Summary
En enkel metode for å måle og karakterisere bakteriell vedheft til planter, spesielt røtter og spirer, er beskrevet i denne artikkelen.
Abstract
Dette manuskriptet beskriver en metode for å måle bakteriell bindende axenic plante overflater i lys mikroskopet og gjennom bruk av levedyktig celletall. Anlegget materialer inkluderer røtter, rosenkål, blader, og kutte frukt. Metodene beskrevet er billig, enkel og egnet for små utvalgsstørrelser. Bindende måles i laboratoriet og en rekke inkubasjon media og forhold kan brukes. Effekten av hemmere kan bestemmes. Situasjoner som fremmer og hemmer binding kan også vurderes. I noen tilfeller er det mulig å skille om ulike forhold endre bindingen hovedsakelig på grunn av deres effekter på anlegget eller bakterier.
Introduction
Måling av bakteriell binding til plante overflater blitt viktig i tre ulike situasjoner. Den første situasjonen ¨ undersøkelse av overføring av human patogener på anlegget overflater1,2,3. Målet her er å hindre bakteriell binding eller å fjerne eller drepe bundet bakterier og dermed redusere overføring av sykdom av plantemateriale. Andre er undersøkelse av binding av plante-patogener å plante overflater4. En gang målet her er å unngå å felle eller å fjerne eller drepe bundet bakterier og dermed redusere sykdom. Tredje er undersøkelse av bindingen symbiotisk eller plante-vekst-fremme bakterier5,6. Målet her er å fremme bakteriell bindende og dermed øke plante helse og beskjære gir.
Teknikker for måling av bakteriell binding til plante overflater som beskrevet i denne artikkelen er billig og relativt enkle å gjennomføre. De eneste kravene er et mikroskop og materialer vanligvis funnet i en bakteriell laboratorium. For noen teknikker er en bad sonicator nyttig. Teknikkene er utformet for bindende eksperimenter utført med relativt små utvalgsstørrelser. Målinger av binding er laget i laboratoriet, selv om det kan være mulig å endre noen av disse teknikkene for bruk i drivhuset eller i feltet.
Disse teknikkene har blitt brukt til å måle bakteriell binding røtter, rosenkål, skåret blader, kutt frukt og intakt cherrytomater i laboratoriet7,8,9,10,11, 12,13,14,15. De har også brukt til å måle rot kolonisering av planter vokser i jord eller sand i laboratoriet16. Teknikkene har blitt brukt med mange bakteriell arter inkludert Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica, og Pseudomonas fluorescens. En nyttig beskrivelse av metoder for å vurdere samspillet av A. tumefaciens med overflater kan finnes i Morton og Fuqua (2012)17. I alle tilfeller var utvalgene involvert små, vanligvis mindre enn 25-50 planter. Teknikkene er egnet for bruk med human patogener som må holdes inneholdt under forsøkene.
Protocol
1. forberedelse av Axenic plantemateriale
- Forberede planter dyrket i vann.
- Sett et lite antall frø (mindre enn 30) i en 30, 50, 100 eller 150 mL glass kanne. Vi har brukt tomat, alfalfa, Arabidopsis thaliana, ert, bønne, tobakk, salat og gulrot frø med denne protokollen.
Merk: For å fastslå hvor mange frø kan steriliseres sammen uten forurensning sprer seg fra ett frø til en annen, kan du se trinn 1.1.2. - Dekk frøene med 80% etanol og swirl kort. La frøene suge 1 min.
- Hell av etanol og dekk frøene med 50% av volumet kommersielle blekemiddel (NaClO) og 0,1% Triton X-100 i vann fra springen. La frøene suge for 20 min.
Merk: Hvis frøene er stor, som bønne frø, kan det være nødvendig å forlenge soaking tiden helt drepe sopp på frø overflaten. - Hell av blekemiddel blandingen og vask frøene 3 ganger med sterilt vann. La frøene suge i vannet for 1 min for hver vask.
- For å få legge axenic frøplanter en liten mengde sterilt vann mellom 5 og 25 mL avhengig av frø. Hell frø og vann i et sterilt Petriskål for frø spiring.
Merk: Vannet skal dekke bunnen av parabolen men ikke dekk frøene for å stimulere dannelsen av rot hår. Axenic beskriver en kultur der bare én art av organismen finnes. - Inkuber i mørket til seedlings nå ønsket størrelse mellom 1 cm og 10 cm (ca 5 dager for tomat og A. thaliana og 1-3 dager for alfalfa). For større frø bruk en dekket sterile containeren med en kapasitet på mer enn 100 mL som et glass rett dekkes med folie.
- Sett et lite antall frø (mindre enn 30) i en 30, 50, 100 eller 150 mL glass kanne. Vi har brukt tomat, alfalfa, Arabidopsis thaliana, ert, bønne, tobakk, salat og gulrot frø med denne protokollen.
- Bestemme frekvensen av forurensning av bestemt frø mye med mikroorganismer som fortsatt levedyktig på eller innenfor frøene etter overflate-sterilisering.
Merk: Dette er nødvendig fordi sporadisk frø bærer mikroorganismer under frø jakke som ikke kan bli drept av overflaten sterilisering. Bruk antallet forurensede frø frø mye for å bestemme hvor mange frø for å sterilisere samtidig uten en høy risiko for gruppen av frø blir forurenset på grunn av ett frø med bakterier eller sopp som overleve behandling.- Utfør trinn 1.1.1 gjennom 1.1.3.
- Plass frø på en nærings agar Petriskål. Legge 10-30 frø i hver rett mellomrom dem ut slik at de kan være scoret individuelt. Forsegle retter med bånd eller tetting film.
- Inkuber for 3-5 dager ved 25 ° C scoring hver dag for synlig utvekst av mikroorganismer fra frø.
- Forberede planter dyrket i sanden. Stiklinger kan dyrkes i sand for bruk i bakteriell vedheft eksperimenter.
- Utfør trinn 1.1.1 gjennom 1.1.3.
