Summary
Een eenvoudige methode voor het meten en karakteriseren van bacteriële hechting op planten, met name wortels en spruiten, wordt in dit artikel beschreven.
Abstract
Dit manuscript beschrijft een methode voor het meten van de bacteriële binding aan een plant oppervlakken in de lichte Microscoop en door het gebruik van levensvatbare cellen. Plantaardig materiaal gebruikt bevatten spruiten, wortels, bladeren en fruit snijden. De beschreven methoden zijn goedkoop, eenvoudig en geschikt voor kleine steekproeven. Bindende wordt gemeten in het laboratorium en een verscheidenheid van incubatie media en voorwaarden kan worden gebruikt. Het effect van remmers kan worden bepaald. Situaties die bevorderen en remmen binding kunnen ook worden beoordeeld. In sommige gevallen is het mogelijk om te onderscheiden of verschillende omstandigheden bindende voornamelijk te wijten aan hun effecten op de plant of op de bacteriën veranderen.
Introduction
De meting van de bacteriële binding aan oppervlakken plant is belangrijk in drie verschillende situaties geworden. De eerste situatie is het onderzoek van de overdracht van ziekteverwekkers van de mens op plant oppervlakken,1,,2,3. Het doel hier is om te voorkomen dat de bacteriële binding of te verwijderen of afhankelijke bacteriën te doden en dus om de overdracht van ziekten door plantaardig materiaal. De tweede situatie is het onderzoek naar de binding van plant ziekteverwekkers aan oppervlakken4planten. Nogmaals het doel hier is om te voorkomen dat bindende of te verwijderen of afhankelijke bacteriën te doden en daarmee aan het verminderen van de ziekte. De derde situatie is het onderzoek naar de binding van de symbiotische of plant-groeibevorderende bacteriën5,6. Het doel hier is om bacteriële bindend en dus aan verhoging van de gezondheid van planten en gewassen oplevert.
De technieken voor het meten van de bacteriële binding aan planten van oppervlakken die in dit artikel beschreven zijn goedkope en relatief gemakkelijk uit te voeren. De enige vereisten zijn een microscoop en materialen vindt u meestal in een laboratorium voor bacteriologie. Voor sommige technieken is een ultrasoonapparaat Bad handig. De beschreven technieken zijn ontworpen voor het binden van experimenten uitgevoerd met behulp van relatief kleine steekproeven. Metingen van bindend worden gemaakt in het laboratorium, hoewel het mogelijk is dat sommige van deze technieken voor het gebruik in de serre of in het veld wijzigen.
Deze technieken zijn gebruikt voor het meten van de bacteriële binding aan de wortels, spruiten, gesneden bladeren, gesneden fruit en intact cherry tomaten in het laboratorium7,8,9,10,11, 12,13,14,15. Ze zijn ook gebruikt om te meten wortel kolonisatie van planten die groeien in de bodem of in het laboratorium16zand. De technieken zijn gebruikt met veel bacteriesoorten en Agrobacterium tumefaciens Sinorhizobium meliloti, Escherichia coli, Salmonella enterica, Pseudomonas fluorescens. Een nuttige beschrijving van methoden voor de beoordeling van de interactie van A. tumefaciens met oppervlakken kan worden gevonden in Morton en Fuqua (2012)17. In alle gevallen is de omvang van de steekproeven betrokken waren klein, over het algemeen minder dan 25-50 planten. De beschreven technieken zijn geschikt voor gebruik met menselijke pathogenen die moeten worden staande gehouden tijdens de experimenten.
Protocol
1. bereiding van een plantmateriaal
- Bereiden zaailingen gegroeid in water.
- Plaats een klein aantal zaden (minder dan 30) in een 30, 50, 100 of 150 mL glas bekerglas. Met dit protocol hebben we tomaat, alfalfa, Arabidopsis thaliana, erwt, Boon, tabak, sla en wortel zaden gebruikt.
Opmerking: Om te bepalen hoeveel zaden kunnen samen worden gesteriliseerd zonder besmetting zich verbreidt vanuit een zaad naar de andere, zie stap 1.1.2. - Bedek de zaden met 80% ethanol en kort wervelen. Laat de zaden weken voor 1 min.
- Giet af de ethanol en bedek de zaden met een oplossing van 50% van het volume commerciële bleekmiddel (NaClO) en 0,1% Triton X-100 in leidingwater. Laat de zaden weken voor 20 min.
Opmerking: Als de zaden groot, zoals bonen, zaden zijn, het kan noodzakelijk zijn om te verlengen van de inweken tijd om volledig het doden van schimmels op het oppervlak van het zaad. - Giet af het mengsel van bleekmiddel en de zaden 3 keer met steriel water wassen. Laat de zaden genieten in het water voor 1 min voor elke wassen.
- Om op te halen Voeg een zaailingen een kleine hoeveelheid steriel water tussen 5 en 25 mL afhankelijk van de grootte van de zaden. Giet de zaden en water in een steriele petrischaal voor de kieming van het zaad.
Opmerking: Het water moet betrekking hebben op de onderkant van de schotel maar niet Bedek de zaden ter bevordering van de vorming van root haren. Een beschrijving van een cultuur waarin slechts een enkele soort organisme aanwezig is. - Incubeer in het donker de zaailingen totdat de gewenste grootte tussen 1 cm en 10 cm (ongeveer 5 dagen voor tomaat en A. thaliana en 1 tot 3 dagen voor Luzerne). Gebruik een overdekte steriele container met een capaciteit van meer dan 100 mL zoals een glazen schotel bedekt met folie voor de grotere zaden.
- Plaats een klein aantal zaden (minder dan 30) in een 30, 50, 100 of 150 mL glas bekerglas. Met dit protocol hebben we tomaat, alfalfa, Arabidopsis thaliana, erwt, Boon, tabak, sla en wortel zaden gebruikt.
- Bepaal de frequentie van de besmetting van een bepaalde partij met micro-organismen die levensvatbaarheid op of binnen de zaden na oppervlak-sterilisatie.
Opmerking: Dit is nodig omdat occasionele zaden dragen micro-organismen onder de zaad-vacht die niet kan worden gedood door oppervlakte-sterilisatie. De frequentie van besmette zaden in veel zaad gebruiken om te bepalen hoeveel zaden te steriliseren tegelijk zonder een hoog risico van de groep van zaden steeds besmet als gevolg van een zaad met bacteriën of schimmels die de behandeling overleven.- 1.1.1 via 1.1.3 stappen uitvoeren.
- Plaats de zaden op een nutriëntagar petrischaal. Zetten over 10-30 zaden in elke schotel afstand tussen hen uit zodat zij afzonderlijk kunnen worden gescoord. Het zegel van de gerechten met tape of verzegeling film.
- Incubeer gedurende 3-5 dagen bij 25 ° C elke dag voor zichtbare uitgroei van micro-organismen uit de zaden te scoren.
- Bereiden zaailingen gegroeid in zand. Zaailingen kunnen worden geteeld in zand voor gebruik in bacteriële hechting proeven.
- 1.1.1 via 1.1.3 stappen uitvoeren.
- Kwarts of zee zand in de autoclaaf steriliseren. Beide bevatten sommige organisch materiaal. Als dit zal invloed hebben op het experiment, was het zand door bedekken met tweemaal haar volume van 0,1 M HCl. Mix voor 10 min. toestaan het zand om te regelen en giet af de vloeistof. Spoel het zand 3 keer met water, en een keer met 80% ethanol gevolgd door twee extra water gespoeld met behulp van hetzelfde protocol wat betreft de 0,1 M HCl. Sterilize het gewassen zand in de autoclaaf.
