Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

Overholdelse af bakterier til at plante flader målt i laboratoriet

doi: 10.3791/56599 Published: June 19, 2018

Summary

En nem metode til måling og karakterisering af bakteriel adhæsion til planter, især rødder og spirer, der beskrives i denne artikel.

Abstract

Dette manuskript beskriver en metode til at måle bakteriel binding til axenic plante flader i den lysmikroskop og anvendelse af levedygtige celletal. Anvendte vegetabilske materialer omfatter rødder, spirer, blade, og skære frugt. De beskrevne metoder er billig, nem og velegnet til små stikprøver. Bindende måles i laboratoriet og en række inkubation media og betingelser kan bruges. Effekten af hæmmere kan bestemmes. Situationer, der fremmer og hæmmer bindende kan også vurderes. I nogle tilfælde er det muligt at skelne mellem om forskellige forhold ændre bindende primært på grund af deres virkninger på anlægget eller bakterier.

Introduction

Måling af bakteriel bindende at plante flader er blevet vigtigt i tre forskellige situationer. Den første situation er undersøgelse af overførslen af menneskelige patogener på plante flader1,2,3. Målet her er at forhindre bakteriel bindende eller til at fjerne eller dræbe bundne bakterier og dermed at mindske overførsel af sygdomme af plantemateriale. Den anden situation er undersøgelsen af bindingen af plante patogener til at plante flader4. Endnu en gang mål her er at forhindre bindende eller at fjerne eller dræbe bundne bakterier og dermed til at reducere sygdom. Den tredje situation er undersøgelsen af bindingen af symbiotiske eller plante-vækst-fremme bakterier5,6. Målet her er at fremme bakteriel bindende og dermed at stigningen plantesundhed og afgrøde udbytter.

Teknikker til måling af bakteriel bindende at plante flader er beskrevet i denne artikel er billig og relativt let at gennemføre. Det eneste krav er et mikroskop og materialer generelt fundet i et laboratorium, bakteriologi. Nogle teknikker er en bad sonikator nyttig. De teknikker, der beskrives er designet til bindende eksperimenter udført ved hjælp af relativt små stikprøver. Målinger af bindende er lavet i laboratoriet, selv om det kan være muligt at ændre nogle af disse teknikker til brug i drivhuset eller i feltet.

Disse teknikker har været brugt til at måle bakteriel binding til rødder, spirer, skåret blade, skåret frugt og intakt cherrytomater i laboratoriet7,8,9,10,11, 12,13,14,15. De har også været brugt til at måle root kolonisering af planter, der vokser i jord eller sand i laboratoriet16. Teknikkerne har været brugt med mange bakteriearter herunder Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica, og Pseudomonas fluorescens. En nyttig beskrivelse af metoder til vurdering af samspillet mellem A. tumefaciens og overflader kan findes i Morton og Fuqua (2012)17. I alle tilfælde var prøvestørrelser involveret lille, generelt mindre end 25-50 planter. De teknikker, der beskrives er velegnet til brug med menneskelige patogener, som skal holdes indeholdt under forsøgene.

Protocol

1. forberedelse af Axenic plantemateriale

  1. Forberede planter dyrket i vand.
    1. Placere et lille antal frø (mindre end 30) i en 30, 50, 100 eller 150 mL glas bægerglas. Vi har brugt tomat, Lucerne, Arabidopsis thaliana, ært, bønne, tobak, salat og gulerod frø med denne protokol.
      Bemærk: For at bestemme, hvor mange frø kan steriliseres sammen uden kontaminering spredes fra ét frø til en anden, se trin 1.1.2.
    2. Dække frøene med 80% ethanol og slyng kort. Lad frøene lægges i blød i 1 min.
    3. Hæld ethanol og dække frøene med en opløsning af 50% af volumen kommercielle blegemiddel (NaClO) og 0,1% Triton X-100 i vand fra hanen. Lad frøene lægges i blød i 20 min.
      Bemærk: Hvis frøene er store, såsom bønne frø, kan det være nødvendigt at forlænge den iblødsætning tid til helt dræbe svampe på frø overflade.
    4. Hæld blegemiddel blandingen og vask frøene 3 gange med sterilt vand. Lad frøene lægges i blød i vand i 1 minut for hver vask.
    5. For at opnå tilføje axenic stiklinger en lille mængde sterilt vand mellem 5 og 25 mL afhængigt af størrelsen af frøene. Hæld frø og vand i en steril petriskål for frø spiring.
      Bemærk: Vandet skal dække bunden af fadet men ikke dække frøene til at tilskynde til dannelsen af rodtråde. Axenic beskriver en kultur, hvor kun en enkelt art af skadegøreren er til stede.
    6. Inkuber i mørke, indtil udplantningsplanterne kommer til den ønskede størrelse mellem 1 cm og 10 cm (ca. 5 dage for tomat og A. thaliana og 1 til 3 dage for Lucerne). For større frø kan bruge en overdækket steril beholder med en kapacitet på mere end 100 mL som et glasfad dækket med folie.
  2. Bestemme hyppigheden af forurening af en bestemt frøparti med mikroorganismer, som forbliver levedygtige på eller inden for frø efter overflade-sterilisation.
    Bemærk: Dette er nødvendigt, fordi lejlighedsvis frø bære mikroorganismer under frø pelsen, som ikke kan blive dræbt af overflade-sterilisation. Bruge hyppigheden af forurenede frø i et frøparti til at bestemme, hvor mange frø for at sterilisere på én gang uden en høj risiko for gruppen af frø bliver forurenet på grund af ét frø med bakterier eller svampe, der kan overleve behandlingen.
    1. Udføre trin 1.1.1 gennem 1.1.3.
    2. Placer frø på et næringsstof agar petriskål. Sætte 10-30 frø i hver skål afstand dem, så at de kan blive scoret individuelt. Forsegle retter med tape eller forsegling film.
    3. Inkuber i 3-5 dage ved 25 ° C scoring hver dag for synlige udvækst af mikroorganismer fra frø.
  3. Forberede planter dyrket i sand. Planter kan dyrkes i sand til brug i bakteriel adhæsion eksperimenter.
    1. Udføre trin 1.1.1 gennem 1.1.3.
    2. Sterilisere kvarts eller sea sand i autoklaven. Begge disse indeholde nogle organisk materiale. Hvis dette vil påvirke eksperimentet, vask sandet ved at dække det med to gange dens volumen 0,1 M HCl. mix for 10 min. Tillad sand for at bosætte sig og hæld væsken. Skyl sand 3 gange med vand, og når med 80% ethanol efterfulgt af to ekstra vand skylninger ved hjælp af den samme protokol som for 0,1 M HCl. Sterilize vasket sandet i autoklaven.
    3. Sterilisere containere ved nedsænkning dem i 50% blegemiddel i 5 min. og skyl dem 5 gange med sterilt vand ved neddykning. Lade dem tørre og forsegle bunden med forsegling film. Film som fremstillet af producenten er generelt fri for mikroorganismer på indersiden side, som skal placeres vender indersiden af beholderen.
    4. Bland den sterilt sand med nok sterilt vand til våde det nok, at de sand pinde. Beløbet afhænger af hvordan tør sandet er. 10-35% af mængden af sandet er normalt tilstrækkeligt. Placer det våde sand i beholderen giver tilstrækkelig dybde til længden af rødder nødvendige og tilstrækkelig plads over sandet for vækst af skuddet. De nøjagtige afstande afhænger af arter og bred vifte af anlægget bliver brugt.
    5. Plantefrø.
      1. Lav en lavvandet hul i sandet med et sterilt glasstang bare dybt nok til at placere frø under overfladen af sand (ca 1-5 mm). Læg frøene i hullet. Dække det med et tyndt lag af sand. Forsegle toppen af beholderen med forsegling film for at forebygge tab af vand og indgangen til yderligere mikrober.
      2. Dyrke planter i laboratoriet under en lys eller i drivhus ved en passende temperatur og dag-længde for arter og bred vifte af anlægget. Tomat, Lucerne eller Arabidopsis thaliana bruge stuetemperatur og 12 h lys/mørke cyklus.
    6. Plante planter i et hul i sandet (1-2 mm i diameter og dyb nok at roden vil være dækket med sand). Lave hul med en steril glasstav. Guide rod forsigtigt ind i hullet ved hjælp af en steril rustfrit stål hæklenål hvis behov og udfylde siderne af hullet med sand.
  4. Alternativt kan du dyrke planter axenically på eller i agar indeholdende en salte blanding, såsom MS salte. Bruge skud af axenic planter dyrket i agar direkte. Undgå rødder vokset med agar som agar sticks til både plante overflade og bakterier. Dette kan medføre et falsk indtryk af bakteriel adhæsion til plante overflade.