- Sterilisere kvarts eller havet sand i autoclave. Begge disse inneholde noen organisk materiale. Hvis dette vil påvirke eksperimentet, vask sanden av dekker det med to ganger volumet av 0.1 M HCl. blanding for 10 min. Tillat sanden å bosette seg og hell av væske. Skyll sanden 3 ganger med vann, og en gang med 80% etanol etterfulgt av to flere skyllinger bruker den samme protokollen som den 0.1 M HCl. Sterilize vasket sand i autoclave.
- Sterilisere beholdere av submerging dem i 50% blekemiddel i 5 minutter og skyll 5 ganger med sterilt vann ved neddykking. La dem tørke og forsegle bunnen med tetting film. Filmen som hentes fra produsenten er vanligvis gratis mikroorganismer på innsiden siden som skal plasseres mot innsiden av beholderen.
- Bland sterilt sanden med nok sterilt vann våt det nok at sand pinner sammen. Beløpet avhenger av hvordan tørr sand er. 10-35% av volumet av sand er vanligvis tilstrekkelig. Plass våt sand i beholderen tillater tilstrekkelig dybde for lengden av røtter nødvendig og tilstrekkelig plass over sanden for vekst av skyte. Den nøyaktige avstanden avhenger av arter og rekke anlegget brukes.
- Plante frø.
- Lage et grunt hull i sanden med sterilt glass stang bare dypt nok å plassere frø under overflaten av sand (cirka 1-5 mm). Plass frø i hullet. Dekke den med et tynt lag av sand. Forsegle toppen av beholderen med tetting filmen for å hindre tap av vann og av flere mikrober.
- Dyrke planter i laboratoriet under en lys eller i drivhuset på en passende temperatur og lengden på dagen for arter og utvalg av anlegget. For tomat bruke alfalfa, eller Arabidopsis thaliana romtemperatur og 12t lys/mørke sykluser.
- Plante planter i et hull i sanden (1-2 mm i diameter og dyp nok at roten vil bli dekket med sand). Lage hull med sterilt glass stang. Guide roten nøye inn i hull med sterilt rustfritt stål heklenål om nødvendig, og fylle sidene av hullet med sand.
- Alternativt, dyrke planter axenically på eller i agar som inneholder en salter blanding som MS salter. Bruk skyter axenic planter dyrket i agar direkte. Unngå røtter dyrket med agar som agar stikker til både plante overflaten og bakterier. Dette kan resultere i et falskt inntrykk av bakteriell vedheft til overflaten anlegget.
2. forberedelse av andre plantemateriale
- Vask plantemateriale dyrket i drivhus med vann før bruk for å redusere antall urfolk mikrober. Det blir bakterier og sopp på planter. Protozoer vil være tilstede i jord, røttene, og kanskje på bladene. Vaskemaskin blekemiddel eller etanol vil endre anlegget overflaten og anbefales ikke.
- Hvis etter vann vask betydelig antall mikrober forblir, behandle planter med fortynnet væske håndsåpe eller fortynne hydrogenperoksid (0,01%) til å fjerne eller drepe mikrober. Dette er generelt mindre skadelig for anlegget enn blekemiddel eller etanol.
- Plantemateriale kjøpt på et lokalt marked er vanskelig å rense, Velg materiale som ikke synes å ha vært utsatt for lengre lagring. Unngå deler av materialet som vises brun eller skadet.
- Vaske den med vann og fersk kutt på endene av materiale som har tidligere blitt kuttet før du bruker den, med mindre samhandling test bakterier med bakterier (og eukaryoter) som har samlet på kutt steder av interesse. Ikke vask med blekemiddel eller etanol som de endrer anlegget overflaten.
- Behandle sår nettsteder. Såret nettsteder gir ofte bakterier tilgang til indre av plante materiale18.
- Blokkere eller redusere bakteriell vedlegg og bevegelse gjennom, sår eller kutt områder som er opprettet i utarbeidelsen av materialet dipping klippekanten i smeltet parafin eller maleri nettstedet med smeltet parafin med en liten børste. Ikke bruk en slikkepott eller noen skarpe implementere da dette kan skade vev.
- Seal stammer arr på frukt som tomater med parafin. Noen bakterier vil svømme i området under parafinen, men tallene er vanligvis små.
- Hvis bakteriell inntreden i såret steder av interesse, anslag avstanden som bakterier kan flytte båret av vann bekker eller spredning ved å observere bevegelsen av en farge lagt til løsningen. Merke motile bakterier ved å innføre et gen koding en fluorescerende protein som grønne fluorescerende protein (GFP) i dem, og spore dem bruke fluorescens mikroskopi beskrives i trinn 6.1.219.
3. forberedelse av bakterier
- Vokse bakterier. Bruk et medium som nærmest tilnærmet betingelsene bakterier er sannsynlig å ha vært utsatt for umiddelbart før møte anlegget i virkeligheten utenfor laboratoriet. Karbon- og nitrogen kilder og tilstedeværelsen av ioner, spesielt divalent kasjoner (Ca, Mg, Fe, Mn og Zn) og fosfat, og pH av mediet er viktig.
- Bruke minimal AB medium eller Luria kjøttkraft for A. tumefaciens og andre jord bakterier20. E. colisom kan stamme i tarmen, bruke Luria kjøttkraft.
- Legg indusere som root eksudater eller kommersielle planteekstrakter som soytone eller sukker som sukrose eller xylose på middels21. Hvis disse stoffene er brukt som indusere, Legg en lav konsentrasjon, for eksempel 0,01%. Hvis de brukte karbon kilder, kan du legge til en høyere konsentrasjon, for eksempel 0,1%.
- Forberede den bakteriell inoculum. Fortynne bakterier i sterilt vann eller mediet der inkubering utføres og legge dem til plantemateriale. Den riktige fortynning er diskutert i trinn 4.2 og 4.3.