- Steriliseren containers door dompelen hen in 50% bleekwater gedurende 5 minuten en spoel ze 5 keer met steriel water door onderdompeling. Laten drogen en verzegel de bodem met het afdichten van de film. De film zoals verkregen van de fabrikant is over het algemeen vrij van micro-organismen aan de binnenkant zijde die tegenover de binnenkant van de container moet worden geplaatst.
- Meng het steriel zand met genoeg steriel water te bevochtigen het genoeg dat het zand stokken. Het bedrag zal afhangen van hoe droog het zand is. 10-35% van het volume van het zand is meestal voldoende. Plaats het natte zand in de container waardoor voldoende diepte voor de lengte van de wortels nodig en voldoende ruimte boven het zand voor de groei van de shoot. De exacte afstand is afhankelijk van de soorten en de variatie van de plant wordt gebruikt.
- Plant de zaden.
- Maak een ondiepe gat in het zand met een steriel glasstaafje gewoon diep genoeg om te plaatsen het zaad onder het oppervlak van het zand (ongeveer 1-5 mm). Plaats het zaad in het gat. Bedek het met een dun laagje zand. Het zegel van de bovenkant van de container met het afdichten van de film om te voorkomen dat het verlies van water en ingang van extra microben.
- Groeien de planten in het laboratorium onder een licht of in de serre op een passende temperatuur en dag-lengte voor de soorten en de verscheidenheid van de plant. Voor tomaten, alfalfa of Arabidopsis thaliana gebruik kamertemperatuur en 12 h licht/donker cyclus.
- Plant de zaailingen in een gat in het zand (1-2 mm in diameter en diep genoeg dat de wortel zal worden bedekt met zand). Maak het gat met een steriel glasstaafje. De wortel zorgvuldig begeleiden in het gat met behulp van een steriele roestvrij stalen haaknaald nodig als de zijkanten van het gat vullen met zand.
- U kunt ook planten axenically te groeien op of in agar met een mengsel van zouten, zoals zouten van MS. Gebruik schiet van een planten direct geteeld in agar. Vermijd wortels gegroeid met agar zoals agar houdt zich aan het oppervlak van de plant én de bacteriën. Dit kan resulteren in een valse indruk van bacteriële hechting aan het oppervlak van de plant.
2. voorbereiding van andere plantaardige materiaal
- Wassen plantmateriaal gegroeid in de serre met water vóór gebruik te verminderen van het aantal inheemse microben. Er zullen bacteriën en schimmels op de planten. Protozoa zal in de bodem, de wortels, en mogelijk de bladeren aanwezig zijn. Wassen met bleekmiddel of ethanol doet afbreuk aan het oppervlak van de plant en wordt niet aanbevolen.
- Als na het water wassen aanzienlijke aantallen van microben blijven, behandelen de planten met verdunde vloeibare hand zeep of verdunde waterstofperoxide (0.01%) te verwijderen of doden microben. Dit is over het algemeen minder schadelijk is voor de plant dan bleekmiddel of ethanol.
- Als plant is materiaal gekocht bij een lokale markt moeilijk te ontsmetten, kies materiaal dat niet lijkt te lange opslag hebben ondergaan. Vermijd het delen van het materiaal die bruin of beschadigd voorkomen.
- Wassen met water en verse bezuinigen op de uiteinden van materiaal dat eerder verlaagd alvorens het te gebruiken, tenzij de interacties van de bacteriën van de test met de bacteriën (en eukaryoten) die zal hebben verzameld op gesneden sites van belang zijn. Niet wassen met bleekwater of ethanol als ze doet afbreuk aan het oppervlak van de plant.
- Behandel de wond sites. Wond-sites bieden bacteriën vaak toegang tot het interieur van het plant materiaal18.
- Blokkeren of verminderen van de bacteriële gehechtheid aan, en het verkeer via, wond of gesneden sites die zijn gemaakt bij de voorbereiding van het materiaal door dompelen de gesneden rand in gesmolten paraffine of door het schilderen van de site met gesmolten paraffine met een kleine borstel. Gebruik geen een spatel of een scherpe implementeren als dit schade aan het weefsel veroorzaken kan.
- Zegel stammen littekens op groenten zoals tomaten met paraffine. Sommige bacteriën zal zwemmen in het gebied onder de paraffine, maar hun nummers zijn over het algemeen klein.
- Als bacteriële indienststelling wond sites van belang, raming de afstand die bacteriën zich kunnen verplaatsen die water streams of diffusie is door het observeren van het verkeer van een kleurstof toegevoegd aan de oplossing. Mark motile bacteriën door de invoering van een gen een fluorescente proteïne zoals groen fluorescente proteïne (GFP) codering in hen en ze traceren met behulp van fluorescentie microscopie in stap 6.1.219beschreven.
3. voorbereiding van de bacteriën
- De bacteriën groeien. Gebruik een medium dat dichtst de voorwaarden de bacteriën benadert zijn waarschijnlijk onmiddellijk voorafgaand aan de ontmoeting van de plant in de echte wereld buiten het laboratorium zijn blootgesteld aan. Koolstof en stikstof bronnen alsmede de aanwezigheid van ionen, met name divalente kationen (Ca, Mg, Fe, Mn en Zn) en fosfaat en de pH van het medium zijn belangrijk.
- Gebruik minimaal AB medium of Luria bouillon voor A. tumefaciens en andere bodem bacteriën20. Gebruik voor E. coli, die kunnen ontstaan in de darm, Luria Bouillon.
- Inductoren zoals wortel exsudaat of commerciële plantenextracten zoals soytone of suikers zoals sucrose of xylose toevoegen aan de middellange21. Als deze stoffen worden gebruikt als inductoren, voegt u een lage concentratie, bijvoorbeeld 0,01%. Als ze gebruikte koolstof bronnen, voeg een hogere concentratie, bijvoorbeeld 0,1%.
- De bacteriële entmateriaal voor te bereiden. Verdun de bacteriën in steriel water of in het medium waarin de incubatie wordt uitgevoerd en voeg ze toe aan het plantmateriaal. De aangewezen verdunning wordt besproken in stappen 4.2 en 4.3.
- Als u wilt verwijderen de groei media voordat u de bacteriën, centrifugeren van de bacteriële schorsing bij 10.000 x g gedurende 2 min, giet af het supernatant en resuspendeer de bacteriën door vortexing hen in hetzelfde medium die zal worden gebruikt voor de incubatie met het plantmateriaal. Deze methode kan verwijderen of verlagen van het aantal of de hoeveelheid extracellulaire materiaal en huiduitwassen zoals exopolysaccharides, capsules, flagellae en/of pili. Als het is belangrijk dat deze oppervlakte structuren intact blijven, dan gewoon de bacteriën verdund voordat ze enten of gebruik de alternatieve methode beschreven in stap 3.2.2.
- Als een alternatieve methode om te verwijderen groeimedium, de bacteriën op een nitrocellulose of polycarbonaat filter met een poriegrootte van 0,2 µm of minder te verzamelen. Wassen van de bacterie met het medium van de incubatie en resuspendeer hen door zacht schudden of vortexing van het filter in een steriele container van het medium.
4. de inoculatie van de bacteriën
- Bepaal het aantal bacteriën worden geïnoculeerd met betrekking tot de metingen die moeten worden gebruikt om te bepalen van bacteriële hechting en de duur van de incubatietijd.