2. forberedelse af andet plantemateriale

  1. Vask plantemateriale dyrkes i drivhus med vand før brugen for at reducere antallet af indfødte mikrober. Der vil være bakterier og svampe på planterne. Protozoer vil være til stede i jord, på rødderne, og eventuelt på bladene. Vask med blegemiddel eller ethanol vil ændre plante overflade og kan ikke anbefales.
    1. Hvis der efter vand vask betydeligt antal mikrober forblive, behandle planter med fortyndet flydende håndsæbe eller fortyndes hydrogenperoxid (0,01%) til at fjerne eller dræbe mikrober. Dette er generelt mindre skadelige for planten end blegemiddel eller ethanol.
  2. Da plantemateriale købt på et lokalt marked er vanskeligt at dekontaminere, vælge materiale, som ikke synes at have været udsat for lang opbevaring. Undgå at dele af materialet, der vises brune eller beskadiget.
    1. Vask det med vand og frisk nedskæringer på enderne af materiale, som er tidligere blevet skåret før du bruger det, medmindre interaktioner af de test bakterier med bakterier (og eukaryoter), som vil have akkumuleret på skære steder er af interesse. Ikke vaskes med blegemiddel eller ethanol som de vil ændre plante overflade
  3. Behandle sår websteder. Sår websteder giver ofte bakterier adgang til indre af plante materiale18.
    1. Blokere eller begrænse bakteriel vedhæftet fil til, og bevægelse gennem sår eller cut websteder oprettet i forbindelse med udarbejdelsen af materiale ved at dyppe den skåret kant i smeltet paraffin eller ved at male sitet med smeltet paraffin ved hjælp af en lille pensel. Brug ikke en spatel eller nogen skarp gennemføre, da dette kan beskadige vævet.
    2. Seal stammer ar på frugt såsom tomater med paraffin. Nogle bakterier vil svømme ind i området under paraffin, men deres tal er generelt små.
    3. Hvis bakteriel ibrugtagning sår websteder er af interesse, skøn afstanden der bakterier kan flytte transporteres af vand vandløb eller diffusion ved at observere bevægelsen af et farvestof føjes til en løsning. Marker motile bakterier ved at indføre et gen, der koder en fluorescerende proteiner såsom grøn fluorescerende proteiner (NGL) ind i dem og spore dem ved hjælp af Fluorescens mikroskopi beskrevet i trin 6.1.219.

3. forberedelse af bakterier

  1. Vokse bakterierne. Brug et medium, der kommer nærmest betingelser bakterier er tilbøjelige til at have været udsat for umiddelbart før støder på fabrikken i den virkelige verden uden for laboratoriet. Kulstof og kvælstof kilder samt tilstedeværelsen af ioner, især divalent kationer (Ca, Mg, Fe, Mn og Zn) og fosfat og pH af mediet er vigtigt.
    1. Bruge minimal AB medium eller Luria bouillon til A. tumefaciens og andre jord bakterier20. For E. coli, kan som stammer i tarmen, bruge Luria bouillon.
    2. Tilføje induktorer såsom rod ekssudater eller kommercielle planteekstrakter såsom soytone eller sukker saccharose eller xylose til de mellemstore21. Hvis disse stoffer anvendes som induktorer, tilføje en lav koncentration, for eksempel 0,01%. Hvis de anvendte carbon kilder, tilføje en højere koncentration, for eksempel 0,1%.
  2. Forberede den bakterielle inokulum. Fortynd bakterier i sterilt vand eller i medium hvor inkubation vil blive gennemført og tilføje dem til plantematerialet. Den passende fortynding er drøftet i trin 4.2 og 4.3.
    1. Hvis du vil fjerne vækst medier før ved hjælp af bakterier, centrifugeres den bakterielle suspension på 10.000 x g i 2 min., hæld supernatanten og resuspend bakterier ved vortexing dem i den samme medium, som vil blive brugt til udrugning med plantematerialet. Denne metode kan fjerne eller reducere antallet eller mængden af ekstracellulære materiale og vedhæng som exopolysaccharides, kapsler, flagellae og/eller pili. Hvis det er vigtigt at disse overfladen strukturer forbliver intakt, så blot fortyndes bakterier før vaccination dem eller bruge den alternative metode beskrevet taktfast 3.2.2.
    2. Som en alternativ metode til at fjerne vækstmediet, indsamle bakterier på en nitrocellulose eller polycarbonat-filter med en porestørrelse på 0,2 µm og derunder. Vaske bakterier med inkubation medium og resuspend dem af blid ryster eller vortexing af filteret i en steril beholder af mediet.