- Hvis du vil fjerne vekst media før du bruker bakterier, sentrifuge bakteriell suspensjon 10.000 x g i 2 minutter, hell av nedbryting og resuspend bakterier av vortexing på samme medium som skal brukes for inkubasjon med plantemateriale. Denne metoden kan fjerne eller redusere antall eller mengde ekstracellulære materiale og lemmer som exopolysaccharides, kapsler, flagellae eller pili. Hvis det er viktig at disse overflaten strukturene forblir intakt, så bare fortynne bakterier før vaksinere dem eller bruke den alternative metoden beskrevet i trinn 3.2.2.
- Som en alternativ å fjerne oppblomstringen medium, samle bakterier på en nitrocellulose eller polykarbonat filter med en porestørrelse på 0,2 µm eller mindre. Vask bakterier med inkubering mediet og resuspend dem ved forsiktig risting eller vortexing filter i sterilt beholder av mediet.
4. vaksinasjon av bakterier
- Bestem hvor mange bakterier å være inokulert med målingen brukes til å bestemme bakteriell vedheft og inkubasjon tiden.
- Vaksinere relativt stort antall bakterier for microscopic studier med inkubering ganger mindre enn 1 dag. Legge til en mengde kultur å nå en siste bakteriell konsentrasjon av mer enn 106 bakterier per mL. Forminsk bakteriell inoculum for lengre inkubasjon.
- For studier som bakteriell vedheft kartlegges på levedyktig celletall, legge en mengde kultur å nå en siste bakteriell konsentrasjon av 103 til 106 bakterier per mL.
- Unngå å legge så mange bakterier at metabolismen endringer i pH eller oksygen konsentrasjon i inkubasjon medium. Måle pH pH papir eller en elektrode. Måle oksygen konsentrasjon bruke en oksygen elektrode.
- For planter dyrket i sand, vaksinere på tre mulige måter.
- Vaksinere frø med bakterier før planting av soaking frøet for 1 min i en suspensjon i vann i ca 106 bakterier per mL.
- Vaksinere roten av spirende axenic frøplanter som beskrevet i Seksjon 1 og når frøplante roten er ca 1 cm lang dipping det eller å plassere hele frøplante i en suspensjon av 106 bakterier per mL i vann i 1 minutt.
- Vaksinere sand blande bakterier med sand før planting for å gi en endelig konsentrasjon av ca 103 bakterier per mL eller vanning frøplante med en suspensjon av 106 bakterier per mL etter planting.
5. inkubasjonstiden for bakterier med plantemateriale
- For inkubasjon i flytende media ruge bakterier med plantemateriale i sterilt vann eller sukrose og mineral salter eller plante vev kultur medium (som en 1:10 fortynning av MS salter)22,23.
- Bruke en container som bakterier ikke holder seg. Prøv å holde anlegget overflaten dekket kontinuerlig ved neddykking eller mild agitasjon. Energisk agitasjon kan hindre heft eller aften fjerne bakterier fra anlegget overflaten.
- Observere plantemateriale i lys mikroskopet etter ulike tidsintervaller bestemme når å stoppe inkubering og foreta målinger. En gang løpet av vedheft er ofte verdifulle med prøver tatt hver 1 til 4 h eller hver dag avhengig av samspillet hastighet.
- For å ruge i sand, gjelde de samme hensyn på inkubasjon i flytende medium i trinn 5.1.
6. måling av vedheft bruker mikroskopi
- Foreta mikroskopiske målinger med Nomarski eller kontrast optikk for enkel visning av bakterier på overflater. Men kan noen lyse-feltet mikroskop med forstørrelse på 20 X eller høyere brukes.
- Bruke mikroskopiske observasjon for å avgjøre hvis bakterier tilfeldig fordelt eller ligger i bestemte områder. Også sjekke om de bundet enkeltvis eller i klynger. Se etter microcolonies foreslå bakterievekst eller entrapment etter vedheft. Sjekk om bakterier synes å danne en biofilm på overflaten.
Merk: En biofilm er et stort antall bakterier bundet til overflaten og omgitt av en ekstracellulær matrix23,24,25. Strukturen kan være jevn og ensartet eller har en mer komplisert arkitektur. Metoder for å studere biofilm assosiert med plante flater har vært beskrevet17. - Bruk bakterier merket med et fluorescerende markør. Hvis det finnes andre bakterier og bakterier rundt identifiseres med et fluorescerende merke som grønne fluorescerende protein, bruk fluorescens mikroskopi for å fastslå tilstedeværelsen av merket bakterier i klynger av andre bakterier26. For GFP, kan du bruke et filter med 490 nm eksitasjon og 520 nm utslipp.
- Kontroller at fluorescerende koden ikke negativt påvirker bakterier ved å observere tilslutning til axenic materiale av en lik blanding av vill type bakterier og merket bakterier av den samme stammen med både Nomarski og fluorescens optikk. Hvis fluorescerende og mørke bakterier er tilfeldig blandet og nåværende like deretter koden ikke forstyrre analysen.
- Bruke mikroskopiske observasjon for å avgjøre hvis bakterier tilfeldig fordelt eller ligger i bestemte områder. Også sjekke om de bundet enkeltvis eller i klynger. Se etter microcolonies foreslå bakterievekst eller entrapment etter vedheft. Sjekk om bakterier synes å danne en biofilm på overflaten.
- Bestemme antall vedlagte bakterier.
Merk: Det er svært vanskelig å fastslå antall vedlagte bakterier i mikroskopet. Når bindingen er uregelmessig anlegget overflater, er det vanligvis ikke mulig å få en kvantitativ måling. Skanning elektronmikroskop (ikke omtalt i denne artikkelen) kan brukes til å foreta slike målinger.- Når bakterier er bundet til en glatt overflate som en rot hår, telle antall bakterier som er bundet til kanten av roten håret per mm rot hår lengde. Pass på å bruke rot hår i omtrent samme størrelse og form i sammenligne målinger.
- For å avgjøre størrelsen på objekter i mikroskopet, bruk et kommersielle lysbilde med målte merkingen på den. Observere, fotografere dette lysbildet på de samme innstillingene som brukes for eksperimentelle materialet, og bruke bildene til å fastslå størrelsen på objekter i photomicrographs.
- Forberede prøven mikroskopi.
- Vask prøven. Flytte prøven til en dråpe vann eller inkubasjon medium på en microscope skyve og observere den direkte.