- Inoculeer relatief grote aantallen bacteriën voor microscopische studies waarbij incubatie keer minder dan 1 dag. Voeg een hoeveelheid cultuur te bereiken een bacteriële eindconcentratie van meer dan 106 bacteriën per mL. Voor langere incubatietijd kleiner keer bacteriële entmateriaal.
- Studies waarin bacteriële hechting zal worden afgemeten aan levensvatbare cellen telt, voeg een hoeveelheid cultuur te bereiken een bacteriële eindconcentratie van 103 tot en met 106 bacteriën per mL.
- Vermijd het toevoegen van zoveel bacteriën dat hun metabolisme de pH of zuurstof concentratie in het incubatie-medium verandert. Meten van pH met pH-papier of een elektrode. Het zuurstofgehalte van de maatregel met een zuurstof-elektrode.
- Inoculeer voor planten gekweekt in zand, in drie mogelijke manieren.
- Het enten van het zaad met de bacteriën voor het planten van het zaad voor 1 min. onderdompelen in een suspensie in water van ongeveer 106 bacteriën per mL.
- Beënt de wortel door een zaailingen kiemen zoals beschreven in sectie 1 en wanneer de zaailing wortel is ongeveer 1 cm lang dompelen het of het plaatsen van de hele zaailing in een suspensie van 106 bacteriën per mL in water voor 1 min.
- Inoculeer zand door de bacteriën te vermengen met het zand voor het planten om een eindconcentratie van ongeveer 103 bacteriën per mL of door de zaailing met een suspensie van 106 bacteriën per mL water na het planten.
5. de incubatie van de bacterie met het plantmateriaal
- Voor incubatie in vloeibare media, Incubeer de bacteriën met het plantmateriaal in steriel water of sucrose en minerale zouten of plantaardige weefsels kweekmedium (zoals een 1:10 verdunning van MS zouten)22,23.
- Gebruik een container waarnaar de bacteriën niet aanhangen. Proberen te houden van het oppervlak van de plant bedekt continu door onderdompeling of zachte agitatie. Krachtige agitatie kan voorkomen hechting of zelfs verwijderen bacteriën uit het oppervlak van de plant.
- Observeer het plantmateriaal in de lichte Microscoop na verschillende tijdsintervallen om te bepalen wanneer om te stoppen met de incubatie en metingen. Een tijdsverloop van adhesie is vaak waardevolle met monsters van elke 1 tot en met 4 h of elke dag afhankelijk van de snelheid van de interactie.
- Om te broeden in zand, gelden dezelfde overwegingen voor incubatie in vloeistof in stap 5.1 beschreven.
6. meting van de hechting met behulp van microscopie
- Microscopische metingen met Nomarski of fase-contrast optiek voor het gemakkelijke bekijken van de bacteriën op oppervlakken maken Elke lichte-veld microscoop met vergroting van 20 X of hoger kan echter worden gebruikt.
- Microscopische observatie gebruiken om te bepalen als de bacteriën zijn willekeurig verdeeld of in specifieke sites. Ook controleren of ze afzonderlijk of in clusters gebonden zijn. Kijk voor de aanwezigheid van microcolonies suggereren bacteriële groei of beklemming na hechting. Controleer of de bacteriën lijken te vormen van een biofilm op het oppervlak.
Opmerking: Een biofilm is een groot aantal bacteriën gebonden aan het oppervlak en is omgeven door een extracellulaire matrix23,24,25. De structuur kan worden glad en uniform of een meer gecompliceerde architectuur hebben. Methoden voor het bestuderen van biofilms gekoppeld plant oppervlakken zijn beschreven17. - Gebruik van bacteriën die zijn gelabeld met een fluorescerende marker. Als andere bacteriën aanwezig zijn, maar de bacteriën van belang worden geïdentificeerd door een fluorescerende tag zoals groen fluorescent proteïne, gebruikt u de fluorescentie microscopie om te bepalen van de aanwezigheid van de tagged bacteriën in clusters van andere bacteriën26. Voor GFP, door een filter te gebruiken met 490 nm excitatie en 520 nm emissie.
- Controleer dat de fluorescerende tag is niet negatief van invloed op de bacteriën door het observeren van de hechting tot een materiaal met een gelijke mix van wild type bacteriën en tagged bacteriën van dezelfde stam met behulp van zowel de Nomarski als de fluorescentie optica. Als de fluorescerende en donkere bacteriën willekeurig gemengd en in gelijke aantallen aanwezig zijn dan de tag niet bemoeien met de test.
- Microscopische observatie gebruiken om te bepalen als de bacteriën zijn willekeurig verdeeld of in specifieke sites. Ook controleren of ze afzonderlijk of in clusters gebonden zijn. Kijk voor de aanwezigheid van microcolonies suggereren bacteriële groei of beklemming na hechting. Controleer of de bacteriën lijken te vormen van een biofilm op het oppervlak.
- Bepaal het aantal bijgevoegde bacteriën.
Opmerking: Het is erg moeilijk om te bepalen van het aantal bijgevoegde bacteriën in de Microscoop. Als de binding op onregelmatige plant oppervlakken is, is het over het algemeen niet mogelijk om een kwantitatieve meting. Scanning elektronen microscopie (die niet in dit artikel wordt besproken) kan worden gebruikt om dergelijke metingen.- Wanneer de bacteriën zijn gebonden aan een glad oppervlak zoals een haar van de wortel, tellen het aantal bacteriën gebonden aan de rand van het haar van de wortel per mm root haarlengte. Zorg voor het gebruik van root haren van ongeveer dezelfde grootte en vorm in het vergelijken van metingen.
- Om te bepalen van de grootte van objecten in de Microscoop, gebruikt u een commerciële dia met gemeten merktekens daarop. Observeren en fotograferen van deze dia op de dezelfde instellingen gebruikt voor de experimentele materiaal en de resulterende afbeeldingen gebruiken om te bepalen van de grootte van objecten in de photomicrographs.
- Het monster voorbereiden microscopie.
- Het wassen van het monster. Verplaatsen van het monster tot een daling van water of incubatie medium op een microscoopglaasje en het direct waarnemen.
Opmerking: Dit heeft het voordeel dat als er geen bacteriële groei of werkelijke bacteriële dood er zijn waarschijnlijk niet veel gratis bacteriën. Neem de afwezigheid van vrije bacteriën als een waarschuwing dat er weliswaar bacteriële dood of bacteriële binding aan de container waarin de incubatie werd uitgevoerd. Het effect van het wassen van het monster is afgebeeld in Figuur 1. - Wassen het monster zachtjes in water of incubatie medium door te plaatsen het in een flesje van vloeistof en de ampul voorzichtig omkeren. Plaats dan het monster op het microscoopglaasje in verse vloeistof voor observatie.
- Monteer het monster in vloeistof met behulp van een gewone cover slip en microscoopglaasje.
- Als het monster dik is en dus zou een verdikking onder de cover slip, gebruikt u een press-apply cover slip. Deze cover slips hebben een ring van rubber of plastic rond de rand van de slip van de cover. Plaats de vloeistof en het monster in de put in de cover slip en vervolgens de dia plaats op bovenkant en druk naar beneden voorzichtig te verzegelen de slip van de cover aan de dia. Omkeren en onderzoeken.
- Ook gebruiken een algen tellen dia en cover slip op een vergelijkbare manier. Merk op dat de dia's met deze diepte in het algemeen met een objectief van meer dan 20 X vergroting kunnen niet worden onderzocht.
- Het wassen van het monster. Verplaatsen van het monster tot een daling van water of incubatie medium op een microscoopglaasje en het direct waarnemen.