4. podning af bakterier

  1. Bestemme antallet af bakterier til at blive podet med henvisning til måling skal bruges til at bestemme bakteriel adhæsion og længden af inkubationstiden.
  2. Podes relativt stort antal bakterier for mikroskopiske undersøgelser der involverer inkubation gange mindre end 1 dag. Tilføje et beløb af kulturen at nå frem til en endelig bakteriel koncentration på mere end 106 bakterier pr. mL. Længere inkuberingstider formindske bakteriel inokulum.
  3. For undersøgelser som bakteriel adhæsion måles af levedygtige celletal, tilføje et beløb af kulturen at nå frem til en slutkoncentration på 10 bakteriel3 til 106 bakterier pr. mL.
  4. Undgå at tilføje så mange bakterier, deres stofskifte ændrer pH eller oxygen koncentrationen i inkubation medium. Måle pH med pH papir eller en elektrode. Måle koncentration af ilt ved hjælp af en ilt elektrode.
  5. For planter dyrket i sand, podes på tre mulige måder.
    1. Podes frø med bakterier før plantning af iblødsætning frø til 1 min i en suspension i vand i ca. 106 bakterier pr. mL.
    2. Podes roden af spire axenic stiklinger, som beskrevet i afsnit 1 og når sætteplante roden ca 1 cm lang dypper det eller placere hele sætteplante i en suspension af 106 bakterier pr. mL i vand i 1 min.
    3. Podes sand, ved at blande bakterier med sandet før plantning for at give en endelig koncentration på ca. 103 bakterier pr. mL eller ved vanding sætteplante med en suspension af 106 bakterier pr. mL efter plantning.

5. inkubation af bakterier med plantematerialet

  1. Til inkubation i flydende medier, inkuberes bakterier med plantemateriale i sterilt vand eller saccharose og mineralske salte eller plante væv næringssubstratet (såsom en 1:10 fortynding af MS salte)22,23.
    1. Bruge en container, som bakterierne ikke overholder. Prøv at holde planten overfladen dækket løbende enten ved nedsænkning eller af blid agitation. Energisk agitation kan forhindre friktion eller endda fjerne bakterier fra planten overflade.
    2. Observere plantemateriale i de lysmikroskop efter forskellige tidsintervaller at bestemme hvornår de skal stoppe inkubationen og foretage målinger. Et tidsforløb af vedhæftning er ofte værdifulde med prøver taget hver 1 til 4 h eller hver dag afhængigt af hastigheden af interaktionen.
  2. For at Inkuber i sand, gælde de samme overvejelser beskrevet for inkubation i flydende medium taktfast 5.1.

6. maaling af friktion ved hjælp af mikroskopi

  1. Foretage mikroskopisk målinger med Nomarski eller fasekontrast optik for nem visning af bakterier på overflader. Men enhver lysfelt lup med forstørrelse på 20 X eller højere kan bruges.
    1. Bruge mikroskopiske observation til at bestemme hvis bakterierne tilfældigt fordelt eller placeret i bestemte websteder. Også kontrollere, om de er bundet enkeltvis eller i klynger. Ser for tilstedeværelse af microcolonies tyder på bakteriel vækst eller fastklemning efter vedhæftning. Kontrollere, om bakterierne synes at danne en biofilm på overfladen.
      Bemærk: En biofilm er et stort antal bakterier bundet til overfladen og omgivet af en ekstracellulære matrix23,24,25. Strukturen kan være glat og ensartet eller har en mere kompliceret arkitektur. Metoder til at studere biofilm tilknyttet anlægget overflader har været beskrevet17.
    2. Bruge bakterier mærket med en fluorescerende markør. Hvis andre bakterier er til stede og bakterier af interesse er identificeret ved et fluorescerende tag som grøn fluorescerende proteiner, skal du bruge Fluorescens mikroskopi til at bestemme tilstedeværelsen af mærket bakterier i klynger af andre bakterier26. For normal god landbrugspraksis, skal du bruge et filter med 490 nm excitations- og 520 nm.
      1. Kontroller, at den fluorescerende tag ikke negativt påvirker bakterier ved at observere overholdelsen af axenic materiale af en lige blanding af vildtype bakterier og tagget bakterier af samme stamme ved hjælp af både Nomarski og fluorescens optik. Hvis de fluorescerende og mørke bakterier er tilfældigt blandet og i lige stort antal derefter tag ikke forstyrrer analysen.
  2. Bestem antallet af vedlagte bakterier.
    Bemærk: Det er meget vanskeligt at fastslå antallet af vedlagte bakterier i mikroskopet. Når bindingen er uregelmæssig plante overflader, er det generelt ikke muligt at opnå en kvantitativ måling. Scanning Elektron Mikroskopi (ikke omtales i denne artikel) kan bruges til at foretage sådanne målinger.
    1. Når bakterier er bundet til en glat overflade, såsom en rod hår, tælle antallet af bakterier bundet til kanten af rod hår pr. mm rod hårlængde. Sørge for at bruge rodtråde af nogenlunde samme størrelse og form i sammenligner målinger.
    2. Bestem størrelsen af objekter i mikroskopet, skal du bruge en kommerciel dias med målte markeringer på det. Observere og fotografere denne slide på de samme indstillinger som anvendes til eksperimentel materialet og bruge de resulterende billeder til at bestemme størrelsen af objekterne i mikrofotografier.
  3. Forberede prøven til mikroskopi.
    1. Vask prøven. Flytte prøven til en dråbe vand eller inkubation medium på et objektglas og observere det direkte.
      Bemærk: Dette har den fordel, at hvis der var ingen bakteriel vækst eller faktiske bakteriel død der er usandsynligt, at mange gratis bakterier. Tage manglen frie bakterier som et advarselssignal, der kan have været bakteriel død eller bakteriel binding til objektbeholderen inkubation foretog. Effekten af vask eksemplet er vist i figur 1.
    2. Vaske prøven forsigtigt i vand eller inkubation medium ved at placere det i et hætteglas med væske og invertere hætteglasset forsigtigt. Anbring prøven på objektglas i frisk væske til observation.
    3. Montere prøven i væske ved hjælp af en almindelig dækning slip og objektglas.
      1. Hvis prøven er tyk, og så ville gøre en bule under cover slip, bruge en press-apply dække slip. Disse dækker underkjoler har en ring af gummi eller plast rundt langs kanten af dækslet slip. Placer væske og prøve i godt i dækning slip og derefter placere slide på toppen og tryk ned forsigtigt for at forsegle dække slip til diaset. Invertere og undersøge.
      2. Alternativt bruge en alger tælle dias og dække slip på en lignende måde. Bemærk at dias med denne dybde generelt ikke kan undersøges med en målsætning linse på mere end 20 X forstørrelse.

