के लिए उन मामलों में लाभप्रद हो सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम प्रायोगिक सामग्री तैयार करने में उसकी सहायता के लिए Gauri दत्ता का शुक्रिया अदा करना चाहेंगे । पांडुलिपि की महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए हम Bettina Wittler और जेम्स मान के भी आभारी हैं । यह काम NSF अनुदान DBI-१०४९३४१ और म्क्ब-११४३८१३ द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.65 mL Microcentrifuge tubes GeneMate C-3260-5 Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
1.7 mL Microcentrifuge tube GeneMate C-3262-1 Tube in which Arabidopsis thaliana seeds are placed to perform sterilization
7 L plastic container Sistema 1016265438 Container in which gas sterilization is performed
Concentrated HCl Sigma-Aldrich 320331 Chemical used in the process of creating chlorine gas
Disposable sterile inoculating loop Fisher Scientific 22-363-603 Loop is used to spread or position Arabidopsis seeds on MS plates
Gamborg’s vitamin solution Sigma-Aldrich G1019 Vitamin solution used in the process of making MS media
Household bleach Clorox Regular-Bleach Chemical used in the process of creating chlorine gas and liquid sterliziation
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933 Chemical used in the process of making MS media
Micropore surgical tape 3M 1530-1 Microporous surgical paper tape used to seal MS plates
Murashige and Skoog basal salt mixture (MS) Sigma-Aldrich M5524 Chemical used in the process of making MS media
Parafilm M Bemis Company #PM996 Parraffin film used to seal sterilization container
Petri dish 100 X 15 mm  Fisher Scientific FB0875713 Petri dishes in which MS media is poured for the purpose of growing Arabidopsis thaliana
pH indicator strips Whatman 2613991 Used to check pH of neutralizied chlorine and sodium bicarbonate solution
Phytoagar Fisher Scientific 50-255-212 Used to aid in the suspension of Arabidopsis seeds in the process of plating seeds
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761 Chemical used in the process of neutralizing chlorine gas reaction
Sucrose Sigma-Aldrich S0389 Chemical used in the process of making MS media
Tween 20 Fisher BioReagents BP337-100 Chemical used in the process of liquid sterilization
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References

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पादप जीव विज्ञान अंक १२८ Arabidopsis ब्लीच क्लोरीन गैस मोल्ड बीज अंकुरण बीज नसबंदी
Arabidopsis बीजों के उच्च प्रवाह नसबंदी के लिए मानकीकृत विधि
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Lindsey III, B. E., Rivero, L.,… More

Lindsey III, B. E., Rivero, L., Calhoun, C. S., Grotewold, E., Brkljacic, J. Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds. J. Vis. Exp. (128), e56587, doi:10.3791/56587 (2017).

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