Figuur 1 : Stappen in de voorbereiding van een monster voor de bepaling van het aantal afhankelijke bacteriën. A. tumefaciens bindende tomaat wortel haren (A, B en C) en nylon draden (D, E en F). In monsters gemonteerd in water zonder wassen zowel bacteriën (zwarte pijlen gebonden) en gratis bacteriën (witte pijlen) kunnen worden gezien (A en D). Na het wassen de afhankelijke bacteriën blijven maar de vrije bacteriën zijn geen langer aanwezig (B en E). Na ultrasoonapparaat zijn de afhankelijke bacteriën verwijderd van het oppervlak van de steekproef (C en F). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
- Als tl bacteriën werden gebruikt, controleert u het monster in de Microscoop nadat het zand is verwijderd. Wortels van planten gekweekt in zand zijn over het algemeen niet geschikt voor microscopie als de deeltjes zand met de waarneming van de bacteriën interfereren.
- Het verwijderen van de plant uit een container van de groei vanaf stap 7. Plaats de wortels in een container van het water en zachtjes mix om te verwijderen het zand die naar de onderkant van de container regelen zal.
- Verwijderen van de plant uit het waswater en mount het monster zoals in stap 6.3.3.
7. meting van de hechting met behulp van levensvatbare cellen telt
- Bepaal het aantal levensvatbare bijgevoegde bacteriën met behulp van een ultrasoonapparaat.
- Verwijder de niet-afhankelijke bacteriën. Leg het monster in een flesje met voldoende water, buffer of incubatie medium om te dekken van het plantmateriaal en omkeren van de flacon meerdere malen wassen.
- Als er meer dan 103 gratis bacteriën per mL aanwezig zijn in de eerste incubatie, uitvoeren sequentieel spoelingen om alle van hen te verwijderen. Controleer in een lichte Microscoop (zie stap 6.3) om te bepalen van de aanwezigheid van vrije bacteriën.
- Wassen totdat er een aanzienlijke vermindering van het aantal vrije bacteriën maar vergeet niet dat er een evenwicht tussen afhankelijke en niet-afhankelijke bacteriën dus het aantal gratis bacteriën nooit tot nul dalen kan.
- Verwijder het monster uit het flesje vloeistof met een pincet of spatel te wassen.
- Bepaal het aantal afhankelijke bacteriën in incubations van planten in vloeistof.
- Opschorten van de gewassen monster in een flesje en bedek het met een afgemeten hoeveelheid water, of incubatie medium wassen buffer. Gebruik voldoende vloeistof ter dekking van het monster. Plaats de ampul in een bad ultrasoonapparaat en bewerk het ultrasone trillingen ten voor één min.
- Verwijder het monster en onderzoeken onder de lichte Microscoop om te bepalen of de afhankelijke bacteriën zijn verwijderd uit de plant. De verwijdering van de bacteriën uit een monster met het ultrasoonapparaat is afgebeeld in Figuur 1. Als er nog steeds gebonden bacteriën aanwezig blijven sonicating van het monster tot een tijdstip dat geen afhankelijke bacteriën op het oppervlak van de steekproef blijven. Als de afhankelijke bacteriën niet kunnen worden verwijderd met het ultrasoonapparaat, 1-10 mg/mL steriele kwartszand toevoegen en herhaal het ultrasoonapparaat en microscopisch onderzoek.
- Bepalen dat de procedure ultrasoonapparaat die lijkt het meest effectieve in stap 7.1.3.2 niet de levensvatbaarheid van de bacteriën vermindert door schorsing van de bacteriën uit een vloeibare cultuur in de oplossing moeten worden gebruikt voor ultrasoonapparaat (toevoegen kwartszand, als het nodig was). Het aantal levensvatbare cellen te bepalen. Bewerk de bacteriën ultrasone trillingen ten en het aantal levensvatbare cellen opnieuw bepalen.
Opmerking: Als er een afname van het aantal levensvatbare cellen, wijzigen de procedure door de samenstelling van de vloeistof en/of ultrasoonapparaat tijd totdat de behandeling geen invloed op het aantal levensvatbare cellen heeft te wijzigen. - Bepalen dat de buffer van de verdunning gebruikt voor levensvatbare cellen niet aan de levensvatbaarheid van bacteriën die onder de voorwaarden afdoet door het vergelijken van levensvatbare cellen graven gemaakt met behulp van verschillende verdunning buffers en/of water gebruikt hebben zijn geïncubeerd.
- Verwijder de niet-afhankelijke bacteriën. Leg het monster in een flesje met voldoende water, buffer of incubatie medium om te dekken van het plantmateriaal en omkeren van de flacon meerdere malen wassen.
- Bepaal het aantal levensvatbare bijgevoegde bacteriën met behulp van homogenisering.
- Leg het monster in een steriele vijzel of blender of andere homogenisering apparaat. Bedek het met een gemeten volume steriel water, of incubatie medium buffer27wassen. Gebruik een volume voldoende ter dekking van het monster. Voor een blender gebruiken 100 mL.
- Het malen van het monster tot het goed is gehomogeniseerd. Controleer de pH nadat homogenisering om zeker te zijn dat zuur vrijgelaten uit het weefsel van de plant niet geleid een scherpe daling in pH van minder dan 7 tot heeft. Als de pH gedaald gebruiken een buffer zoals fosfaatbuffer in de homogenisering vloeistof om de pH.
- Het aantal levensvatbare cellen te bepalen.
- Gebruik bacteriën gemarkeerd met resistentie tegen antibiotica.
- In situaties waarin meer dan één soort bacterie aanwezig is, markeren bacteriestammen met behulp van spontane resistentie tegen antibiotica (meestal rifampicine en nalidixic zuur).
- Bepaal het niveau van antibiotica te gebruiken. Als culturen van andere organismen moet aanwezig zijn in de incubatie verwacht beschikbaar zijn, plaat deze culturen gegroeid onder de voorwaarden van de beoogde incubatie met planten op platen met een aantal uiteenlopende concentraties van het gekozen antibiotica. Bepaal de laagste concentratie die geen groei van om het even welk van deze organismen staat. Dit is de laagste concentratie van een antibioticum waarnaar de bacteriën van de test moeten worden resistent.
- Spontane antibiotica resistente mutanten te verkrijgen. Groeien een cultuur van de bacteriën in rijke middellange tot eind logboek of stationaire fase. Plaat 0,1 mL onverdund op een bord met de gewenste antibioticum met een geschikte concentratie. Het bepalen van de concentraties te gebruiken zoals beschreven in stap 7.3.1.1. Houden en te zuiveren van de bacteriën die groeien en dus resistent zijn tegen het antibioticum.
- Bepalen dat resistentie tegen antibiotica niet de groei van de bacteriën vermindert door het doen van een groeicurve in de vloeistof van de ouder en het antibioticum resistente stammen. Bepalen dat de antibiotica resistente bacteriën hetzelfde niveau van kolonisatie van een plantaardig materiaal als de ouderstam, tonen als dit mogelijk is.
- In situaties waarin meer dan één soort bacterie aanwezig is, markeren bacteriestammen met behulp van spontane resistentie tegen antibiotica (meestal rifampicine en nalidixic zuur).
- Bepaal het aantal levensvatbare bacteriën gebonden aan planten gekweekt in zand.
- Het verwijderen van de plant uit de container en zand. Als u planten uit containers, wilt verwijderen eerst afdichting materiaal op de boven- en onderkant van de container. Plaats de container over een stuk steriel papier en zachtjes Verwijder de hele zand of bodem en plant als één grote taps toelopende cilinder zachtjes kloppen de container tegen een oppervlak het materiaal los te maken.