Figure 1
Figur 1 : Skridt i udarbejdelsen af en prøve for fastsættelsen af antallet af bundet bakterier. A. tumefaciens bindende tomat rodtråde (A, B og C) og nylon tråde (D, E og F). I prøver monteret i vandet uden at vaske både bundet bakterier (sort pil) og gratis bakterier (hvide pile) kan ses (A og D). Efter vask de bundne bakterier forbliver men gratis bakterier er ikke længere til stede (B og E). Efter ultralydbehandling er bundne bakterier blevet fjernet fra prøveoverfladen (C og F). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

  1. Hvis fluorescerende bakterier blev anvendt, undersøge prøven i mikroskop efter sandet er blevet fjernet. Rødderne af planter dyrket i sand er generelt ikke egnet til mikroskopi, da sandet partikler forstyrre observation af bakterier.
    1. Fjerne planten fra en vækst container pr trin 7. Rødder i en beholder med vand og forsigtigt blandes for at fjerne sandet som vil bilægge til bunden af beholderen.
    2. Fjerne planten fra vaskevandet og montere prøven som i trin 6.3.3.

7. maaling af friktion ved hjælp af levedygtige celle tæller

  1. Bestem antallet af levedygtige vedlagte bakterier ved hjælp af en sonikator.
    1. Fjerne de ubundne bakterier. Prøven anbringes i et hætteglas med tilstrækkelig vand, vask buffer eller inkubation medium for at dække plantematerialet og vend hætteglasset flere gange.
      1. Hvis der var mere end 103 gratis bakterier pr. mL i den indledende inkubation, udføre sekventielle vask for at fjerne dem alle. Check i et lysmikroskop (Se trin 6.3) til at bestemme tilstedeværelsen af gratis bakterier.
      2. Udvaskes, indtil der er en betydelig reduktion i antallet af gratis bakterier, men husk at der er en ligevægt mellem bundne og ubundne bakterier så antallet af gratis bakterier kan aldrig falde til nul.
    2. Fjerne prøven fra hætteglas med vask væske med en pincet eller spatel.
    3. Bestem antallet af bundne bakterier i inkubationer af planter i væske.
      1. Suspendere vasket prøven i et hætteglas og dække det med en målte volumen af vand, inkubation medium eller vask buffer. Brug nok væske til at dække prøven. Hætteglasset i et badekar sonikator og sonikeres det i et minut.
      2. Fjerne prøven og undersøge det under lysmikroskop at afgøre, om de bundne bakterier er blevet fjernet fra anlægget. Fjernelse af bakterier fra en prøve ved hjælp af sonikering er vist i figur 1. Hvis der stadig er bundet bakterier til stede fortsætte sonicating prøven indtil et tidspunkt, der er ingen bundne bakterier tilbage på prøveoverfladen. Hvis de bundne bakterier ikke kan fjernes ved hjælp af sonikering, tilføje 1-10 mg/mL sterilt kvartssand og Gentag ultralydbehandling og mikroskopisk undersøgelse.
      3. Bestemme, ultralydbehandling procedure, som vises mest effektivt i trin 7.1.3.2 ikke mindsker levedygtigheden af bakterierne ved at suspendere bakterier fra en flydende kultur i opløsning skal anvendes ved ultralydbehandling (tilføje kvartssand, hvis det var nødvendigt). Bestemme levedygtige celletal. Der sonikeres bakterier og bestemme levedygtige celletal igen.
        Bemærk: Hvis der er en reduktion af levedygtige celletal, ændre proceduren ved at ændre sammensætningen af væske og/eller ultralydbehandling tiden, indtil behandlingen har ingen effekt på levedygtige celletal.
      4. Bestemme, at fortynding buffer anvendes til levedygtige celle tæller ikke påvirker levedygtigheden af bakterier, som har været inkuberet betingelser anvendes ved at sammenligne levedygtige celletal lavet ved hjælp af forskellige fortynding buffere og/eller vand.
  2. Bestem antallet af levedygtige vedlagte bakterier bruger homogenisering.
    1. Prøven anbringes i en steril morter eller blender eller andre homogenisering enhed. Dække det med en målte volumen af sterilt vand, inkubation medium eller vask buffer27. Brug en mængde tilstrækkelig til at dække prøven. En blender bruge 100 mL.
    2. Grind prøven, indtil det er godt homogeniseret. Tjek forårsaget pH efter homogenisering være sikker på, at syre frigivet fra plantevæv ikke har et skarpt fald i pH under 7. Hvis pH-værdien faldet brug en buffer som fosfat buffer i homogenisering væske til at opretholde pH.
    3. Bestemme levedygtige celletal.
  3. Brug bakterier markeret med antibiotikaresistens.
    1. I situationer, hvor mere end én type bakterie er til stede, Marker bakteriestammer ved hjælp af spontan resistens over for antibiotika (typisk rifampicin og nalidixic syre).
      1. Bestemme niveauet af antibiotika til at bruge. Hvis der findes kulturer af andre organismer forventes at være til stede i inkubation, plade disse kulturer, dyrket under betingelserne for den påtænkte inkubering med planter på plader, som indeholder en række koncentrationer af valgte antibiotika. Bestemme den laveste koncentration, der ikke tillader vækst af disse organismer. Dette er den laveste koncentration af antibiotika som test bakterier bliver nødt til at blive resistente.
      2. Få spontane antibiotikaresistente mutanter. Vokse en kultur af bakterier i rig medium til sen log eller stationære fase. Plade 0,1 mL ufortyndet på en tallerken, der indeholder den ønskede antibiotikum ved en passende koncentration. Bestemme koncentrationen skal bruge som beskrevet i trin 7.3.1.1. Holde og rense de bakterier, der vokser og er derfor modstandsdygtige over for antibiotika.
      3. Bestemme, at antibiotikaresistens ikke reducere væksten af bakterier ved at gøre en vækstkurve i Lage af overordnede og antibiotika-resistente stammer. Bestemme, at antibiotikaresistente bakterier viser det samme niveau af kolonisering af axenic plantemateriale som stamkulturen, hvis dette er muligt.
  4. Bestem antallet af levedygtige bakterier bundet til planter, der dyrkes i sand.
    1. Fjerne planten fra container og sand. Hvis du vil fjerne planter fra beholdere, skal du først fjerne forsegling materiale på toppen og bunden af beholderen. Beholderen anbringes over et stykke sterilt papir og forsigtigt fjerne hele sand eller jord og plante som én stor konisk cylinder af forsigtigt banke container mod en overflade til at løsne materialet.
      1. Hvis det er nødvendigt, brug en spatel eller stang til at løsne materiale omkring kanterne gennemgår bunden af beholderen.
    2. Når cylinderen på sand eller jord indeholdende anlægget er gratis på papiret, opdele det ned i midten til at afsløre plante rod. Hvis det ønskes, tage prøver af sand fra nær kanten af beholderen og i nærheden af roden. Dette kan være nyttigt at bestemme udbredelsen (og akkumulering og vækst) af bakterier.
    3. Måle længden af roden. Afhente rod og fjerne sand og bakterier vedhængende løst til root (det rhizosfære materiale) ved at dyppe rod i en afmålt mængde af vand eller buffer og forsigtigt ryste det. Bestemme levedygtige celletal af bakterier i den resulterende suspension af plating på et passende medie såsom Luria agar. Dette repræsenterer antallet af bakterier løst tilknyttet roden.
  5. Fjerne de stramt bundet bakterier ved hjælp af sonikering og bestemme deres numre som beskrevet i trin 7.1.
  6. Alternativt, for at bestemme placeringen på roden af de stramt bundet bakterier placere vasket roden på overfladen af en petriskål, som indeholder nutrient agar eller andet passende medium. Observere placeringen af bakteriel kolonier på roden over de næste 3 dage ved hjælp af en dissekere mikroskop eller Forstørrelsesglas.
  7. Express resultater som antal bakterier pr. plante, per cm2 overfladeareal, pr. cm rod længde eller pr. gram friske vægt af væv. Gøre flere replikater på den samme dag og også gøre replikater på forskellige dage ved hjælp af forskellige bakterielle kulturer og forskellige masser af plantemateriale.