Merk: Dette har fordelen at hvis det var ingen bakterievekst eller faktiske bakteriell død det er usannsynlig å bli mange gratis bakterier. Ta fravær av gratis bakterier som varselsskilt at det kan ha vært bakteriell død eller bakteriell binding til beholderen hvor inkubering ble utført. Effekten av vaske prøven er vist i figur 1. - Vask prøven forsiktig i vann eller inkubasjon medium ved å plassere den i et hetteglass væske og snu ampullen forsiktig. Deretter plass prøven på mikroskopet lysbildet i frisk væske for observasjon.
- Montere eksemplet i væske med en vanlig cover slip og microscope skyve.
- Bruk en press-apply cover slip hvis prøven er tykk og så ville lage en kul under cover slip. Disse dekker slips har en ring av gummi eller plastikk rundt kanten av cover slip. Plasser væske og prøve i brønnen i cover slip plasser lysbildet på og trykk ned forsiktig for å forsegle cover slip på lysbildet. Inverter og undersøke.
- Alternativt bruke en alger telling lysbilde og cover slip på en lignende måte. Merk at lysbildene med denne dybde generelt ikke kan undersøkes med en linsen på mer enn 20 X forstørrelse.
- Vask prøven. Flytte prøven til en dråpe vann eller inkubasjon medium på en microscope skyve og observere den direkte.
Figur 1 : Trinn i utarbeidelsen av en prøve for å bestemme antall bundne bakterier. A. tumefaciens binding tomat rot hår (A, B og C) og nylontråder (D, E og F). I prøver montert i vann uten vaske både bundet bakterier (svart piler) og gratis bakterier (hvite piler) kan ses (A og D). Etter vask bundet bakterier forblir men gratis bakterier er ikke lenger presentere (B og E). Etter sonication er bundet bakterier fjernet fra utvalget overflaten (C og F). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Hvis fluorescerende bakterier ble brukt, må du undersøke eksemplet i mikroskopet når sanden er fjernet. Røttene av planter dyrket i sand er generelt ikke egnet for mikroskopi som sand partikler forstyrre observasjon av bakterier.
- Fjern anlegget fra en vekst beholder henhold til trinn 7. Plasser røttene i en beholder med vann og bland forsiktig for å fjerne sand som vil bosette til bunnen av beholderen.
- Fjerne anlegget fra vask vann og montere prøven som i trinn 6.3.3.
7. måling av vedheft bruke levedyktig cellen teller
- Bestemme antall levedyktig vedlagte bakterier ved hjelp av en sonicator.
- Fjerne ubundet bakterier. Plass prøven i et hetteglass med tilstrekkelig vann, vask buffer eller inkubasjon medium for å dekke plantemateriale og invertere ampullen flere ganger.
- Hvis det var mer enn 103 gratis bakterier per mL i den første inkubering, utføre sekvensiell vasker for å fjerne alle. Sjekke inn et lys mikroskop (se trinn 6.3) til å fastslå tilstedeværelsen av gratis bakterier.
- Vask før det er en betydelig reduksjon i antall gratis bakterier, men husk at det er en likevekt mellom bundne og ubundne bakterier så hvor mange gratis bakterier kan aldri redusere til null.
- Fjerne prøven fra ampullen med vask væske med en tang eller spatula.
- Bestemme antall bundne bakterier i incubations av væske.
- Suspendere vasket eksemplet i ampuller og dekke det med målte volum av vann, inkubasjon middels eller vaske bufferen. Bruke nok væske for å dekke prøven. Plasser ampullen i en bad sonicator og sonicate det i en min.
- Fjerne prøven og undersøker det under lys mikroskop for å avgjøre om bundet bakterier er fjernet fra anlegget. Fjerning av bakterier fra et utvalg av sonication er vist i figur 1. Hvis det er fortsette fortsatt bundet bakterier sonicating prøven til slike gangen ingen bundet bakterier forbli på prøven overflaten. Hvis bundet bakterier ikke kan fjernes ved sonication, legge til 1-10 mg/mL steril kvartssand og gjenta sonication og mikroskopisk undersøkelse.
- Bestemme at sonication prosedyren som synes mest effektive i trinn 7.1.3.2 ikke reduserer levedyktigheten til bakterier ved å stenge bakterier fra en flytende kultur i løsningen skal brukes for sonication (Legg kvartssand, hvis det var nødvendig). Bestemme den levedyktig celletall. Sonicate bakterier og bestemme den levedyktig celletall igjen.
Merk: Hvis det er en reduksjon i levedyktig celletall, endre prosedyren ved å endre sammensetningen av væske og/eller sonication tiden til behandling har ingen innvirkning på levedyktig celletall. - Bestemme at fortynning bufferen for levedyktig celletall ikke påvirker levedyktigheten til bakterier som har blitt ruget under betingelser brukes ved å sammenligne levedyktig celletall med ulike fortynning buffere og/eller vann.
- Fjerne ubundet bakterier. Plass prøven i et hetteglass med tilstrekkelig vann, vask buffer eller inkubasjon medium for å dekke plantemateriale og invertere ampullen flere ganger.
- Bestemme antall levedyktig vedlagte bakterier med homogenisering.
- Plass prøven i et sterilt mørtel eller blender eller andre homogenisering enhet. Dekke den med en målt mengde sterilt vann, inkubasjon middels eller vaske bufferen27. Bruke et volum som er tilstrekkelig til å dekke prøven. Bruke 100 mL en blender.
- Grind prøven før det er godt homogenisert. Sjekk pH etter homogenisering forsikre at syre fra anlegget vevet ikke har forårsaket en kraftig nedgang i pH under 7. Hvis pH har falt bruk en buffer som fosfatbuffer i homogenisering væsken for å opprettholde pH.
- Bestemme den levedyktig celletall.
- Bruk bakterier merket med antibiotikaresistens.
- I situasjoner der mer enn én type bakterie er tilstede, kan du merke bakteriell stammer med spontan resistens mot antibiotika (vanligvis og og nalidixic acid).