- Gebruik indien nodig een spatel of staaf los van het materiaal rond de randen doorlopen de onderkant van de container.
- Als de cilinder van zand of grond met de plant vrij op het papier is, kunt u het gesplitst in het midden te openbaren de wortel van de plant. Indien gewenst, monsters van de zand uit in de buurt van de rand van de container, maar ook in de buurt van de wortel nemen. Dit kan zinvol zijn om de verspreiding en accumulatie en groei van de bacteriën.
- Meet de lengte van de wortel. Ophalen van de hoofdmap en verwijder de zand en bacteriën vasthouden losjes aan de wortel (de rhizosfeer materiaal) door dompelen de wortel in een afgemeten hoeveelheid water of buffer en het zachtjes te schudden. Bepaal het aantal levensvatbare cellen van de bacteriën in de resulterende suspensie door plating op een geschikt medium zoals Luria agar. Hiermee wordt het aantal bacteriën losjes gekoppeld aan de hoofdmap.
- Het verwijderen van de plant uit de container en zand. Als u planten uit containers, wilt verwijderen eerst afdichting materiaal op de boven- en onderkant van de container. Plaats de container over een stuk steriel papier en zachtjes Verwijder de hele zand of bodem en plant als één grote taps toelopende cilinder zachtjes kloppen de container tegen een oppervlak het materiaal los te maken.
- Verwijder de strak gebonden bacteriën met het ultrasoonapparaat en bepalen hun nummers, zoals beschreven in stap 7.1.
- Als alternatief, als u wilt bepalen de locatie in de hoofdmap van de strak gebonden bacteriën plaats de gewassen wortel op het oppervlak van een petrischaal met nutriëntagar of een ander geschikt medium. De locatie van bacteriële kolonies in de hoofdmap observeren in de komende 3 dagen met behulp van een Microscoop ontleden of vergrootglas.
- Expliciete resultaten als aantal bacteriën per plant, per cm,2 van oppervlakte, per cm wortel lengte of per gram verse gewicht van weefsel. Meerdere wordt gerepliceerd op dezelfde dag en ook doen wordt gerepliceerd op verschillende dagen met verschillende bacteriële culturen en percelen van plantaardig materiaal.
8. om te bepalen of een effect van incubatieomstandigheden op hechting als gevolg van een reactie van de bacteriën of de plant
- Het gebruik van dode of gedode plantmateriaal.
- Onder voorbehoud van de plant materiaal aan een verscheidenheid van chemicaliën, fixatives of andere behandelingen zoals warmte om te doden. Het plantmateriaal grondig wassen in water en incubatie medium na het gebruik van om het even welk van deze behandelingen. De bacteriën dan worden geënt. Dit zal niet het vernietigen van het oppervlak van de plant, maar het zal het metabolisch inactief maken zodat het niet kan op de bacteriën reageren.
- Meten bacteriële wrijvingscoëfficiënt zoals beschreven in stappen 6 en/of 7. Ook bepalen het aantal levensvatbare cellen toegevoegd aan de incubatie met de plantmateriaal aan het begin van de incubatie en het aantal levensvatbare cellen aanwezig aan het eind van de incubatie om ervoor te zorgen dat geen giftige chemicaliën aanwezig tijdens de incubatie waren.
- Gebruik levenloos materiaal.
- Gebruik bacteriële aanhankelijkheid aan levenloze materiaal om te bepalen of een effect gezien op de naleving van de bacteriële plantmateriaal is te wijten aan een effect op de plant of de bacteriën. Kies een levenloos materiaal waarnaar de bacteriën binden en die is in vorm en grootte vergelijkbaar met het plantmateriaal studeerde. De mogelijkheden omvatten filtreerpapier van alle typen (cellulose, nitrocellulose, glasvezel, polycarbonaat, enz.), draden (nylon, katoen, polyester, glaswol, enz.), glas of plastic coverslips, RVS coupons en dialyse membranen.
- Het levenloos materiaal grondig in water en het medium waarin de incubatie wordt uitgevoerd en het steriliseren vóór gebruik te wassen. De meeste van de in stap 8.2.1 genoemde materialen zijn stabiel tot sterilisatie in autoclaaf.
- Incubeer de levenloos materiaal onder de gewenste voorwaarden en de score zoals beschreven in stap 6 en 7. Een voorbeeld van het gebruik van nylon draden om te bepalen dat de verminderde afhankelijkheid van A. tumefaciens aan root haren bij hoge calcium concentraties verschuldigd is (ten minste gedeeltelijk) naar een effect van calcium op de bacteriën wordt weergegeven in Figuur 428.
Representative Results
A. tumefaciens koloniseert wortel oppervlakken. Om te bepalen of bacteriële productie van cellulose een rol bij de kolonisatie van de wortel speelt, de effecten van bacteriële mutaties waardoor cellulose synthese waren onderzocht16. De technieken beschreven in stap 1.3 en 7.1 werden gebruikt. Tomaat zaden waren oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd in steriel water. Wanneer de wortels ongeveer 2 cm lang waren waren ze ondergedompeld in een suspensie van 105 bacteriën per mL en geplant in gepasteuriseerde bodem in containers. De planten werden gekweekt voor 14 dagen bij 25 ° C op een 12 h licht/12 h donker cyclus. Na de aangegeven tijden de planten werden verwijderd uit de containers. De wortels werden gewassen en sonicated in een bad ultrasoonapparaat afhankelijke bacteriën te verwijderen. Bacteriële aantallen werden vastgesteld met behulp van levensvatbare cellen. Figuur 2 toont het effect van twee verschillende cellulose-minus mutaties op het vermogen van de bacteriën te koloniseren tomaat wortels. Hoewel de standaarddeviaties van sommige metingen waren zo hoog als 0.9 log10 (een veelvoorkomend probleem bij dit soort meting) de afname van de binding van de cellulose-minus mutanten is duidelijk en kunnen we concluderen dat de bacteriële productie van cellulose helpt de bacteriën in de kolonisatie van de wortels van de tomaat.
Figuur 2 : Root kolonisatie door wild type en cellulose-minus mutanten van A. tumefaciens. Log10 totaal aantal bacteriën per cm wortel lengte verhaald tomaat wortels geënt met wild type A. tumefaciens stam C58 en cellulose-minus mutanten C58:1 en C58:A60. De getallen zijn de middelen van een minimum van vier afzonderlijke experimenten. Staven geven de standaarddeviaties van de middelen. Wortels waren geënt door dompelen hen in een suspensie van 105 bacteriën per mL voor één min. De planten zijn geteeld in containers en de losjes aanhangend bacteriën werden verwijderd door het wassen van de wortels in de buffer in een glazen ampul wassen. Strak aanhangend bacteriën werden verwijderd met behulp van een bad ultrasoonapparaat en de resulterende schorsing verguld en controleer of levensvatbare cellen telt16. Dit cijfer is gewijzigd van Matthysse en McMahan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De rol van exopolysaccharides in de binding van E. coli en andere bacteriën alfalfa spruiten werd onderzocht. Verontreinigde alfalfa spruiten hebben sommige uitbraken van diarree ziekte als gevolg van E. coli O157:H7 zijn opgespoord. Binding van de wild-type bacteriën en mutanten niet in staat om verschillende exopolysaccharides werd gemeten met behulp van de methoden in stap 1.1, 5.1 en 7.2 beschreven. Alfalfa spruiten waren oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd voor één dag in steriel water bij 25 ° C in het donker. Vier spruiten met bijgevoegde zaad jassen werden geplaatst in steriele kunststof gerechten met 5 mL water. Bacteriën gekweekt in Luria Bouillon werden toegevoegd aan een eindconcentratie van ongeveer 5 x 103 per mL. De geënte spruiten werden geïncubeerd bij 25 ° C in het donker voor 3 dagen. De spruiten waren tweemaal met 5 mL steriel water in een flesje gewassen door krachtige inversie en gehomogeniseerd in wassen buffer met behulp van een motoraangedreven Teflon glas homogenizer. Eerdere experimenten met behulp van bacteriën zijn voorzien van een plasmide die het GFP-gen toonde geen verinnerlijkte bacteriën Hoewel oppervlak bacteriën werden gemakkelijk waargenomen. De resultaten worden weergegeven in tabel 1. Twee stammen van E. coli O157:H7 werden onderzocht. In beide stammen verscheen de productie van poly-β-1,6-glucuronic acid(PGA) de grootste bijdrage te leveren aan de binding van de pathogene E. coli te planten oppervlakken. Colon zuur speelde ook een belangrijke rol in bindende. Terwijl de afname van de binding in cellulose-minus mutanten aanzienlijk was was het niet zo groot als die voor de andere twee polysacchariden.