8. bestemmelse af, om en effekt af inkubation betingelser på vedhæftning skyldes en reaktion af bakterier eller anlægget

  1. Bruge døde eller dræbte plantemateriale.
    1. Underlagt plante materiale til en lang række kemikalier, fikseringsmidler eller andre behandlinger såsom varme for at dræbe den. Vask plantematerialet grundigt i vand og inkubering medium efter brug af nogen af disse behandlinger. Derefter podes bakterier. Dette vil ikke ødelægge anlægget overflade, men det vil gøre det metabolisk inaktive, således at det ikke kan svare for bakterier.
    2. Måle bakteriel adhæsion, som beskrevet i trin 6 og/eller 7. Også bestemme antallet af levedygtige celler føjes til inkubation med plantemateriale i begyndelsen af i rugemaskinen og antallet af levedygtige celler findes i slutningen af inkubation at sikre, at ingen giftige kemikalier var til stede under inkubation.
  2. Bruge livløse materiale.
    1. Brug bakteriel tilslutning til livløse materiale at afgøre, om en effekt ses på bakteriel tilslutning til plante materiale er på grund af en effekt på anlægget eller bakterier. Vælg en livløse materiale til forpligter bakterier, og som er ens i form og størrelse til plantemateriale studerede. Mulighederne omfatter papirfiltre af alle typer (cellulose, nitrocellulose, glasfiber, polycarbonat, osv.), tråde (nylon, bomuld, polyester, glasuld, osv.), glas eller plastik coverslips, rustfrit stål kuponer og dialyse membraner.
    2. Vask livløse materialet grundigt i vand og det medium, hvori inkubation vil blive gennemført og sterilisere det før brug. De fleste af de materialer, der er angivet i trin 8.2.1 er stabil til sterilisation ved autoklavering.
    3. Inkuber den livløse materiale under de ønskede betingelser og score som beskrevet i trin 6 og 7. Et eksempel på brugen af nylon tråde til at fastslå, at den reducerede bindingen af A. tumefaciens til rodtråde på højt calcium koncentrationer due (i det mindste delvis) at en effekt af calcium på bakterier er vist i figur 428.