- Fastslå hvilket antibiotika å bruke. Hvis kulturer av andre organismer forventet å finnes i inkubering finnes, plate disse kulturene vokst under vilkår av den tiltenkte inkubering med planter på plater som inneholder en rekke konsentrasjoner av utvalgte antibiotika. Bestemme laveste konsentrasjonen som ikke tillater veksten av noen av disse organismene. Dette er den laveste konsentrasjonen av antibiotika som test bakterier må være motstandsdyktig.
- Få spontan antibiotika resistente mutantene. Vokse en kultur av bakterier i rike medium til sent loggen eller ro fase. Plate 0,1 mL ufortynnet på en plate som inneholder ønsket antibiotikaet på en passende konsentrasjon. Bestemme konsentrasjonen bruke som beskrevet i trinn 7.3.1.1. Holde og rense bakterier som vokser og er dermed resistente mot antibiotika.
- Bestemme at antibiotikaresistens ikke redusere veksten av bakterier ved å gjøre en vekstkurve i flytende medium overordnede og antibiotika resistente bakteriestammer. Bestemme at antibiotika resistente bakterier viser samme nivå av kolonisering av axenic plantemateriale som overordnet belastningen, hvis dette er mulig.
- I situasjoner der mer enn én type bakterie er tilstede, kan du merke bakteriell stammer med spontan resistens mot antibiotika (vanligvis og og nalidixic acid).
- Bestemme antall levedyktig bakterier bundet til planter dyrket i sand.
- Fjerne anlegget fra beholderen og sand. For å fjerne planter fra containere, må du først fjerne tetting materiale på toppen og bunnen av beholderen. Plasser beholderen over sterilt papir og forsiktig fjerne hele sand eller jord og plante som en stor konisk sylinder av forsiktig banket beholderen mot en overflate å løsne materialet.
- Om nødvendig kan du bruke en slikkepott eller stang for å løsne materialet rundt kantene gå inn gjennom bunnen av beholderen.
- Når sylinderen med sand eller jord som inneholder anlegget er gratis på papiret, dele det på midten å avsløre plante rot. Eventuelt kan du ta prøver av sand fra nær kanten på beholderen og nær. Dette kan være nyttig for å bestemme spredningen (og akkumulering og vekst) av bakterier.
- Måle lengden av roten. Plukk opp roten og fjerne sand og bakterier følge løst roten (rhizosphere materiale) av dipping roten i en målt mengde vann eller bufferen og forsiktig riste den. Bestemme levedyktig celle antall bakterier i resulterende suspensjon ved plating på et egnet som Luria agar. Dette representerer antallet bakterier løst knyttet til roten.
- Fjerne anlegget fra beholderen og sand. For å fjerne planter fra containere, må du først fjerne tetting materiale på toppen og bunnen av beholderen. Plasser beholderen over sterilt papir og forsiktig fjerne hele sand eller jord og plante som en stor konisk sylinder av forsiktig banket beholderen mot en overflate å løsne materialet.
- Fjerne tett bundet bakterier ved sonication og finne sine tall som beskrevet i trinn 7.1.
- Alternativt, for å avgjøre plasseringen på roten av tett bundet bakterier sted vasket roten på overflaten av en Petriskål som inneholder næringsrike agar eller annet egnet medium. Observere plasseringen av bakteriell koloniene på roten over de neste 3 dagene bruker dissecting mikroskop eller forstørrelsesglasset.
- Uttrykke resultater som antall bakterier per plante, per cm2 av areal, per cm rot lengde eller per gram ferske vekt av vev. Gjøre flere gjentak på samme dag, og også gjøre gjentak på ulike dager med forskjellige bakteriekulturer og annen masse plantemateriale.
8. fastsettelse av om en effekt av inkubasjon på vedheft er en respons av bakterier eller anlegget
- Bruk død eller drept plantemateriale.
- Utsett anlegget materiale til en rekke kjemikalier, fiksativene eller andre behandlinger som varme for å drepe den. Vask plantemateriale i vann og inkubasjon medium etter bruk av noen av disse behandlingene. Deretter vaksinere bakterier. Dette vil ikke ødelegge anlegget overflaten, men det vil gjøre det metabolically inaktive slik at den ikke kan svare på bakteriene.
- Måle bakteriell vedheft som beskrevet i trinn 6 og/eller 7. Også bestemme antall levedyktige cellers lagt til inkubering med plantemateriale i begynnelsen av inkubering og antall levedyktige cellers finnes på slutten av den inkubering å sikre at ingen giftige kjemikalier var tilstede under incubation.
- Bruk livløse materiale.
- Bruk bakteriell overholdelse av livløse materiale å avgjøre om en effekt sett på bakteriell tilslutning til plantemateriale er en effekt på anlegget eller bakterier. Velg en livløse materiale som binder bakterier og som er lik plantemateriale studerte i form og størrelse. Muligheter inkluderer filter papirer av alle typer (cellulose, nitrocellulose, glassfiber, polykarbonat, osv.), tråder (nylon, bomull, polyester, glass ull, osv.), glass eller plast coverslips, rustfritt stål kuponger og dialyse membraner.
- Vask livløse materiale grundig i vann og mediet der inkubering utføres og steriliseres før bruk. De fleste av materialer som er nevnt i trinn 8.2.1 er stabile til sterilisering av autoklavering.
- Inkuber livløse materiale under ønsket forhold og score som beskrevet i trinn 6 og 7. Et eksempel på bruk av nylontråder å fastslå at det skyldes redusert binding av A. tumefaciens å rot hår på høy kalsium konsentrasjoner (minst delvis) effekt av kalsium på bakterier er vist i Figur 428.
Representative Results
A. tumefaciens colonizes rot overflater. For å avgjøre om bakteriell produksjon av cellulose spiller en rolle i roten kolonisering, virkningene av bakteriell mutasjoner som hindrer cellulose syntese ble undersøkt16. Teknikkene som beskrives i trinn 1.3 og 7.1 ble brukt. Tomat frø var overflaten sterilisert og spirer i sterilt vann. Når røttene var ca 2 cm lange var dyppet i en suspensjon av 105 bakterier per mL og plantet i pasteurisert jord i containere. Plantene ble dyrket i 14 dager ved 25 ° C på en 12 h lys/12 h mørke syklus. Etter angitt tid plantene ble fjernet fra beholdere. Røttene var vasket og sonicated i et bad sonicator fjerne bundet bakterier. Bakteriell tall var fast bestemt på å bruke levedyktig celletall. Figur 2 viser effekten av to ulike cellulose-minus mutasjoner på evnen av bakterier for å kolonisere tomat røtter. Selv om standardavvik av noen målinger var så høyt som 0,9 logge10 (et vanlig problem med denne typen måling) reduksjon i binding av cellulose-minus mutanter er tydelig og vi kan konkludere med at bakteriell produksjon av cellulose hjelpemidler bakterier i koloniseringen av tomat røtter.
Figur 2 : Root kolonisering av wild type og cellulose-minus mutanter av A. tumefaciens. Logg10 totalt antall bakterier per cm rot lengde fra tomat røtter inokulert med vill type A. tumefaciens belastning C58 og cellulose-minus mutanter C58:1 og C58:A60. Tallene vises er midler av minst fire separate forsøk. Stolper angir standardavvik av midler. Røtter ble inokulert av dyppe dem i en suspensjon av 105 bakterier per mL i en min. Plantene ble dyrket i beholdere og løst tilhenger bakterier ble fjernet ved å vaske røttene i vaske bufferen i et hetteglass. Tett tilhenger bakterier ble fjernet med en bad sonicator og resulterende suspensjon belagt for å fastslå levedyktig celle teller16. Dette tallet er endret fra Matthysse og McMahan. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Rollen som exopolysaccharides i binding av E. coli og andre bakterier alfalfaspirer ble undersøkt. Noen utbrudd av diaré sykdom på grunn av E. coli O157: H7 har blitt sporet til forurenset alfalfaspirer. Binding av vill-type bakterier og mutanter kan ikke gjøre ulike exopolysaccharides ble målt ved hjelp av metodene beskrevet i trinnene 1.1, 5.1 og 7.2. Alfalfa sprouts var overflaten sterilisert og spirer for en dag i sterilt vann ved 25 ° C i mørket. Fire spirer med vedlagte frø frakker var plassert i steril plast retter som inneholder 5 mL vann. Bakterier dyrket i Luria kjøttkraft ble lagt til en siste konsentrasjon av ca 5 x 103 per mL. Inokulerte spirer ble inkubert ved 25 ° C i mørket i 3 dager. Spirer var vasket to ganger i 5 mL sterilt vann i ampuller av energisk inversjon og homogenisert i vaske bufferen med en motorisert Teflon glass homogenizer. Tidligere eksperimenter ved hjelp av bakterier merket med en plasmider bærer GFP genet viste ingen internalisert bakterier men overflaten bakterier var lett observeres. Resultatene vises i tabell 1. To stammer av E. coli O157: H7 ble undersøkt. I begge stammer syntes produksjon av poly-β-1,6-glucuronic acid(PGA) å lage det største bidraget til binding av patogene E. coli plante overflater. Colonic acid også spilt en viktig rolle i bindingen. Mens reduksjon i binding i cellulose-minus mutantene var betydelig var det ikke så stor som for de andre to polysakkaridene.
| Effekter av mutasjoner i Exopolysaccharide produksjon gener på Binding av E. coli O157: H7 spirer og åpen frø strøk | |||
| Bakterielle belastningen | Mutasjon eller anleggspreg (relevante fenotypen) | Logg10 antall bakterier bundet per spire, eller frø jakke | |
| Alfalfa spirerb | Åpne frø strøk | ||
| 86-24 | Ingen (wild type) | 4.7 ± 0,6 | 5.6 ± 0,2 |
| 8624N | yhjN (cellulose-minus) | 2.9 ± 0,7c | 3,5 ± 0,6c |
| 8624C | wcaD (colonic syre-minus) | 1,8 ± 0,7c | 2.4 ± 0,5c |
| 8624P | pgaC (PGA-minus) | < 1.0c | 1.0 ± 1.0c |
| DEC4A | Ingen (wild type) | 5.6 ± 0,2 | 6.1 ± 0,3 |
| DEC4AN | yhjN (cellulose-minus) | 4.8 ± 0,8d | 4.1 ± 0,8d |
| DEC4AC | wcaD (colonic syre-minus) | 3.9 ± 0,5c | 4.8 ± 0,8d |
| DEC4AP | pgaC (PGA-minus) | < 1.0c | 1.2 ± 0,7c |
| gjennomsnittlig ± standardavvik på minst tre målinger av nummeret (Logg10) bakterier bundet etter 3 dager. | |||
| b Sprouts var vasket før måling. | |||
| c vesentlig forskjellig fra vill-type: P < 0,01. | |||
| d vesentlig forskjellig fra vill-type: P < 0,05. | |||
| Denne tabellen er endret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10. | |||
Tabell 1: effekter av mutasjoner i exopolysaccharide produksjon gener på binding av E. coli O157: H7 til spirer. For å fastslå rollen av ulike exopolysaccharides og lipopolysakkarid i binding av patogene E. coli O157: H7 støtbelastning mot alfalfaspirer, binding av et sett av mutanter til spirer og åpen frø strøk ble undersøkt ved hjelp av metodene beskrevet i trinn 6. Resultatene viste at poly-ß-1, 6 -N-acetylen-D-glukosamin (PGA) synes å være avgjørende for binding til spirer og at både cellulose og colanic syre er nødvendig for maksimal binding av E. coli O157. Denne tabellen er endret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10.
For å avgjøre om produksjon av PGA er tilstrekkelig til å forårsake bakteriell binding til plante overflater, en plasmider (pMM11) bærer det klonede operon koding genene kreves for PGA ble produksjon introdusert i to forskjellige bakterier som ikke ville vanligvis kunne binde til tomat røtter10. A. tumefaciens A1045 er en mutant av vill type belastningen C58 som ikke klarer å foreta syklisk-β-1,2 Glukan og likeledes svikter å binde for å plante overflater29. Sinorhizobium meliloti 1021 som root knuter på alfalfa mislykkes å binde til ikke-belgfrukter inkludert tomat12. Teknikkene som beskrives i trinn 1.1, 5.1, 6.3 og 7.1 ble brukt til å avgjøre hvis evne til PGA generelt økte bakteriell binding til roten overflater. Tomat frø var overflaten sterilisert og spirer i sterilt vann. Røtter ble skåret i segmenter 1 cm i lengde og plassert i sterilt vann og bakterier ble inokulert. Som disse to arter av bakterier vokse på forskjellige rater, ble binding målt på ulike tider å tillate omtrent like mengder bakterievekst. Tilstedeværelsen av plasmider pMM11 forårsaket en tilsvarende betydelig økning i antall bundne bakterier på begge arter (tabell 2)10. En betydelig økning i binding ble også sett i lys mikroskopet, men bindingen var svært forskjellige for de to artene (Figur 3). A. tumefaciens A1045 bundet som individuelle bakterier til roten overflaten. S. meliloti bundet i store klynger som bare noen av bakterier var direkte knyttet til roten og fleste bakterier var knyttet til andre bakterier. Dette eksemplet viser at bare analysere antallet bakterier bundet uten inkludert mikroskopiske observasjoner kan gi et misvisende inntrykk av resultatet av et eksperiment. Selv om begge metodene (levedyktig celletall og mikroskopiske observasjoner) viser at pMM11 økt bakteriell binding til tomat røtter, var binde skyldes produksjon av PGA annerledes for to bakterie-art10.
| Effekten av plasmider pMM11 på Binding av bakterier til tomat røtter | ||
| Bakterielle belastningen | Plasmider | Antall bakterier bundet per mm rot lengde |
| A. tumefaciens A1045en | ingen | 0,25 x 103 ± 0,25 x 103 |
| pBBR1mcs (vektor) | 0,25 x 103 ± 0,25 x 103 | |
| pMM11 (PGA syntese) | 10 x 103 ± 0,25 x 103 | |
| S. meliloti 1021b | ingen | ingen oppdaget |
| pBBR1mcs (vektor) | ingen oppdaget | |
| pMM11 (PGA syntese) | 50 x 103 ± 5 x 103 | |
| en bakteriell binding ble målt etter 2 timer | ||
| b bakteriell bindende var tiltak etter timer | ||
| Denne tabellen er endret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10. | ||
Tabell 2: effekten av en plasmider bærer gener for syntese av PGA på binding av A. tumefaciens A1045 og S. meliloti 1021 tomat rot segmenter. Undersøke muligheten for poly-ß-1, 6 -N-acetylen-D-glukosamin (PGA) å fremme binding av bakterier å plante røtter, effekten av en plasmider til binding av to bakteriestammer plante-assosiert til evne til PGA (pMM11) tomat røtter ble undersøkt. Verken stamme av bakterien viste betydelige binding til tomat røtter i fravær av plasmider eller i nærvær av plasmider uten genene koding PGA syntese (pBBR1mcs). Tillegg av plasmider bærer PGA syntese gener økt binding av begge typer bakterier. Fordi A. tumefaciens vokser raskere enn S. meliloti binding ble målt etter 2 timer med inkubasjonstiden for A. tumefaciens og etter 18 h for S. meliloti. Teknikken er beskrevet i trinn 7. Denne tabellen er endret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10.
Figur 3 : Effekten av plasmider pMM11 bærer PGA biosyntesen genene i bindingen A. tumefaciens A1045 og S. meliloti 1021 til tomat rot hår. Binding til tomat rot hår a) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021 og D) S. meliloti 1021 pMM11. Selv om økningen i binding av de to bakterielle artene er omtrent like er detaljer om bindingen sett i lys mikroskopet ganske annerledes. Teknikken er beskrevet i trinn 6. Dette tallet er endret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Er det mulig å bruke binding til ikke-biologiske overflater for å hjelpe skille bidrag av bakterier og anlegget i en bestemt interaksjon. Den unipolar polysaccharide(UPP) av A. tumefaciens har vist å megle bakteriell binding til en rekke begge biologiske og ikke-biologiske overflater30. Kalsium ble observert for å hemme binding av A. tumefaciens plante overflater formidlet av UPP28. For å avgjøre om hemming av kalsiumioner bakteriell bindingen plante overflater er en effekt på bakterier eller plante overflaten, ble binding av bakterier til nylontråder undersøkt. Teknikker beskriver i trinn 8.2 ble brukt. Tomat frø var overflaten sterilisert og spirer i vann som beskrevet i trinn 1. Bakterien ble dyrket i minimal medium med sukrose og lagt til tomat røtter eller nylontråder i en siste konsentrasjon av ca 105/mL som beskrevet i trinn 5.1. Effekten av ekstra CaCl2 på bakteriell binding til tomat røtter og nylontråder ble undersøkt i mikroskopet. Figur 4 viser en lignende hemming av binding av kalsium bruker enten overflaten tyder på at effekten av kalsium er primært på bakterier10.
Figur 4 : Effekten av kalsium på binding av A. tumefaciens tomat rothår og nylontråder. A. tumefaciens ble inkubert med tomat røtter (A og B) eller nylontråder (C og D) for 24 timer i en 1:10 fortynning av MS salter og en 1:20 fortynning av AB minimal medium, 0,4% sukrose (A og C) eller i en 1:10 fortynning av MS salter og 1:20 fortynning av AB minimal medium , 0,4% sukrose inneholder 60 mM CaCl2 (B og D)31. Den ekstra CaCl2 hemmet bakteriell binding til både røtter og nylontråder antyder at hemming var hovedsakelig på grunn av en effekt på bakterier ikke på anlegget overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det er viktig å være klar over alle overflater som bakterier kan forholde seg under eksperimentet. Dermed bakterier som er i stand til å binde seg til glasset kan undervurderes hvis levedyktig celletall er gjort ved å bruke BILLEDRØR og pipetter. Hvis planter dyrkes i agar eller jord og noen av agar eller jord restene på planter og bakterier kan binde overholde materialet i stedet for plantene. På den annen side, vaske anlegget overflaten, spesielt når det gjelder røtter, kan fjerne naturlige overflate belegg som slimete og dermed endre resultatene av overholdelse tester.
Det er viktig å være sikker på at bakterier til inkubasjon blandingen forblir levende under eksperimentet. Dermed bør rutinemessig levedyktig celletall gratis samt tilknyttede bakterier gjøres. Noen behandlinger eller bakteriell mutasjoner kan redusere bakteriell vekst eller faktisk føre til at en brøkdel av bakteriell befolkningen. Levende og døde bakterier kanskje ikke skilles i mikroskopet hvis spesielle flekker brukes. Det er en nyttig flekken kit for live/døde bakterier som avhenger av utelukkelse av fargestoffer fra levende bakterier. Men hvis en blandet befolkning av bakteriell arter finnes så levedyktig celletall av arter av interesse er sannsynligvis den enkleste metoden for å avgjøre om inkubering resultert i bakteriell død.
Medium komposisjon vil påvirke bakteriell overlevelse og vekst. Root sårvæske og sluppet fra sår og kutt nettsteder vil gi substrat for å støtte beskjeden bakterievekst. Fosfat, jernoksid pleier å begrense i disse forholdene. Divalent kasjoner som kalsium og magnesium kan påvirke vedheft. I noen tilfeller kan karbon kilde påvirke vedheft. pH saker også. PH i rhizosphere er vanligvis mellom 5.5 og 6.5.
Er det nødvendig å være forsiktig i å bruke bakterier merket med antibiotikaresistens. Antibiotika som oftest brukes er og og nalidixic acid. Motstand mot disse antibiotika er vanligvis på grunn av mutasjoner i chromosomal gener (RNA polymerase og gyrase, henholdsvis) og dermed ikke kan enkelt overføres til en annen belastning under incubation. Denne typen motstand også resulterer ikke i nedbrytning eller endring av antibiotikaet. Merke bakterier med merketråd plasmider-borne genet anbefales ikke med mindre plasmider ikke kan overføres til eventuelle andre bakterier. Antibiotikaresistens må ikke skyldes degradering eller kjemisk endring av antibiotikaet som antibiotika følsom bakterier vil deretter kunne vokse på antibiotika plater hvis de er nær resistente bakterier.
Metodene som er beskrevet i denne artikkelen er nyttig for små utvalgsstørrelser og/eller eksperimenter hvor prøvene skal lagres (for eksempel eksperimenter som involverer mennesker). For store utvalgene (over 100 g av materielle eller mer enn 50 planter) vil andre metoder eller drastiske endringer i disse metodene være nødvendig10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. tilstedeværelsen av store antall mikroorganismer enn arter blir studert kan også utgjøre betydelige problemer. Mulige løsninger omfatter bruk av bakterier som er merket med et fluorescerende protein eller antibiotikaresistens som beskrevet i trinn 6.1.2 og 7.3. Men når bakterier rundt er rare personer i en stor befolkning av andre mikroorganismer kan stikkordmerker ikke være tilstrekkelig å tillate en entydig vurdering av antall bakterier blir studert.
Alle metodene som er beskrevet her er laboratory basert metoder. Mindre endringer ville være nødvendig for veksthus studier. Flere større modifikasjoner er sannsynlig å være nødvendig for feltstudier der protozoer, insekter og andre dyr predasjon og klima variant komplisere levering av definerte vilkårene for eksperimenter. Disse metodene kan i fremtiden bli utvidet til å omfatte samspillet av to eller flere anlegg overflaten.
Disclosures
Tilbyderen erklærer at hun har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatteren Takk Susan Whitfield for utarbeidelse av tall og Camille Martin og Hillary Samagaio for hjelp med noen av eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| light microscope | any | N/A | phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required. |
| seeds | any | N/A | make a note of the seed lot number and the cultivar |
| bleach | any | N/A | |
| bath sonicator | any scientific supply company | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| nutrient agar | Difco | 001-01-8 | |
| soytone | Difco | 24360 | |
| Sand | sea sand Fisher Scientific | S25 | |
| sand | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| conetainers | Stuewe & Sons, Inc. | Ray-Leach cone-tainers | many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow |
| parafilm | any scientific supply company | N/A | |
| MS salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| parrafin | any | N/A | |
| centrigfuge | any scientific company | N/A | to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed |
| vortex mixer | any scientific company | ||
| micrometer | ACCU-SCOPE Accessories | A3145 | |
| Sedgwick-rafter counting cell | Hauser Scientific | HS3800 | |
| probe-clip press-seal incubatin chamber | Sigma-Aldrich | Z359483 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| naladixic acid | Sigma-Aldrich | n8878 | |
| Live/dead stain | In Vitrogen Molecular Bioprobes | L7007 |
References
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).
- Beuchat, L. R. Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables. Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).
- Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
- Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).
- Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).
- Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).
- Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits. Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).
- Fuqua, C., Matthysse, A. G. Methods for studying bacterial biofilms associated with plants. Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).
- Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).
- Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).
- Matthysse, A. G., et al. The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).
- Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).
- Matthysse, A. G. Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells. Protoplasma. 183, 131-136 (1994).
- Matthysse, A. G., McMahan, S. The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).
- Jeter, C., Matthysse, A. G. Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).
- Matthysse, A. G., McMahan, S. Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Phenotypic analyses of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).
- Brandl, M. T. Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).
- Franz, E., et al. Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).
- Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).
- Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).
- Danhorn, T., Fuqua, C. Biofilm formation by plant-associated bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).
- Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere. Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, 252 (2014).
- Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells. J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).
- Tomlinson, A. D., Fuqua, C. Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens. Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, (2014).
- Wright, K. M., et al. The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots. Phytopathology. 103, 333-340 (2013).
- Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
- Erickson, M. C., et al. Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions. J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).
- McKellar, R. C., et al. Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce. Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).
- Wu, F. M., et al. Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds. Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).