| Effecten van mutaties in Exopolysaccharide productie genen op bindende van E. coli O157:H7 spruiten en open zaad jassen | |||
| Bacteriële stam | Mutatie of genotype (relevante fenotype) | Log10 aantal bacteriën gebonden per stronk of zaad jas | |
| Alfalfa spruitenb | Open zaad jassen | ||
| 86-24 | Geen (wild type) | 4.7 ± 0,6 | 5.6 ± 0,2 |
| 8624N | yhjN (cellulose-minus) | 2.9 ± 0,7c | 3,5 ± 0,6c |
| 8624C | wcaD (Colon zuur-minus) | 1.8 ± 0,7c | 2.4 ± 0,5c |
| 8624P | pgaC (PGA-minus) | < 1.0c | 1,0 ± 1.0c |
| DEC4A | Geen (wild type) | 5.6 ± 0,2 | 6.1 ± 0,3 |
| DEC4AN | yhjN (cellulose-minus) | 4,8 ± 0.8d | 4.1 ± 0.8d |
| DEC4AC | wcaD (Colon zuur-minus) | 3.9 ± 0,5c | 4,8 ± 0.8d |
| DEC4AP | pgaC (PGA-minus) | < 1.0c | 1.2 ± 0,7c |
| een gemiddelde ± standaardafwijking van ten minste drie metingen van het aantal (log10) voor bacteriën gebonden na 3 dagen. | |||
| b spruiten werden gewassen voor meting. | |||
| c wijkt sterk af van het wilde type: P < 0,01. | |||
| d wijkt sterk af van het wilde type: P < 0.05. | |||
| Deze tabel is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10. | |||
Tabel 1: gevolgen van mutaties in exopolysaccharide productie genen voor de binding van E. coli O157:H7 aan spruiten. Om te bepalen van de rol van verschillende exopolysaccharides en lipopolysaccharide in de binding van pathogene E. coli stammen van de O157:H7 aan alfalfa spruiten, de binding van een aantal mutanten aan de spruiten en open zaad jassen werd onderzocht met behulp van de methoden beschreven in stap 6. De resultaten toonden aan dat poly-ß-1, 6 -N-acetyl-D-glucosamine (PGA) lijkt te zijn essentieel voor binding met spruiten en dat zowel cellulose en colanic zuur zijn vereist voor maximale binding van E. coli O157. Deze tabel is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10.
Om te bepalen als de productie van PGA voldoende om te leiden tot bacteriële binding is aan planten oppervlakken, een plasmide (pMM11) uitvoering van de gekloonde operon codering van de genen die nodig is voor de PGA werd productie geïntroduceerd in twee verschillende bacteriën die niet zou gewoonlijk kunnen binden aan tomaat wortels10. A. tumefaciens A1045 is een mutant van de wild type stam C58 die er niet in slaagt te maken van cyclische-β-1,2-glucaan en ook niet lukt om te binden aan de plant oppervlakken29. Sinorhizobium meliloti 1021 die wortel knobbeltjes vormen op alfalfa niet binden aan niet-peulvruchten zoals tomaat12. De technieken beschreven in stap 1.1, 5.1, 6.3 en 7.1 werden gebruikt om te bepalen als de mogelijkheid om PGA over het algemeen bacteriële binding aan wortel oppervlakken toegenomen. Tomaat zaden waren oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd in steriel water. Wortels waren in segmenten 1 cm in de lengte gesneden en geplaatst in steriel water en de bacteriën zijn geënt. Aangezien deze twee soorten bacteriën tegen verschillende tarieven groeien, werd bindende gemeten op verschillende tijdstippen te voorzien in ongeveer gelijke hoeveelheden van bacteriële groei. De aanwezigheid van de plasmide-pMM11 veroorzaakt een soortgelijk aanzienlijke toename in het aantal afhankelijke bacteriën van beide soorten (tabel 2)10. Een aanzienlijke toename van de bindende werd ook gezien in de lichte Microscoop maar de binding was heel anders voor de twee soorten (Figuur 3). A. tumefaciens A1045 gebonden als afzonderlijke bacteriën op het oppervlak van de wortel. S. meliloti gebonden in grote clusters waarin slechts een paar van de bacteriën rechtstreeks zijn met de wortel verbonden en de meerderheid van de bacteriën waren gekoppeld aan andere bacteriën. Dit voorbeeld laat zien dat het simpelweg het analyseren van het aantal bacteriën gebonden zonder met inbegrip van microscopische opmerkingen een misleidende indruk van de resultaten van een experiment geven kan. Hoewel beide methoden (levensvatbare cellen en microscopische opmerkingen) dat pMM11 verhoogd bacteriële binding aan tomaat wortels tonen, was het soort bindende veroorzaakt door de productie van PGA verschillend voor de twee bacteriesoorten10.
| Het Effect van de plasmide-pMM11 op de Binding van bacteriën naar de wortels van de tomaat | ||
| Bacteriële stam | Plasmide | Afhankelijk van het aantal bacteriën per mm wortel lengte |
| A. tumefaciens A1045een | geen | 0.25 x 103 ± 0,25 x 103 |
| pBBR1mcs (vector) | 0.25 x 103 ± 0,25 x 103 | |
| pMM11 (PGA synthese) | 10 x 103 ± 0,25 x 103 | |
| S. meliloti 1021b | geen | geen gevonden |
| pBBR1mcs (vector) | geen gevonden | |
| pMM11 (PGA synthese) | 50 x 103 ± 5 x 103 | |
| een bacteriële binding werd gemeten na 2 uur | ||
| b bacteriële bindende was maatregel na 18 uur | ||
| Deze tabel is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10. | ||
Tabel 2: het effect van een plasmide die binding van genen voor de synthese van PGA A. tumefaciens A1045 en S. meliloti 1021 tomaat wortel segmenten. Om na te gaan van het vermogen van poly-ß-1, 6 -N-acetyl-D-glucosamine (PGA) ter bevordering van de binding van bacteriën te planten wortels, het effect van een plasmide toekenning van de mogelijkheid om PGA (pMM11) op de binding van twee stammen van bacteriën plant-geassocieerde wortels van de tomaat werd onderzocht. Noch spanning van bacteriën toonde significante binding met tomaat wortels in de afwezigheid van de plasmide of in aanwezigheid van de plasmide zonder de genen coderend voor PGA synthese (pBBR1mcs). De toevoeging van de plasmide uitvoering PGA synthese genen verhoogd bindende door beide soorten bacteriën. Omdat A. tumefaciens sneller groeit dan S. meliloti bindend Na incubatie gedurende A. tumefaciens per 2 uur en na 18 h voor S. melilotiwerd gemeten. De gebruikte technieken zijn die beschreven in stap 7. Deze tabel is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10.