Representative Results

A. tumefaciens koloniserer root overflader. For at afgøre, om bakteriel produktion af cellulose spiller en rolle i rod kolonisering, virkningerne af bakteriel mutationer, som forhindrer cellulose syntese var undersøgt16. De teknikker, der beskrives i trin 1.3 og 7.1 blev brugt. Tomatfrø var overfladen steriliseret og spiret i sterilt vand. Når rødderne var ca 2 cm lange blev de dyppet i en suspension af 105 bakterier pr. mL og plantet i pasteuriseret jord i containere. Planterne blev dyrket i 14 dage ved 25 ° C på en 12-timers lys/12 h mørke cyklus. Når den angivne tid planterne blev fjernet fra beholderne. Rødderne blev vasket og sonicated i et badekar sonikator at fjerne bundet bakterier. Bakteriel numre blev bestemt ved hjælp af levedygtige celletal. Figur 2 viser effekten af to forskellige cellulose-minus mutationer på evnen af bakterier til at kolonisere tomat rødder. Selv om standardafvigelser af nogle målinger var så højt som 0,9 log10 (et fælles problem med denne form for måling) reduktion i bindingen af cellulose-minus mutanter er tydeligt og vi kan konkludere at bakteriel produktion af cellulose aids bakterier i kolonisering af tomat rødder.

Figure 2
Figur 2 : Root kolonisering af vildtype og cellulose-minus mutanter af A. tumefaciens. Log10 samlede antal bakterier pr. cm rod længde inddrives fra tomat rødder podet med vildtype A. tumefaciens stamme C58 og cellulose-minus mutanter C58:1 og C58:A60. Numrene er midler fra et minimum af fire separate eksperimenter. Angiver standardafvigelser af midlerne. Rødder blev podet ved at dyppe dem i en suspension af 105 bakterier pr. mL i ét minut. Planterne blev dyrket i containere og løst vedhængende bakterier blev fjernet ved at vaske rødder i vask buffer i et hætteglas. Stramt vedhængende bakterier blev fjernet ved hjælp af et badekar sonikator og den resulterende suspension belagt for at bestemme levedygtige celle tæller16. Dette tal er blevet ændret fra Matthysse og McMahan. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Rollen som exopolysaccharides i bindingen af E. coli og andre bakterier til lucernespirer blev undersøgt. Nogle udbrud af diarré sygdom på grund af E. coli O157: H7 er blevet sporet til forurenet lucernespirer. Binding af wild-type bakterier og mutanter afskåret fra skabe forskellige exopolysaccharides blev målt ved hjælp af metoderne i trin 1.1, 5.1 og 7.2. Lucernespirer var overfladen steriliseret og spiret til en dag i sterilt vand ved 25 ° C i mørke. Fire spirer med vedlagte frø frakker blev placeret i sterilt plastik skåle, som indeholder 5 mL vand. Bakterier dyrket i Luria bouillon blev føjet til en endelig koncentration på ca 5 x 103 pr. mL. De podede spirer blev inkuberet ved 25 ° C i mørke i 3 dage. Spirer blev vasket to gange i 5 mL sterilt vand i et hætteglas af energisk inversion og homogeniseret i vask buffer ved hjælp af en motordreven Teflon glas homogeniseringsapparat. Tidligere eksperimenter ved hjælp af bakterier er markeret med et plasmid, bærer normal god landbrugspraksis gen viste ingen internaliseret bakterier, selvom overflade bakterier var let observeret. Resultaterne er vist i tabel 1. To stammer af E. coli O157: H7 blev undersøgt. I begge stammer syntes produktionen af poly-β-1,6-glucuronsyre acid(PGA) at yde det største bidrag til binding af sygdomsfremkaldende E. coli at plante flader. Colon syre også spillet en betydelig rolle i bindende. Reduktion i bindende i cellulose-minus mutanter var betydelige men det var ikke så stor som for de andre to polysaccharider.

Virkninger af mutationer i Exopolysaccharide produktion gener på bindende af E. coli O157: H7 spirer og åbne frø frakker
Bakteriel stamme Mutation eller genotype (relevante fænotype) Log10 antal bakterier bundet pr. spire eller frø frakke
Lucerne spirerb Åben frø frakker
86-24 Ingen (vildtype) 4.7 ± 0,6 5.6 ± 0,2
8624N yhjN (cellulose-minus) 2.9 ± 0,7c 3,5 ± 0,6c
8624C wcaD (Colon syre-minus) 1.8 ± 0,7c 2.4 ± 0,5c
8624 PEDERSEN pgaC (PGA-minus) < 1.0c 1,0 ± 1,0c
DEC4A Ingen (vildtype) 5.6 ± 0,2 6.1 ± 0,3
DEC4AN yhjN (cellulose-minus) 4,8 ± 0,8d 4.1 ± 0,8d
DEC4AC wcaD (Colon syre-minus) 3,9 ± 0,5c 4,8 ± 0,8d
DEC4AP pgaC (PGA-minus) < 1.0c 1.2 ± 0,7c
en gennemsnit ± standardafvigelse for et minimum af tre målinger af (log10) antal og bakterier bundet efter 3 dage.
b spirer blev vasket før måling.
c afviger betydeligt fra den vilde type: P < 0,01.
d adskiller sig væsentligt fra den vilde type: P < 0,05.
Denne tabel er ændret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10.

Tabel 1: virkningerne af mutationer i exopolysaccharide produktion gener på bindingen af E. coli O157: H7 at spirer. For at bestemme forskellige exopolysaccharides og LPS i bindingen af patogene rolle E. coli O157: H7 stammer til lucernespirer, vil bindingen af et sæt af mutanter spirer og åbne frø frakker blev undersøgt ved hjælp af metoderne, der beskrevet i trin 6. Resultaterne viste, at poly-β-1, 6 -N-acetyl-D-Glukosamin (PGA) synes at være afgørende for binding til spirer og at både cellulose og colanic syre er nødvendige for maksimal binding af E. coli O157. Denne tabel er ændret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10.