Figuur 3 : Het effect van de plasmide pMM11 uitvoering van de PGA biosynthese genen op de binding van A. tumefaciens A1045 en S. meliloti 1021 aan tomaat wortel haren. Binding met tomaat wortel haren van A) A. tumefaciens A1045, B) A. tumefaciens A1045 pMM11, C) S. meliloti 1021, en D) S. meliloti 1021 pMM11. Hoewel de toename van de binding van de twee bacteriesoorten ruwweg gelijkaardig is zijn de details van de binding zoals gezien in het licht van de Microscoop heel verschillend. De gebruikte technieken zijn die beschreven in stap 6. Dit cijfer is gewijzigd van Matthysse, Deora Mishra en Torres10. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Het is soms mogelijk om te binden aan niet-biologische oppervlakken gebruiken om te helpen bij het onderscheiden van de bijdrage van de bacteriën en de plant in een specifieke interactie. De unipolaire polysaccharide(UPP) van A. tumefaciens is aangetoond te kunnen bemiddelen bacteriële binding aan een verscheidenheid van beide oppervlakken van biologische en niet-biologische30. Calcium werd waargenomen voor de remming van de binding van A. tumefaciens te planten oppervlakken gemedieerd door de UPP28. Om te bepalen dat of de remming door calciumionen van bacteriële binding aan oppervlakken plant te wijten aan een effect op de bacteriën of op het oppervlak van de plant is, de binding van de bacteriën op nylon draden werd onderzocht. De technieken worden beschreven in stap 8.2 werden gebruikt. Tomaat zaden waren oppervlak gesteriliseerd en ontkiemd in water zoals beschreven in stap 1. De bacteriën werden gekweekt in minimaal medium met sacharose en toegevoegd aan de tomaat wortels of nylon draden op een eindconcentratie van ongeveer 105/mL zoals beschreven in stap 5.1. Het effect van toegevoegde CaCl2 op bacteriële binding aan tomaat wortels en nylon draden werd in de microscoop onderzocht. Figuur 4 toont een soortgelijke remming van bindende door calcium met behulp van beide oppervlakte suggereren dat het effect van calcium voornamelijk op de bacteriën10 is.
Figuur 4 : Het effect van calcium op de binding van A. tumefaciens aan tomaat wortel haren en nylon draden. A. tumefaciens was geïncubeerd met tomaat wortels (A en B) of nylon draden (C en D) gedurende 24 uur in een 1:10 verdunning van MS zouten en een 1:20 verdunning van AB minimaal medium, 0,4% sucrose (A en C) of in een 1:10 verdunning van MS zouten en 1:20 verdunning van AB minimaal medium , 0,4% sacharose met 60 mM CaCl2 (B en D)31. De toegevoegde CaCl2 geremd bacteriële binding aan zowel de wortels als de nylon draden wat suggereert dat de remming voornamelijk te wijten aan een effect op de bacteriën in plaats van op het oppervlak van de plant was. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Het is belangrijk om zich bewust zijn van alle van de oppervlakken die bacteriën kunnen zich tijdens het experiment. Dus bacteriën die kunnen binden aan glas kunnen worden onderschat als levensvatbare cellen worden gedaan met behulp van glazen buizen en pipetten. Als planten worden geteeld in agar of bodem en een aantal van de agar of bodem op de planten blijft kunnen vervolgens de bacteriën binden aan de daaraan vastzittende materiaal in plaats van de planten. Aan de andere kant, het oppervlak van de plant, met name in het geval van wortels, wassen kan verwijderen natuurlijke oppervlaktecoatings zoals slijm en dus het veranderen van de resultaten van tests van de hechting.
Het is belangrijk om er zeker van zijn dat de bacteriën toegevoegd aan het mengsel van incubatie levend tijdens het experiment blijven. Levensvatbare cellen graven van zowel de gratis als de bijgevoegde bacteriën moeten dus regelmatig plaatsvinden. Sommige behandelingen of bacteriële mutaties kunnen verminderen van de bacteriële groei of daadwerkelijk leiden tot de dood van een breuk van de bacteriële bevolking. Levende en dode bacteriën mogelijk niet te onderscheiden in de Microscoop tenzij speciale vlekken worden gebruikt. Er is een nuttig vlek kit voor wonen/dode bacteriën, die afhangt van de uitsluiting van kleurstoffen uit de levende bacteriën. Echter, als een gemengde bevolking van bacteriesoorten aanwezig is dan levensvatbare cellen graven van de soorten van belang is waarschijnlijk de gemakkelijkste manier om te bepalen of de incubatie heeft geresulteerd in de bacteriële dood.
Middellange samenstelling zal beïnvloeden bacteriën overleven en groeien. Root afgescheiden en materialen vrijgelaten uit de wond en snijd sites bieden substraat om bescheiden bacteriële groei te ondersteunen. Ijzer, fosfaat en stikstof de neiging om in deze omstandigheden worden beperkt. Hechting kunnen van invloed zijn divalente kationen, zoals calcium en magnesium. In sommige gevallen kan koolstofbron hechting beïnvloeden. pH ook belangrijk. In het algemeen is de pH van de rhizosfeer tussen 5,5 en 6,5.
Er moet worden voorzichtig bij het gebruik van bacteriën die zijn gemarkeerd met resistentie tegen antibiotica. De meest gebruikte antibiotica zijn rifampicine en nalidixic zuur. Resistentie tegen deze antibiotica is over het algemeen als gevolg van mutaties in chromosomale genen (RNA polymerase en gyrase, respectievelijk) en dus niet gemakkelijk overdraagbaar aan een andere spanning tijdens de incubatie. Dit soort weerstand ook niet leidt tot de afbraak of de wijziging van het antibioticum. Markering van bacteriën met een marker gene plasmide-gedragen wordt niet aanbevolen tenzij het plasmide kan niet worden overgebracht naar een andere bacteriën. De resistentie tegen antibiotica moet niet als gevolg van aantasting of chemische modificatie van het antibioticum zoals antibiotica gevoelige bacteriën vervolgens kundig op antibiotica platen groeien zitten zal als zij zich dicht bij de resistente bacteriën bevinden.
De in dit document beschreven methoden zijn handig voor kleine steekproeven en/of experimenten waar de monsters moeten worden opgenomen (bijvoorbeeld experimenten met menselijke pathogenen). Bij grote steekproeven (boven 100 g materiaal of meer dan 50 planten) zou andere methoden of drastische wijziging van deze methoden nodig10,19,32,19,33, 34 , 35 , 36. de aanwezigheid van grote aantallen micro-organismen dan de soorten bestudeerd kan ook aanzienlijke problemen opleveren. Mogelijke oplossingen omvatten het gebruik van bacteriën die zijn gemarkeerd met een fluorescente proteïne of antibiotica-resistentie, zoals beschreven in stappen 6.1.2 en 7.3. Echter wanneer de bacteriën van belang zeldzame individuen in een grote populatie van andere micro-organismen zijn kunnen deze markers niet toereikend zijn om ondubbelzinnige eenbeoordeling van de nummers van de bacteriën wordt bestudeerd.
Al de hier beschreven methoden zijn op basis van laboratoriumtechnieken. Kleine wijzigingen nodig zou zijn voor broeikasgassen studies. Meer belangrijke wijzigingen dreigen te worden vereist voor veldstudies waar protozoa, insecten en andere dieren predatie en klimaat variatie bemoeilijken de levering van bepaalde voorwaarden voor de experimenten. Deze methoden kunnen in de toekomst worden uitgebreid tot de interactie van twee of meer micro-organismen op het oppervlak van de plant.
Disclosures
De auteur verklaart dat ze geen concurrerende financiële belangen heeft.
Acknowledgments
De auteur Bedankt Susan Whitfield voor de voorbereiding van de cijfers en Camille Martin en Hillary Samagaio voor hulp met een aantal van de experimenten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| light microscope | any | N/A | phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required. |
| seeds | any | N/A | make a note of the seed lot number and the cultivar |
| bleach | any | N/A | |
| bath sonicator | any scientific supply company | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| nutrient agar | Difco | 001-01-8 | |
| soytone | Difco | 24360 | |
| Sand | sea sand Fisher Scientific | S25 | |
| sand | Sigma-Aldrich | S9887 | |
| conetainers | Stuewe & Sons, Inc. | Ray-Leach cone-tainers | many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow |
| parafilm | any scientific supply company | N/A | |
| MS salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| parrafin | any | N/A | |
| centrigfuge | any scientific company | N/A | to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed |
| vortex mixer | any scientific company | ||
| micrometer | ACCU-SCOPE Accessories | A3145 | |
| Sedgwick-rafter counting cell | Hauser Scientific | HS3800 | |
| probe-clip press-seal incubatin chamber | Sigma-Aldrich | Z359483 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | |
| naladixic acid | Sigma-Aldrich | n8878 | |
| Live/dead stain | In Vitrogen Molecular Bioprobes | L7007 |
References
- Heaton, J. C., Jones, K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behaviour of enteropathogens in the phyllosphere: a review. J. Appl. Microbiol. 104, 613-626 (2008).
- Beuchat, L. R. Ecological factors influencing survival and growth of human pathogens on raw fruit and vegetables. Microbes Infect. 4, 413-423 (2002).
- Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
- Lugtenberg, B. J., Chin, A. W. T., Bloemberg, G. V. Microbe-plant interactions: principles and mechanisms. Antonie Van Leeuwenhoek. 81, 373-383 (2002).
- Preston, G. M., Haubold, B., Rainey, P. B. Bacterial genomics and adaptation to life on plants: implications for the evolution of pathogenicity and symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 1, 589-597 (1998).
- Compant, S., Duffy, B., Nowak, J., Clement, C., Barka, E. A. Use of Plant Growth-Promoting Bacteria for Biocontrol of Plant Diseases: Principles, Mechanisms of Action, and Future Prospects. Appl. Environ. Microbiol. 71, 4951-4959 (2005).
- Mathews, S. L., Smith, R. B., Matthysse, A. G. A comparison of the retention of pathogenic Escherichia coli. O157 by sprouts, leaves and fruits. Microb. Biotechnol. 7, 570-579 (2014).
- Fuqua, C., Matthysse, A. G. Methods for studying bacterial biofilms associated with plants. Methods Enzymol. 337, 3-18 (2001).
- Torres, A. G., Jeter, C., Langley, W., Matthysse, A. G. Differential binding of Escherchia coli.O157:H7 to alfalfa, human epithelial cells, and plastic is mediated by a variety of surface structures. Appl. Environ. Microbiol. 71, 8008-8015 (2005).
- Matthysse, A. G., Deora, R., Mishra, M., Torres, A. G. Polysaccharides cellulose, poly-beta-1,6-n-acetyl-D-glucosamine, and colanic acid are required for optimal binding of Escherichia coli O157:H7 strains to alfalfa sprouts and K-12 strains to plastic but not for binding to epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 74, 2384-2390 (2008).
- Matthysse, A. G., et al. The effect of cellulose overproduction on binding and biofilm formation on roots by Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1002-1010 (2005).
- Matthysse, A. G., Kijne, J. W. Attachment of Rhizobiaceae to plant cells. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Kluwer Academic Press. 235-249 (1998).
- Matthysse, A. G. Conditioned medium promotes the attachment of Agrobacterium tumefaciens.strain NT1 to carrot cells. Protoplasma. 183, 131-136 (1994).
- Matthysse, A. G., McMahan, S. The effect of the Agrobacterium tumefaciens. attR mutation on attachment and root colonization differs between legumes and other dicots. Appl. Environ. Microbiol. 67, 1070-1075 (2001).
- Jeter, C., Matthysse, A. G. Characterization of the binding of diarrheagenic strains of E. coli.to plant surfaces and the role of curli in the interaction of the bacteria with alfalfa sprouts. Mol. Plant Microbe Interact. 18, 1235-1242 (2005).
- Matthysse, A. G., McMahan, S. Root colonization by Agrobacterium tumefaciens is reduced in cel, attB, attD, and attR mutants. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2341-2345 (1998).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Phenotypic analyses of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 3 (2012).
- Brandl, M. T. Plant lesions promote the rapid multiplication of Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5285-5289 (2008).
- Franz, E., et al. Quantification of contamination of lettuce by GFP-expressing Escherichia coli O157:H7 and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Food Microbiol. 24, 106-112 (2007).
- Morton, E. R., Fuqua, C. Laboratory maintenance of Agrobacterium. Curr. Protoc. Microbiol. , Chapter 1 (2012).
- Lugtenberg, B. J., Kravchenko, L. V., Simons, M. Tomato seed and root exudate sugars: composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol. 1, 439-446 (1999).
- Murashige, T., Skoog, F. A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum. 15, 473-497 (1962).
- Danhorn, T., Fuqua, C. Biofilm formation by plant-associated bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 61, 401-422 (2007).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. Biofilms: the matrix revisited. Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).
- O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. Biofilm formation as microbial development. Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).
- Charkowski, A. O., Barak, J. D., Sarreal, C. Z., Mandrell, R. E. Differences in growth of Salmonella enterica and Escherichia coli O157:H7 on alfalfa sprouts. Appl. Environ. Microbiol. 68, 3114-3120 (2002).
- Loper, J., Suslow, T., Schroth, M. Lognormal distribution of bacterial populations in the rhizosphere. Phytopathology. 74, 1454-1460 (1984).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, 252 (2014).
- Douglas, C. J., Halperin, W., Nester, E. W. Agrobacterium tumefaciens mutants affected in attachment to plant cells. J. Bacteriol. 152, 1265-1275 (1982).
- Tomlinson, A. D., Fuqua, C. Mechanisms and regulation of polar surface attachment in Agrobacterium tumefaciens. Curr. Opin. Microbiol. 12, 708-714 (2009).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front Plant Sci. 5, (2014).
- Wright, K. M., et al. The endophytic lifestyle of Escherichia coli O157:H7: quantification and internal localization in roots. Phytopathology. 103, 333-340 (2013).
- Berger, C. N., et al. Fresh fruit and vegetables as vehicles for the transmission of human pathogens. Environ. Microbiol. 12, 2385-2397 (2010).
- Erickson, M. C., et al. Internalization and Fate of Escherichia coli O157:H7 in Leafy Green Phyllosphere Tissue Using Various Spray Conditions. J. Food Prot. 77, 713-721 (2014).
- McKellar, R. C., et al. Evaluation of different approaches for modeling Escherichia coli O157:H7 survival on field lettuce. Int. J. Food Microbiol. 184, 75-85 (2014).
- Wu, F. M., et al. Factors influencing the detection and enumeration of Escherichia coli O157:H7 on alfalfa seeds. Int. J. Food Microbiol. 71, 93-99 (2001).