For at afgøre, om produktion af PGA er tilstrækkeligt til at forårsage bakteriel bindende at plante flader, et plasmid (pMM11) transporterer den klonede operon kodning gener kræves for PGA blev produktion indført i to forskellige bakterier, som ikke ville normalt være i stand til at binde til tomat rødder10. A. tumefaciens A1045 er en mutant af vildtype stamme C58, som undlader at foretage cyklisk-β-1,2 glucan og også undlader at binde for at plante flader29. Sinorhizobium meliloti 1021, som danner rod knuder på Lucerne undlader at binde til ikke-bælgplanter herunder tomat12. De teknikker, der beskrives i trin 1.1, 5.1, 6.3 og 7.1 blev brugt til at bestemme, hvis evne til at gøre PGA generelt øget bakteriel binding til roden overflader. Tomatfrø var overfladen steriliseret og spiret i sterilt vand. Rødder blev skåret i segmenter 1 cm i længden og placeret i sterilt vand og bakterier blev podet. Da disse to arter af bakterier vokser i forskellige tempi, blev bindende målt på forskellige tidspunkter at tillade nogenlunde lige store mængder af bakterievækst. Tilstedeværelsen af plasmidet pMM11 forårsagede en lignende betydelig stigning i antallet af bundne bakterier af begge arter (tabel 2)10. En betydelig stigning i binding blev også set i det lys mikroskop, men bindingen var meget forskelligt for de to arter (figur 3). A. tumefaciens A1045 bundet som enkelte bakterier til roden overfladen. S. meliloti bundet i store klynger, hvor kun et par af bakterierne var direkte knyttet til roden og fleste af bakterier blev knyttet til andre bakterier. Dette eksempel viser, at blot analysere antallet af bakterier bundet uden herunder mikroskopisk observationer kan give et misvisende indtryk af resultaterne af et eksperiment. Selvom begge metoder (levedygtige celletal og mikroskopiske observationer) viser, at pMM11 øget bakteriel binding til tomat rødder, var typen af bindende forårsaget af produktionen af PGA forskellige for de to bakteriearter10.

Effekten af plasmidet pMM11 på bindende af bakterier til tomat rødder
Bakteriel stamme Plasmid Antallet af bakterier bundet pr. mm root længde
A. tumefaciens A1045en ingen 0,25 x 103 ± 0,25 x 103
pBBR1mcs (vektor) 0,25 x 103 ± 0,25 x 103
pMM11 (PGA syntese) 10 x 103 ± 0,25 x 103
S. meliloti 1021b ingen ingen fundet
pBBR1mcs (vektor) ingen fundet
pMM11 (PGA syntese) 50 x 103 ± 5 x 103
en bakteriel bindende blev målt efter 2 timer
b bakteriel bindende var foranstaltning efter 18 timer
Denne tabel er ændret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10.

Tabel 2: effekten af en plasmid udoever binding af gener syntesen af PGA A. tumefaciens A1045 og S. meliloti 1021 til tomat root segmenter. For at undersøge muligheden af poly-β-1, 6 -N-acetyl-D-Glukosamin (PGA) at fremme binding af bakterier til at plante rødder, effekten af et plasmid, giver mulighed for at foretage PGA (pMM11) for bindingen af to bakteriestammer plante-forbundet til tomat rødder blev undersøgt. Hverken stamme af bakterier viste betydelig binding til tomat rødder i mangel af plasmidet eller tilstedeværelse af plasmidet uden gener kodning PGA syntese (pBBR1mcs). Tilsætning af plasmid transporterer PGA syntese gener forøget binding af begge typer af bakterier. Fordi A. tumefaciens vokser hurtigere end S. meliloti bindende blev målt efter 2 h af inkubation i A. tumefaciens og 18 h for S. meliloti. De anvendte teknikker er disse beskrevet i trin 7. Denne tabel er ændret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10.

Figure 3
Figur 3 : Effekt af plasmidet pMM11 transporterer PGA biosyntesen gener for bindingen af A. tumefaciens A1045 og S. meliloti 1021 til tomat rodtråde. Binding til tomat rodtråde a) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021, og D) S. meliloti 1021 pMM11. Selv om stigningen i bindingen af de to bakteriearter er nogenlunde samme er detaljerne i bindende som set i det lys mikroskop helt anderledes. De anvendte teknikker er disse beskrevet i trin 6. Dette tal er blevet ændret fra Matthysse, Deora, Mishra og Torres10Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Det er nogle gange muligt at bruge binding til ikke-biologiske overflader til at støtte skelne bidrag af bakterier og plante i en bestemt interaktion. De unipolære polysaccharide(UPP) af A. tumefaciens har vist sig at være i stand til at mægle bakteriel binding til en bred vifte af både biologiske og ikke-biologiske overflader30. Calcium blev observeret for at hæmme bindingen af A. tumefaciens at plante flader medieret af UPP28. For at afgøre, om hæmning af calciumioner af bakteriel bindende at plante flader er på grund af en effekt på bakterierne eller på plant underlag, undersøgtes bindingen af bakterier til nylon tråde. Teknikkerne, der beskrives i trin 8.2 blev brugt. Tomatfrø var overfladen steriliseret og spiret i vand som beskrevet i trin 1. Bakterier var vokset i minimal medium med saccharose og tilføjet til tomat rødder eller nylon tråde i en endelig koncentration på ca 105/mL som beskrevet i trin 5.1. Effekten af ekstra CaCl2 på bakteriel binding til tomat rødder og nylon tråde blev undersøgt i mikroskop. Figur 4 viser en lignende hæmning af bindingen af calcium ved hjælp af enten overflade, tyder på, at effekten af calcium er primært på bakterier10.

Figure 4
Figur 4 : Effekten af calcium på bindingen af A. tumefaciens til tomat rodtråde og nylon tråde. A. tumefaciens blev inkuberet med tomat rødder (A og B) eller nylon tråde (C og D) i 24 timer i en 1:10 fortynding af MS salte og 1:20 fortynding af AB minimal medium, 0,4% saccharose (A og C) eller i en 1:10 fortynding af MS salte og 1:20 fortynding af AB minimal medium , 0,4% saccharose indeholdende 60 mM CaCl2 (B og D)31. Den tilføjede CaCl2 hæmmede bakteriel binding til både rødder og nylon tråde tyder på, at hæmning var primært på grund af en effekt på bakterierne ikke på plant underlag. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Det er vigtigt at være opmærksom på alle overflader som bakterier kan overholde under eksperimentet. Dermed bakterier, som er i stand til at binde sig til glas kan være undervurderet hvis levedygtige celletal er gjort ved hjælp af glasrør og pipetter. Hvis planter dyrkes i agar eller jord og nogle af agaren eller jorden forbliver på planter kan så bakterier binde den vedhængende materiale i stedet for planterne. På den anden side vask plante overflade, især i forbindelse med rødder, kan fjerne naturlige overflade belægninger såsom slim og dermed ændre overholdelse af testresultater.

Det er vigtigt at være sikker på, at bakterierne tilføjet til inkubation blandingen forblive i live under eksperimentet. Således bør levedygtige celletal af gratis samt vedlagte bakterier rutinemæssigt gøres. Nogle behandlinger eller bakteriel mutationer kan mindske bakteriel vækst eller faktisk forårsage død af en brøkdel af den bakterielle befolkning. Levende og døde bakterier kan ikke skelnes i mikroskopet, medmindre særlige pletter bruges. Der er en nyttig pletten kit til live/døde bakterier, som afhænger af udelukkelsen af farvestoffer fra levende bakterier. Men hvis en blandet population af bakteriearter er til stede så levedygtige celletal af arter af interesse er tilbøjelige til at være den letteste metode til at bestemme, om inkubationen har resulteret i bakteriel død.

Medium sammensætning vil påvirke bakteriel overlevelse og vækst. Roden ekssudat og materialer udgivet fra sår og skære sites vil give substrat til støtte for beskedne bakterievækst. Phosphat-, kvælstof- og iron stræbe imod være begrænsende i disse betingelser. Divalent kationer såsom calcium og magnesium kan påvirke vedhæftning. I nogle tilfælde kan kulstof kilde påvirke vedhæftning. pH også spørgsmål. PH-værdien af rhizosfære er generelt mellem 5,5 og 6,5.

Det er nødvendigt at være forsigtig i ved hjælp af bakterier markeret med antibiotikaresistens. De antibiotika oftest anvendes er rifampicin og nalidixic syre. Resistens over for disse antibiotika er generelt på grund af mutationer i kromosomale gener (RNA polymerase og gyrase, henholdsvis) og således ikke kan nemt overføres til en anden stamme under inkubation. Denne type af modstand også medfører ikke forringelse eller ændring af antibiotika. Mærkning bakterier med plasmid-bårne gen markør anbefales ikke, medmindre plasmidet ikke kan overføres til andre bakterier. Antibiotisk resistens må ikke skyldes nedbrydning eller kemisk modifikation af antibiotika som antibiotika følsomme bakterier vil derefter kunne vokse på antibiotika plader, hvis de er placeret tæt på de resistente bakterier.

Metoderne beskrevet i denne hvidbog er nyttigt for små stikprøver og/eller eksperimenter hvor prøverne, der skal være indeholdt (for eksempel, eksperimenter, der involverer menneskelige patogener). For store stikprøver (over 100 g af materiale eller mere end 50 planter) vil andre metoder eller drastiske ændring af disse metoder være behov for10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. tilstedeværelsen af stort antal mikroorganismer end arter undersøges kan også udgøre væsentlige problemer. Mulige løsninger omfatter brug af bakterier mærket med en fluorescerende proteiner eller antibiotikaresistens, som beskrevet i trin 6.1.2 og 7.3. Men når bakterier af interesse er sjældne personer i en stor population af andre mikroorganismer disse markører kan ikke være tilstrækkelig til at muliggøre en utvetydig vurdering af antallet af bakterier ved at blive undersøgt.

Alle metoderne beskrevet her er baseret laboratoriemetoder. Mindre ændringer ville være nødvendige for drivhusgasser undersøgelser. Flere større ændringer er tilbøjelige til at være nødvendig for feltundersøgelser hvor protozoer, insekter og andre dyr underbud og klima variation komplicere leveringen af definerede betingelser for forsøgene. Disse metoder kan i fremtiden udvides til at omfatte samspillet mellem to eller flere mikroorganismer på plant underlag.

Disclosures

Forfatteren erklærer, at hun har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatteren tak Susan Whitfield for forberedelse af tal og Camille Martin og Hillary Samagaio for assistance med nogle af eksperimenterne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
light microscope any N/A phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.
seeds any  N/A make a note of the seed lot number and the cultivar
bleach any N/A
bath sonicator any scientific supply company N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
nutrient agar  Difco  001-01-8
soytone Difco  24360
Sand sea sand Fisher Scientific S25
sand  Sigma-Aldrich S9887
conetainers Stuewe & Sons, Inc. Ray-Leach cone-tainers many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow
parafilm any scientific supply company N/A
MS salts Sigma-Aldrich M5524
parrafin any N/A
centrigfuge any scientific company N/A to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed
vortex mixer any scientific company
micrometer ACCU-SCOPE Accessories A3145
Sedgwick-rafter counting cell Hauser Scientific HS3800
probe-clip press-seal incubatin chamber Sigma-Aldrich Z359483
rifampicin Sigma-Aldrich R3501
naladixic acid Sigma-Aldrich n8878
Live/dead stain In Vitrogen Molecular Bioprobes L7007

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).
  2. Beuchat, L. R. Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables. Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).
  3. Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
  4. Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).
  5. Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).
  6. Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).
  7. Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits. Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).
  8. Fuqua, C., Matthysse, A. G. Methods for studying bacterial biofilms associated with plants. Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).
  9. Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).
  10. Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).
  11. Matthysse, A. G., et al. The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).
  12. Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).
  13. Matthysse, A. G. Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells. Protoplasma. 183, 131-136 (1994).
  14. Matthysse, A. G., McMahan, S. The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).
  15. Jeter, C., Matthysse, A. G. Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).
  16. Matthysse, A. G., McMahan, S. Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).
  17. Morton, E. R., Fuqua, C. Phenotypic analyses of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 3 (2012).
  18. Brandl, M. T. Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).
  19. Franz, E., et al. Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).
  20. Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 1 (2012).
  21. Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).
  22. Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).
  23. Danhorn, T., Fuqua, C. Biofilm formation by plant-associated bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).
  24. Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
  25. O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
  26. Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).
  27. Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere. Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).
  28. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, 252 (2014).
  29. Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells. J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).
  30. Tomlinson, A. D., Fuqua, C. Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens. Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).
  31. Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, (2014).
  32. Wright, K. M., et al. The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots. Phytopathology. 103, 333-340 (2013).
  33. Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
  34. Erickson, M. C., et al. Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions. J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).
  35. McKellar, R. C., et al. Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce. Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).
  36. Wu, F. M., et al. Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds. Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).
Overholdelse af bakterier til at plante flader målt i laboratoriet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (136), e56599, doi:10.3791/56599 (2018).More

Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (136), e56599, doi:10.3791/56599 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter