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Environment

जीवाणुओं का पालन संयंत्र के लिए प्रयोगशाला में मापा सतहों

doi: 10.3791/56599 Published: June 19, 2018

Summary

पौधों, विशेष रूप से जड़ों और अंकुरित करने के लिए बैक्टीरियल आसंजन को मापने और निस्र्पक के लिए एक आसान तरीका है, इस लेख में वर्णित है ।

Abstract

इस पांडुलिपि एक विधि का वर्णन करने के लिए जीवाणु बाध्यकारी axenic संयंत्र के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोप में सतहों और व्यवहार्य कोशिका गिनती के उपयोग के माध्यम से । उपयोग की गई पादप सामग्रियों में जड़ें, अंकुर, पत्तियां और कटे हुए फल शामिल हैं । वर्णित तरीके सस्ती, आसान है, और छोटे नमूना आकार के लिए उपयुक्त हैं । बाध्यकारी प्रयोगशाला और मशीन मीडिया और शर्तों की एक किस्म में मापा जाता है इस्तेमाल किया जा सकता है । अवरोधकों का प्रभाव निर्धारित किया जा सकता है । स्थितियों को बढ़ावा देने और बाध्यकारी को बाधित भी मूल्यांकन किया जा सकता है । कुछ मामलों में यह अंतर है कि विभिन्न स्थितियों मुख्य रूप से संयंत्र पर या बैक्टीरिया पर उनके प्रभाव के कारण बंधन बदलने के लिए संभव है.

Introduction

सतहों संयंत्र के लिए बाध्यकारी बैक्टीरियल की माप तीन अलग स्थितियों में महत्वपूर्ण हो गया है । पहली स्थिति संयंत्र पर मानव रोगजनकों के संचरण की परीक्षा है1,2,3सतहों । यहां लक्ष्य को बैक्टीरियल बाध्यकारी को रोकने के लिए या हटाने या बाध्य जीवाणुओं को मारने और इस तरह संयंत्र सामग्री से रोग के संचरण को कम करने के लिए है । दूसरी स्थिति संयंत्र रोगजनकों की बाध्यकारी संयंत्र के लिए की परीक्षा है4सतहों । एक बार फिर यहां लक्ष्य को रोकने के लिए बाध्यकारी या हटाने या बाध्य बैक्टीरिया को मारने और इस तरह के रोग को कम करने के लिए है । तीसरी स्थिति सहजीवी या संयंत्र की बाइंडिंग की परीक्षा है-विकास-को बढ़ावा देने बैक्टीरिया5,6। यहां लक्ष्य के लिए बैक्टीरियल बाध्यकारी को बढ़ावा देने और इस प्रकार संयंत्र स्वास्थ्य और फसल की पैदावार बढ़ाने के लिए है ।

इस लेख में वर्णित सतहों संयंत्र के लिए बाध्यकारी बैक्टीरियल मापने के लिए तकनीक सस्ती और बाहर ले जाने के लिए अपेक्षाकृत आसान कर रहे हैं । केवल आवश्यकताओं एक खुर्दबीन और सामग्री आम तौर पर एक वैक्टीरिया प्रयोगशाला में पाया जाता है । कुछ तकनीकों के लिए एक स्नान sonicator उपयोगी है । वर्णित तकनीकों को अपेक्षाकृत छोटे नमूना आकारों का उपयोग करके किए गए बाइंडिंग प्रयोगों के लिए डिज़ाइन किया गया है । बाइंडिंग की माप प्रयोगशाला में किए गए हैं, हालांकि यह ग्रीनहाउस में या क्षेत्र में उपयोग के लिए इन तकनीकों में से कुछ को संशोधित करने के लिए संभव हो सकता है ।

इन तकनीकों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है बैक्टीरियल बाध्यकारी जड़ों के लिए, अंकुरित, कट पत्तियों, कट फल, और बरकरार चेरी टमाटर प्रयोगशाला में7,8,9,10,11, 12,13,14,15. वे भी16प्रयोगशाला में मिट्टी या रेत में बढ़ रही पौधों की जड़ औपनिवेशीकरण उपाय करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । तकनीक एग्रोबेक्टीरियम tumefaciens, Sinorhizobium meliloti, ई कोलाई, साल्मोनेला enterica, और Pseudomonas fluorescensसहित कई जीवाणु प्रजातियों के साथ प्रयोग किया गया है । सतहों के साथ एक. tumefaciens की बातचीत का आकलन करने के लिए तरीकों का एक उपयोगी वर्णन Morton और Fuqua (२०१२)17में पाया जा सकता है । सभी मामलों में शामिल नमूना आकार छोटे थे, आम तौर पर कम से 25-50 पौधों । वर्णित तकनीकों मानव रोगजनकों जो प्रयोगों के दौरान निहित रखा जाना चाहिए के साथ प्रयोग के लिए उपयुक्त हैं ।

Protocol

1. Axenic संयंत्र सामग्री की तैयारी

  1. पानी में उगाए गए अंकुर तैयार करें ।
    1. एक 30, ५०, १००, या १५० मिलीलीटर ग्लास चोंच में बीज की एक छोटी संख्या (30 से कम) रखें । हम इस प्रोटोकॉल के साथ टमाटर, अल्फला, Arabidopsis थालियाना, मटर, सेम, तंबाकू, सलाद, और गाजर के बीज का इस्तेमाल किया है ।
      नोट: यह निर्धारित करने के लिए कितने बीज एक साथ दूषण के बिना निष्फल जा सकता है एक बीज से दूसरे में फैल, 1.1.2 कदम देखें ।
    2. ८०% इथेनॉल के साथ बीज कवर और संक्षेप में घूमता है । बीज 1 मिनट के लिए भिगो दें ।
    3. बंद इथेनॉल डालो और ५०% की मात्रा वाणिज्यिक ब्लीच (NaClO) और ०.१% ट्राइटन X-१०० नल के पानी में से एक समाधान के साथ बीज को कवर । बीज 20 मिनट के लिए भिगो दें ।
      नोट: बीज सेम बीज के रूप में बड़े हैं, तो यह पूरी तरह से बीज की सतह पर कवक को मारने के लिए भिगोने समय को लंबा करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।
    4. बंद ब्लीच मिश्रण डालो और बीज धो बाँझ पानी के साथ 3 बार । बीज प्रत्येक धोने के लिए 1 मिनट के लिए पानी में भिगो दें ।
    5. axenic अंकुर को प्राप्त करने के लिए बीज के आकार के आधार पर 5 और 25 मिलीलीटर के बीच बाँझ पानी की एक छोटी राशि जोड़ें । बीज अंकुरण के लिए एक बाँझ पेट्री पकवान में बीज और पानी डालो ।
      नोट: पानी पकवान के नीचे कवर लेकिन बीज को कवर नहीं करने के लिए रूट बाल के गठन को प्रोत्साहित करना चाहिए । Axenic एक ऐसी संस्कृति का वर्णन करता है जिसमें जीव की केवल एक ही प्रजाति विद्यमान है ।
    6. अंधेरे में गर्मी जब तक अंकुर 1 सेमी और 10 सेमी के बीच वांछित आकार तक पहुंचने (टमाटर और थालियाना के लिए के बारे में 5 दिन और अल्फला के लिए 1 से 3 दिन) । बड़े बीज के लिए इस तरह के एक गिलास पंनी के साथ कवर पकवान के रूप में अधिक से अधिक १०० मिलीलीटर की क्षमता के साथ एक कवर बाँझ कंटेनर का उपयोग करें ।
  2. सूक्ष्म जीवाणुओं के साथ एक विशेष बीज के संदूषण की बारंबारता का निर्धारण करें, जो सतह-नसबंदी के बाद बीजों पर या उसके भीतर व्यवहार्य हो ।
    नोट: यह आवश्यक है क्योंकि सामयिक बीज बीज कोट जो सतह-नसबंदी के द्वारा मारे नहीं जा सकता है के तहत सूक्ष्मजीवों ले । एक बीज बहुत में दूषित बीज की आवृत्ति का प्रयोग करें निर्धारित करने के लिए कितने बीज एक समय में बीज के समूह के एक उच्च जोखिम के बिना एक जीवाणु या कवक जो उपचार बच के साथ एक बीज के कारण दूषित हो रहा है ।
    1. 1.1.3 के माध्यम से 1.1.1 कदम बाहर ले ।
    2. बीज को एक पोषक आगर पेट्री डिश पर लगाएं । प्रत्येक पकवान उंहें बाहर रिक्ति में लगभग 10-30 बीज रखो कि वे व्यक्तिगत रूप से रन बनाए जा सकते हैं । टेप या सील फिल्म के साथ बर्तन सील ।
    3. 25 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 दिनों के लिए मशीन बीज से सूक्ष्मजीवों के दृश्य वृद्धि के लिए प्रत्येक दिन स्कोरिंग ।
  3. रेत में उगाए गए अंकुर तैयार करें । अंकुर जीवाणु आसंजन प्रयोगों में उपयोग के लिए रेत में उगाया जा सकता है ।
    1. 1.1.3 के माध्यम से 1.1.1 कदम बाहर ले ।
    2. आटोक्लेव में क्वार्ट्ज या समुद्री रेत निष्फल । इन दोनों के कुछ कार्बनिक पदार्थ होते हैं । यदि इस प्रयोग को प्रभावित करेगा, तो उसे दो बार ०.१ मीटर एचसीएल की मात्रा के साथ कवर करके रेत धो लें. 10 मिनट के लिए मिश्रण । रेत को व्यवस्थित करने और बंद तरल डालने की अनुमति दें । पानी के साथ रेत कुल्ला 3 बार, और एक बार के साथ ८०% दो अतिरिक्त पानी के बाद इथेनॉल ०.१ एम एचसीएल के लिए के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करके । आटोक्लेव में धोया रेत निष्फल ।
    3. उंहें 5 मिनट के लिए ५०% ब्लीच में विलय और उंहें डुबकी द्वारा बाँझ पानी के साथ 5 बार कुल्ला द्वारा कंटेनरों निष्फल । उंहें सूखी और सील फिल्म के साथ नीचे की अनुमति दें । निर्माता से प्राप्त फिल्म के रूप में आम तौर पर अंदर की ओर है जो कंटेनर के अंदर का सामना करना पड़ रखा जाना चाहिए पर सूक्ष्मजीवों से मुक्त है ।
    4. पर्याप्त बाँझ पानी के साथ बाँझ रेत मिश्रण यह काफी गीला है कि रेत एक साथ चिपक जाती है । यह राशि इस पर निर्भर करेगी कि रेत कितनी सूखी है । आमतौर पर रेत की मात्रा का 10-35% पर्याप्त है । कंटेनर में गीला रेत प्लेस की जरूरत जड़ों की लंबाई और गोली मार के विकास के लिए रेत के ऊपर पर्याप्त स्थान के लिए पर्याप्त गहराई की अनुमति । सटीक दूरी प्रजातियों और संयंत्र की विविधता पर निर्भर करता है इस्तेमाल किया जा रहा है ।
    5. पौध बीज ।
      1. एक बाँझ कांच रॉड के साथ रेत में एक उथले छेद बनाओ बस गहरी करने के लिए पर्याप्त रेत की सतह के नीचे बीज जगह (लगभग 1-5 mm) । छेद में बीज रखें । यह रेत की एक पतली परत के साथ कवर । पानी और अतिरिक्त रोगाणुओं के प्रवेश की हानि को रोकने के लिए सील फिल्म के साथ कंटेनर के ऊपर सील ।
      2. प्रजातियों और पौधों की विविधता के लिए एक उचित तापमान और दिन की लंबाई पर एक प्रकाश या ग्रीनहाउस में के तहत प्रयोगशाला में पौधों को विकसित । टमाटर के लिए, अल्फला, या Arabidopsis थालियाना उपयोग कमरे के तापमान और 12 ज प्रकाश/
    6. रेत में एक छेद में संयंत्र अंकुर (व्यास में 1-2 मिमी और काफी गहरी है कि जड़ रेत के साथ कवर किया जाएगा) । एक बाँझ कांच की छड़ के साथ छेद बनाओ । एक बाँझ स्टेनलेस स्टील crochet हुक का उपयोग कर छेद में ध्यान से जड़ गाइड अगर जरूरत है और रेत के साथ छेद के पक्षों को भरने.
  4. वैकल्पिक रूप से, पौधों पर या axenically एमएस साल्ट जैसे लवण मिश्रण युक्त आगर में हो जाना । सीधे आगर में उगाई axenic पौधों की डालियों का उपयोग करें । आगर के साथ हो जड़ों से बचें के रूप में आगार दोनों संयंत्र की सतह और बैक्टीरिया से चिपक जाती है । यह संयंत्र की सतह के लिए बैक्टीरियल आसंजन के एक झूठी छाप में परिणाम हो सकता है ।

2. अन्य पौध सामग्री तैयार करना

  1. धोने संयंत्र सामग्री पानी के साथ ग्रीनहाउस में उगाया उपयोग करने से पहले स्वदेशी रोगाणुओं की संख्या को कम करने के लिए । पौधों पर बैक्टीरिया और कवक होगा । प्रोटोजोआ मिट्टी में, जड़ों पर, और संभवतः पत्तियों पर मौजूद होंगे । ब्लीच या इथेनॉल के साथ धुलाई संयंत्र की सतह को बदल देगा और अनुशंसित नहीं है ।
    1. पानी के बाद रोगाणुओं की महत्वपूर्ण संख्या धोने रहने के बाद, पतला तरल हाथ साबुन के साथ पौधों का इलाज या हाइड्रोजन पेरोक्साइड को पतला (०.०१%) हटाने या रोगाणुओं को मारने के लिए । यह आम तौर पर कम ब्लीच या इथेनॉल से संयंत्र के लिए हानिकारक है ।
  2. एक स्थानीय बाजार में खरीदा संयंत्र सामग्री के रूप में मुश्किल है, सामग्री है जो प्रकट नहीं होता है का चयन करने के लिए लंबे समय से भंडारण के अधीन किया गया है । सामग्री के कुछ हिस्सों से बचें जो भूरे या क्षतिग्रस्त दिखाई देते हैं ।
    1. यह पानी से धो और सामग्री है जो पहले इसे इस्तेमाल करने से पहले काट दिया गया है के सिरों पर ताजा कटौती करते हैं, जब तक बैक्टीरिया के साथ परीक्षण बैक्टीरिया की बातचीत (और eukaryotes) जो काट साइटों पर जमा होगा ब्याज की हैं । ब्लीच या इथेनॉल के साथ धोने के रूप में वे संयंत्र की सतह बदल जाएगा मत करो ।
  3. घाव साइटों का इलाज । घाव साइटों अक्सर संयंत्र सामग्री18के इंटीरियर के लिए बैक्टीरिया का उपयोग प्रदान करते हैं ।
    1. ब्लॉक या करने के लिए बैक्टीरियल लगाव को कम करने, और आंदोलन के माध्यम से, घाव या कटौती पिघला हुआ आयल में कट एज की सूई या एक छोटे ब्रश का उपयोग कर पिघला तेल के साथ साइट चित्रकला द्वारा सामग्री तैयार करने में बनाया साइटों । एक रंग या किसी भी तेजी से लागू करने के रूप में यह ऊतक नुकसान हो सकता है का उपयोग न करें ।
    2. सील तेल के साथ टमाटर जैसे फल पर स्टेम निशान । कुछ बैक्टीरिया तेल के तहत क्षेत्र में तैर जाएगा, लेकिन उनकी संख्या आम तौर पर छोटे हैं ।
    3. यदि घाव साइटों में बैक्टीरियल प्रवेश ब्याज की है, दूरी का अनुमान है कि बैक्टीरिया एक डाई के आंदोलन को देख कर पानी की धाराओं या प्रसार द्वारा किए गए कदम कर सकते है समाधान करने के लिए जोड़ा । मार्क एक ऐसी हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में उन में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग जीन शुरू करने और उंहें प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर का पता लगाने से gram बैक्टीरिया196.1.2 कदम में वर्णित है ।

3. बैक्टीरिया की तैयारी

  1. बैक्टीरिया बढ़ने । एक माध्यम का प्रयोग करें कि सबसे निकट शर्तों बैक्टीरिया की संभावना है तुरंत प्रयोगशाला के बाहर असली दुनिया में संयंत्र का सामना करने से पहले उजागर किया गया है । कार्बन और नाइट्रोजन स्रोतों के साथ ही आयनों की उपस्थिति, विशेष रूप से divalent cations (सीए, एमजी, Fe, Mn, और Zn) और फॉस्फेट, और माध्यम के पीएच महत्वपूर्ण हैं ।
    1. एक. tumefaciens और अन्य मिट्टी बैक्टीरिया20के लिए न्यूनतम एबी मध्यम या Luria शोरबा का उपयोग करें । ई. कोलाई, जो पेट में उत्पन्न हो सकता है के लिए, Luria शोरबा का उपयोग करें ।
    2. जैसे रूट exudates या वाणिज्यिक संयंत्र के अर्क जैसे soytone या शर्करा जैसे सुक्रोज या xylose के माध्यम से मध्यम21में उत्प्रेरण जोड़ें । इन पदार्थों उत्प्रेरण के रूप में उपयोग किया जाता है, एक कम एकाग्रता जोड़ें, उदाहरण के लिए ०.०१%. यदि वे कार्बन स्रोतों का इस्तेमाल कर रहे हैं, एक उच्च एकाग्रता जोड़ें, उदाहरण के लिए ०.१% ।
  2. बैक्टीरियल इनोक्युलम तैयार करें । बाँझ पानी में या मध्यम में जो मशीन बाहर किया जाएगा और उंहें संयंत्र सामग्री को जोड़ने में बैक्टीरिया पतला । उपयुक्त कमजोर पड़ने चरणों में चर्चा की है ४.२ और ४.३ ।
    1. बैक्टीरिया का उपयोग करने से पहले विकास मीडिया को दूर करने के लिए, 2 मिनट के लिए १०,००० x g पर बैक्टीरियल निलंबन केंद्रापसारक, बंद supernatant डालना और उंहें एक ही माध्यम है जो संयंत्र सामग्री के साथ मशीन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा में भंवर द्वारा बैक्टीरिया reसस्पेंड । इस विधि को हटाने या संख्या या extracellular सामग्री और उपांग जैसे exopolysaccharides, कैप्सूल, flagellae, और/या पिली की मात्रा कम हो सकती है । यदि यह महत्वपूर्ण है कि इन सतह संरचनाओं बरकरार रहते हैं, तो बस उंहें inoculating से पहले बैक्टीरिया पतला या वैकल्पिक चरण 3.2.2 में वर्णित विधि का उपयोग करें ।
    2. विकास माध्यम को दूर करने के लिए एक वैकल्पिक विधि के रूप में, ०.२ µm या उससे कम की एक ताकना आकार के साथ एक nitrocellulose या पाली कार्बोनेट फिल्टर पर बैक्टीरिया इकट्ठा । मशीन माध्यम के साथ बैक्टीरिया धो और मध्यम के एक बाँझ कंटेनर में कोमल मिलाते हुए या फिल्टर के भंवर से उन्हें reसस्पेंड.

4. जीवाणुओं की टीका

  1. जीवाणुओं की संख्या का निर्धारण करने के लिए माप के संदर्भ के साथ inoculated बैक्टीरिया आसंजन और मशीन समय की लंबाई का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए ।
  2. सूक्ष्म समय से कम 1 दिन inoculate गर्मी बैक्टीरिया की अपेक्षाकृत बड़ी संख्या शामिल अध्ययन के लिए । प्रति मिलीलीटर 10 से अधिक6 बैक्टीरिया की एक अंतिम बैक्टीरियल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए संस्कृति की एक राशि जोड़ें । अब गर्मी के समय के लिए बैक्टीरियल इनोक्युलम आकार में कमी ।
  3. अध्ययन के लिए जिसमें बैक्टीरियल आसंजन व्यवहार्य कोशिका गिनती द्वारा मापा जाएगा, संस्कृति की एक राशि के लिए 103 से 106 बैक्टीरिया प्रति मिलीलीटर की एक अंतिम बैक्टीरियल एकाग्रता तक पहुंचने के लिए जोड़ें ।
  4. इतने सारे बैक्टीरिया है कि उनके चयापचय में परिवर्तन पीएच या ऑक्सीजन एकाग्रता की मशीन माध्यम में जोड़ने से बचें । पीएच कागज या एक इलेक्ट्रोड का उपयोग कर पीएच उपाय. एक ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड का उपयोग ऑक्सीजन एकाग्रता उपाय.
  5. रेत में उगाए गए पौधों के लिए, inoculate तीन संभव तरीकों से ।
    1. Inoculate के लिए बीज को 1 मिनट के लिए एक सस्पेंशन में लगभग 106 बैक्टीरिया प्रति मिलीलीटर के पानी में भिगोकर बोने से पहले जीवाणु के साथ बीज को सुखा लें ।
    2. खंड 1 में वर्णित के रूप में axenic अंकुरों अंकुरण द्वारा जड़ Inoculate और जब अंकुर जड़ के बारे में 1 सेमी लंबे समय तक यह सूई या 1 मिनट के लिए पानी में प्रति मिलीलीटर 106 बैक्टीरिया के निलंबन में पूरे अंकुर रखने है ।
    3. रोपण से पहले के बारे में 103 बैक्टीरिया प्रति मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए या बोने के बाद प्रति एमएल 106 बैक्टीरिया के निलंबन के साथ अंकुर जल से रेत के साथ बैक्टीरिया को मिश्रण से Inoculate रेत ।

5. संयंत्र सामग्री के साथ बैक्टीरिया की मशीन

  1. तरल मीडिया में मशीन के लिए, बाँझ पानी या सुक्रोज और खनिज लवण या संयंत्र ऊतक संस्कृति मध्यम (जैसे एमएस साल्ट के 1:10 कमजोर पड़ने के रूप में)22,23में संयंत्र सामग्री के साथ बैक्टीरिया मशीन ।
    1. एक कंटेनर जो करने के लिए बैक्टीरिया का पालन नहीं करते का उपयोग करें । संयंत्र की सतह लगातार या तो डुबकी या कोमल आंदोलन द्वारा कवर रखने की कोशिश करो । जोरदार आंदोलन आसंजन को रोकने या भी संयंत्र की सतह से बैक्टीरिया को दूर कर सकते हैं ।
    2. समय अंतराल अलग करने के लिए जब मशीन बंद करो और माप बनाने के लिए निर्धारित करने के बाद प्रकाश माइक्रोस्कोप में संयंत्र सामग्री का निरीक्षण करें । आसंजन का एक समय पाठ्यक्रम अक्सर हर 1 से 4 घंटे के लिए लिया नमूनों के साथ मूल्यवान है या बातचीत की गति के आधार पर हर दिन ।
  2. रेत में मशीन, एक ही विचार लागू तरल माध्यम में ५.१ कदम में मशीन के लिए वर्णित है ।

6. सूक्ष्मता का उपयोग आसंजन की माप

  1. सतहों पर बैक्टीरिया के आसान देखने के लिए Nomarski या चरण के विपरीत प्रकाशिकी के साथ सूक्ष्म माप बनाओ । हालांकि, 20X या उच्चतर के आवर्धन के साथ किसी भी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. अगर बैक्टीरिया बेतरतीब ढंग से वितरित या विशिष्ट साइटों में स्थित है यह निर्धारित करने के लिए सूक्ष्म अवलोकन का प्रयोग करें । यह भी जांचें कि क्या वे अकेले या समूहों में बंधे हैं । बैक्टीरियल विकास का सुझाव microcolonies की उपस्थिति के लिए देखो या आसंजन के बाद फंसाने । जांच करें कि क्या बैक्टीरिया सतह पर एक फिल्म बनाने के लिए लग रहे हो ।
      नोट: एक फिल्म बैक्टीरिया की एक बड़ी संख्या में सतह से बंधे और एक extracellular मैट्रिक्स23,24,25से घिरा हुआ है । संरचना चिकनी और वर्दी हो सकता है या एक और अधिक जटिल वास्तुकला है । संयंत्र सतहों से जुड़े अध्ययन के लिए तरीके17बताया गया है ।
    2. प्रयोग एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ टैग बैक्टीरिया । यदि अंय बैक्टीरिया मौजूद है और ब्याज की बैक्टीरिया ऐसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में एक फ्लोरोसेंट टैग द्वारा की पहचान कर रहे हैं, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए अंय बैक्टीरिया26के समूहों में टैग बैक्टीरिया की उपस्थिति निर्धारित करते हैं । GFP के लिए, ४९० एनएम उत्तेजना और ५२० एनएम उत्सर्जन के साथ एक फिल्टर का उपयोग करें ।
      1. जांच करें कि फ्लोरोसेंट टैग जंगली प्रकार के बैक्टीरिया और एक ही दोनों Nomarski और प्रतिदीप्ति प्रकाशिकी का उपयोग कर तनाव के बैक्टीरिया टैग के एक समान मिश्रण की axenic सामग्री के पालन को देख कर प्रतिकूल बैक्टीरिया को प्रभावित नहीं है । यदि फ्लोरोसेंट और अंधेरे बैक्टीरिया बेतरतीब ढंग से मिश्रित कर रहे है और बराबर की संख्या में मौजूद तो टैग परख के साथ हस्तक्षेप नहीं किया ।
  2. संलग्न बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें ।
    नोट: यह माइक्रोस्कोप में संलग्न बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करने के लिए बहुत मुश्किल है. जब बाइंडिंग अनियमित संयंत्र सतहों के लिए है, यह आम तौर पर एक मात्रात्मक माप प्राप्त करने के लिए संभव नहीं है । स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (इस लेख में चर्चा नहीं) इस तरह के माप बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    1. जब बैक्टीरिया एक जड़ बालों के रूप में एक चिकनी सतह के लिए बाध्य कर रहे हैं, mm रूट बालों की लंबाई प्रति जड़ बाल के किनारे करने के लिए बाध्य बैक्टीरिया की संख्या गिनती । माप की तुलना में मोटे तौर पर एक ही आकार और आकार के रूट बालों का उपयोग करने के लिए ध्यान रखना ।
    2. माइक्रोस्कोप में वस्तुओं के आकार का निर्धारण करने के लिए, उस पर मापा चिह्नों के साथ एक वाणिज्यिक स्लाइड का उपयोग करें । निरीक्षण और तस्वीर प्रयोगात्मक सामग्री के लिए इस्तेमाल के रूप में एक ही सेटिंग में इस स्लाइड और photomicrographs में वस्तुओं के आकार का निर्धारण करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप छवियों का उपयोग करें ।
  3. माइक्रोस्कोप के लिए नमूना तैयार करें ।
    1. नमूना धो लें । एक खुर्दबीन स्लाइड पर पानी या मशीन माध्यम की एक बूंद के लिए नमूना ले जाएँ और यह सीधे निरीक्षण.
      नोट: यह लाभ है कि अगर कोई जीवाणु विकास या वास्तविक बैक्टीरियल मौत वहां कई मुफ्त बैक्टीरिया होने की संभावना नहीं है । एक चेतावनी के संकेत के रूप में मुक्त जीवाणुओं के अभाव ले कि वहां गया है बैक्टीरियल मौत या कंटेनर जिसमें मशीन बाहर किया गया था के लिए बाध्यकारी बैक्टीरियल हो सकता है । नमूना धोने का प्रभाव चित्रा 1में दिखाया गया है ।
    2. नमूना धीरे से पानी या गर्मी के माध्यम में तरल की एक शीशी में रखकर और धीरे शीशी औंधा से धो लें । फिर अवलोकन के लिए ताजा तरल में माइक्रोस्कोप स्लाइड पर नमूना जगह है ।
    3. एक साधारण कवर स्लिप और माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग तरल में नमूना माउंट.
      1. यदि नमूना और मोटी है तो कवर पर्ची के तहत एक उभार करना होगा, एक प्रेस का उपयोग करें कवर स्लिप लागू होते हैं । इन कवर स्लिप में कवर स्लिप के किनारे के आसपास रबर या प्लास्टिक की एक अंगूठी होती है । कवर स्लिप में अच्छी तरह से तरल और नमूना रखें और फिर स्लाइड को ऊपर की ओर रखें और स्लाइड पर कवर स्लिप सील करने के लिए धीरे से नीचे दबाएं । पलटना और जांच ।
      2. वैकल्पिक रूप से एक समान तरीके से एक शैवाल गिनती स्लाइड और कवर पर्ची का उपयोग करें । ध्यान दें कि इस गहराई के साथ स्लाइड आम तौर पर 20X आवर्धन से अधिक की एक उद्देश्य लेंस के साथ जांच नहीं की जा सकती ।

Figure 1
चित्रा 1 : बंधे बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करने के लिए एक नमूना की तैयारी में कदम । a. tumefaciens टमाटर जड़ बालों के लिए बाध्यकारी (ए, बी, और सी) और नायलॉन धागे (डी, ई, और एफ) । दोनों बंधे बैक्टीरिया (काले तीर) और मुक्त बैक्टीरिया (सफेद तीर) को धोने के बिना पानी में घुड़सवार नमूनों में देखा जा सकता है (ए और डी). बंधे बैक्टीरिया को धोने के बाद रहते हैं लेकिन नि: शुल्क बैक्टीरिया अब मौजूद नहीं हैं (बी और ई). sonication के बाद बंधे बैक्टीरिया नमूना सतह से हटा दिया गया है (सी और एफ) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

  1. अगर फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया का इस्तेमाल किया गया तो माइक्रोस्कोप से रेत निकाले जाने के बाद उसके नमूने की जांच करें । रेत में उगाई पौधों की जड़ें रेत कणों जीवाणुओं के अवलोकन के साथ हस्तक्षेप के रूप में माइक्रोस्कोपी के लिए आम तौर पर उपयुक्त नहीं हैं ।
    1. चरण 7 के अनुसार एक वृद्धि कंटेनर से संयंत्र निकालें । पानी की एक कंटेनर में जड़ों प्लेस और धीरे से रेत जो कंटेनर के नीचे करने के लिए व्यवस्थित होगा हटाने के मिश्रण ।
    2. धोने के पानी से संयंत्र निकालें और चरण 6.3.3 में के रूप में नमूना माउंट ।

7. व्यवहार्य कोशिका गिनती का उपयोग आसंजन की माप

  1. एक sonicator का उपयोग कर व्यवहार्य संलग्न बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें ।
    1. असीम जीवाणुओं को दूर. नमूना पर्याप्त पानी के साथ एक शीशी में रखें, बफर या मशीन माध्यम धोने के लिए संयंत्र सामग्री को कवर और शीशी पलटना कई बार ।
      1. अगर वहां प्रारंभिक मशीन में मौजूद प्रति मिलीलीटर 10 से अधिक3 मुक्त बैक्टीरिया थे, उन सभी को दूर करने के लिए अनुक्रमिक धोने प्रदर्शन करते हैं । एक हल्के माइक्रोस्कोप में जांच करें (चरण ६.३ देखें) मुक्त बैक्टीरिया की उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए.
      2. धो जब तक वहां मुक्त बैक्टीरिया की संख्या में पर्याप्त कमी है, लेकिन याद है कि वहां बंधे और असीम जीवाणुओं के बीच एक संतुलन तो मुक्त बैक्टीरिया की संख्या शूंय को कभी नहीं घट सकती है ।
    2. एक संदंश या रंग के साथ धोने तरल की शीशी से नमूना निकालें ।
    3. तरल में पौधों की गर्मी में बाध्य बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें ।
      1. एक शीशी में धोया नमूना निलंबित और पानी की एक मापा मात्रा के साथ कवर, गर्मी मध्यम, या धोने बफर । नमूना कवर करने के लिए पर्याप्त तरल का उपयोग करें । एक स्नान sonicator में शीशी प्लेस और यह एक मिनट के लिए sonicate ।
      2. नमूना निकालें और यह प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत की जांच करने के लिए निर्धारित करें कि क्या बाध्य बैक्टीरिया संयंत्र से हटा दिया गया है । sonication द्वारा एक नमूना से बैक्टीरिया को हटाने चित्रा 1में दिखाया गया है । अगर वहां अभी भी कर रहे है बंधे बैक्टीरिया वर्तमान जारी रखें नमूना sonicating जब तक ऐसे समय है कि कोई बाध्य जीवाणु नमूना सतह पर रहते हैं । यदि बाउंड बैक्टीरिया sonication द्वारा हटाया नहीं जा सकता है, जोड़ें 1-10 मिलीग्राम/एमएल बाँझ क्वार्ट्ज रेत और sonication और सूक्ष्म परीक्षा दोहराने ।
      3. निर्धारित करें कि sonication प्रक्रिया जो चरण 7.1.3.2 में सबसे प्रभावी प्रतीत होता है बैक्टीरिया की व्यवहार्यता को हल करने में एक तरल संस्कृति से बैक्टीरिया को निलंबित करने के लिए sonication के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए कम नहीं है (क्वार्ट्ज रेत जोड़ें, यदि यह आवश्यक था) । व्यवहार्य सेल गिनती निर्धारित करें । बैक्टीरिया Sonicate और व्यवहार्य सेल गिनती फिर से निर्धारित करते हैं ।
        नोट: व्यवहार्य सेल गिनती में कमी है, तो उपचार व्यवहार्य सेल गिनती पर कोई प्रभाव नहीं है जब तक तरल और/या sonication समय की संरचना को बदलने के द्वारा प्रक्रिया को संशोधित ।
      4. निर्धारित करते है कि कमजोर पड़ने बफर व्यवहार्य कोशिका गिनती के लिए इस्तेमाल किया बैक्टीरिया की व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं करता है जो व्यवहार्य कोशिका गिनती अलग कमजोर पड़ने बफ़र्स और/या पानी का उपयोग कर बनाया की तुलना द्वारा प्रयुक्त शर्तों के तहत किया गया है ।
  2. homogenization का उपयोग कर व्यवहार्य संलग्न बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करें ।
    1. एक बाँझ मोर्टार या ब्लेंडर या अन्य homogenization डिवाइस में नमूना रखें । यह बाँझ पानी की एक मापा मात्रा के साथ कवर, गर्मी मध्यम, या वाशिंग बफर27. नमूना कवर करने के लिए पर्याप्त वॉल्यूम का उपयोग करें । एक ब्लेंडर के लिए १०० मिलीलीटर का उपयोग करें ।
    2. यह अच्छी तरह से homogenized है जब तक नमूना पीस । homogenization के बाद पीएच की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें कि एसिड संयंत्र ऊतक से जारी 7 नीचे पीएच में एक तेज गिरावट का कारण नहीं है । यदि पीएच का उपयोग कर गिरा दिया है एक बफर जैसे फॉस्फेट बफर में homogenization तरल पीएच बनाए रखने के लिए ।
    3. व्यवहार्य सेल गिनती निर्धारित करें ।
  3. एंटीबायोटिक प्रतिरोध के साथ चिह्नित बैक्टीरिया का प्रयोग करें ।
    1. स्थितियों में जिसमें एक से अधिक प्रकार के जीवाणु मौजूद है, जीवाणु उपभेदों एंटीबायोटिक दवाओं (आमतौर पर रिफैंपिसिन और nalidixic एसिड) के लिए सहज प्रतिरोध का उपयोग कर ।
      1. एंटीबायोटिक का स्तर निर्धारित करने के लिए उपयोग करें । यदि अंय जीवों की संस्कृतियों की उंमीद के लिए मशीन में मौजूद हो, थाली इन संस्कृतियों के पौधों के साथ इरादा मशीन की शर्तों के तहत हो रहे है उपलब्ध है चुना एंटीबायोटिक की सांद्रता की एक सीमा से युक्त प्लेटों । सबसे कम एकाग्रता है जो इन जीवों में से किसी के विकास की अनुमति नहीं है निर्धारित करते हैं । यह एंटीबायोटिक की सबसे कम एकाग्रता है जो परीक्षण जीवाणुओं के लिए प्रतिरोधी की आवश्यकता होगी ।
      2. सहज एंटीबायोटिक प्रतिरोधी म्यूटेंट प्राप्त करें । अमीर माध्यम में देर से लॉग इन या स्थिर चरण के लिए बैक्टीरिया की संस्कृति हो जाना । प्लेट ०.१ मिलीलीटर एक उपयुक्त एकाग्रता पर वांछित एंटीबायोटिक युक्त एक थाली पर पतला । कदम 7.3.1.1 में वर्णित के रूप में उपयोग करने के लिए सांद्रता निर्धारित करें । रखें और बैक्टीरिया जो बढ़ने और इस प्रकार एंटीबायोटिक के लिए प्रतिरोधी रहे है शुद्ध ।
      3. निर्धारित करें कि एंटीबायोटिक प्रतिरोध के जनक और एंटीबायोटिक प्रतिरोधी उपभेदों के तरल माध्यम में वृद्धि वक्र कर बैक्टीरिया के विकास को कम नहीं करता है । निर्धारित करें कि एंटीबायोटिक प्रतिरोधी बैक्टीरिया जनक तनाव के रूप में axenic संयंत्र सामग्री के औपनिवेशीकरण का एक ही स्तर दिखा, अगर यह संभव है ।
  4. व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या रेत में उगाया पौधों को बाध्य निर्धारित करते हैं ।
    1. कंटेनर और रेत से पौधे निकाले । कंटेनरों से पौधों को हटाने के लिए, सबसे पहले कंटेनर के ऊपर और नीचे सीलिंग सामग्री निकालें । बाँझ कागज का एक टुकड़ा पर कंटेनर प्लेस और धीरे से एक बड़ी पतला सिलेंडर के रूप में धीरे एक सतह के खिलाफ कंटेनर दस्तक द्वारा पूरे रेत या मिट्टी और संयंत्र को हटाने के लिए सामग्री ढीला ।
      1. यदि आवश्यक हो, एक रंग या रॉड का उपयोग करने के लिए कंटेनर के नीचे के माध्यम से अंदर जा किनारों के आसपास सामग्री ढीला ।
    2. जब रेत के सिलेंडर या संयंत्र युक्त मिट्टी कागज पर नि: शुल्क है, यह नीचे विभाजित करने के लिए संयंत्र जड़ प्रकट मध्य । यदि वांछित हो तो कंटेनर के किनारे के पास से रेत के नमूने लेने के साथ ही जड़ के पास ले जाएं । यह जीवाणुओं के प्रसार (और संचय और वृद्धि) का निर्धारण करने के लिए उपयोगी हो सकता है ।
    3. जड़ की लंबाई को मापने । जड़ उठाओ और रेत और जड़ को ढीला का पालन बैक्टीरिया को हटाने (rhizosphere सामग्री) पानी या बफर की एक मापा मात्रा में जड़ सूई और धीरे से यह मिलाते हुए । Luria आगर जैसे एक उपयुक्त माध्यम पर चढ़ाना द्वारा परिणामी निलंबन में बैक्टीरिया की व्यवहार्य कोशिका गिनती निर्धारित करें । यह ढीला जड़ के साथ जुड़े बैक्टीरिया की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है ।
  5. sonication द्वारा कसकर बाध्य बैक्टीरिया को दूर करने और चरण ७.१ में वर्णित के रूप में उनकी संख्या निर्धारित करें ।
  6. वैकल्पिक रूप से, कसकर बंधे बैक्टीरिया की जड़ पर स्थान निर्धारित करने के लिए एक पेट्री पकवान युक्त पोषक आगर या अन्य उपयुक्त माध्यम की सतह पर धोया जड़ जगह. अगले 3 दिनों में इस रूट पर बैक्टीरियल कॉलोनियों के स्थान का निरीक्षण करने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप या आवर्धक कांच का उपयोग कर ।
  7. प्रति पौधा बैक्टीरिया की संख्या के रूप में एक्सप्रेस परिणाम, प्रति cm2 सतह क्षेत्र, प्रति सेमी जड़ लंबाई, या ग्राम के प्रति नए ऊतक के वजन । एक ही दिन में कई प्रतिकृतियां और भी करते है अलग अलग जीवाणु संस्कृतियों और संयंत्र सामग्री के विभिंन बहुत का उपयोग कर दिन पर प्रतिकृतियां ।

8. निर्धारित करना कि आसंजन पर गर्मी की स्थिति का एक प्रभाव बैक्टीरिया या संयंत्र की प्रतिक्रिया की वजह से है

  1. मृत या मारे गए संयंत्र सामग्री का उपयोग करें ।
    1. इस तरह के क्रम में इसे मारने के लिए गर्मी के रूप में रसायनों, fixatives, या अन्य उपचार की एक किस्म के लिए संयंत्र सामग्री विषय । इन उपचार के किसी भी प्रयोग के बाद पानी और गर्मी के माध्यम में संयंत्र सामग्री अच्छी तरह से धो लें । इसके बाद बैक्टीरिया को inoculate । इससे पौधे की सतह नष्ट नहीं होगी बल्कि यह चयापचय को निष्क्रिय कर देगा जिससे यह बैक्टीरिया का जवाब नहीं दे सकता ।
    2. बैक्टीरियल आसंजन उपाय के रूप में 6 चरणों में वर्णित है और/ इसके अलावा व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या में मशीन की शुरुआत में संयंत्र सामग्री के साथ और मशीन के अंत में मौजूद व्यवहार्य कोशिकाओं की संख्या को सुनिश्चित करने के लिए कि कोई विषाक्त रसायनों की मशीन के दौरान मौजूद थे की मशीन के लिए जोड़ा निर्धारित करते हैं ।
  2. निर्जीव सामग्री का उपयोग करें ।
    1. का प्रयोग करें यदि एक प्रभाव संयंत्र सामग्री के लिए बैक्टीरियल पालन पर देखा संयंत्र या बैक्टीरिया पर एक प्रभाव के कारण निर्धारित करने के लिए निर्जीव सामग्री के लिए बैक्टीरियल पालन । एक निर्जीव सामग्री है जो करने के लिए बैक्टीरिया बांध और जो आकार और संयंत्र सामग्री के आकार में समान है का चयन का अध्ययन किया । संभावनाओं सभी प्रकार के फिल्टर कागज (फाइबर, nitrocellulose, ग्लास फाइबर, पाली कार्बोनेट, आदि), धागे (नायलॉन, कपास, पॉलिएस्टर, ग्लास ऊन, आदि), कांच या प्लास्टिक coverslips, स्टेनलेस स्टील कूपन, और डायलिसिस शामिल झिल्ली.
    2. निर्जीव सामग्री को अच्छी तरह से धोकर पानी में डालें और जिस माध्यम से मशीन को बाहर किया जाएगा उसका उपयोग करने से पहले उसे निष्फल कर दें । चरण 8.2.1 में सूचीबद्ध सामग्रियों में से अधिकांश autoclaving द्वारा नसबंदी के लिए स्थिर हैं ।
    3. चरण 6 और 7 में वर्णित के रूप में वांछित शर्तों और स्कोर के तहत निर्जीव सामग्री की मशीन । नायलॉन धागे के उपयोग का एक उदाहरण निर्धारित करने के लिए कि एक. tumefaciens के कम बाध्यकारी उच्च कैल्शियम सांद्रता पर बालों की जड़ करने के लिए कारण है (कम से भाग में) बैक्टीरिया पर कैल्शियम का एक प्रभाव के लिए चित्र 428में दिखाया गया है ।

Representative Results

A. tumefaciens उपनिवेश करता रूट सतहों । आदेश में निर्धारित करने के लिए कि जीवाणु उत्पादन फाइबर की जड़ औपनिवेशीकरण में एक भूमिका निभाता है, जीवाणु उत्परिवर्तन जो फाइबर संश्लेषण को रोकने के प्रभाव16की जांच की गई । १.३ और ७.१ चरणों में वर्णित तकनीकों का उपयोग किया गया । टमाटर के बीज सतह निष्फल और बाँझ पानी में अंकुरित थे । जब जड़ों लगभग 2 सेमी लंबे थे वे प्रति मिलीलीटर 105 बैक्टीरिया के निलंबन में डूबा हुआ है और कंटेनरों में pasteurized मिट्टी में लगाया गया । पौधों को 14 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर एक 12 ज लाइट/ इसके बाद संकेत बार कंटेनरों से पौधे निकाले गए. जड़ें धो रहे थे और एक स्नान sonicator में sonicated को बाध्य बैक्टीरिया को दूर । बैक्टीरियल संख्या व्यवहार्य कोशिका गिनती का उपयोग कर निर्धारित किया गया । 2 चित्रा उपनिवेश टमाटर जड़ों के लिए बैक्टीरिया की क्षमता पर दो अलग फाइबर-शूंय से उत्परिवर्तनों के प्रभाव से पता चलता है । हालांकि कुछ माप के मानक विचलन के रूप में उच्च थे ०.९ लॉग10 (माप के इस प्रकार के साथ एक आम समस्या) फाइबर के बंधन में कमी-ऋण म्यूटेंट स्पष्ट रूप से स्पष्ट है और हम के जीवाणु उत्पादन समाप्त कर सकते हैं फाइबर टमाटर जड़ों के औपनिवेशीकरण में बैक्टीरिया एड्स ।

Figure 2
चित्रा 2 : जड़ जंगली प्रकार और फाइबर द्वारा औपनिवेशीकरण-ऋण म्यूटेंट के एक. tumefaciens लॉग10 प्रति मुख्यमंत्री बैक्टीरिया की कुल संख्या जड़ लंबाई से टमाटर की जड़ें inoculated से बरामद जंगली प्रकार A. tumefaciens तनाव C58 और फाइबर-शूंय से म्यूटेंट C58:1 और C58: A60 । दिखाए गए नंबरों में से एक ंयूनतम चार अलग प्रयोगों से मतलब है । सलाखों के मतलब के मानक विचलन संकेत मिलता है । जड़ें उंहें एक मिनट के लिए 10 मिलीलीटर प्रति5 बैक्टीरिया के निलंबन में सूई से inoculated थे । कंटेनरों में पौधे उगाए जाते थे और एक काँच की शीशी में वाशिंग बफर में जड़ों को धोने से गिरे हुए अनुयाई जीवाणु हट जाते थे. कसकर अनुयाई बैक्टीरिया एक स्नान sonicator का उपयोग कर हटा दिया गया था और परिणामी निलंबन के लिए व्यवहार्य सेल निर्धारित16मायने रखता है । यह आंकड़ा Matthysse और McMahan से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अल्फला स्प्राउट्स को ई. कोलाई और अन्य बैक्टीरिया के बंधन में exopolysaccharides की भूमिका की जांच की गई । ई. कोलाई O157 के कारण अतिसारीय रोग के कुछ प्रकोप: H7 दूषित अल्फला अंकुरित करने के लिए पता लगाया गया है । जंगली प्रकार के बैक्टीरिया और म्यूटेंट विभिन्न exopolysaccharides बनाने में असमर्थ के बंधन चरणों में वर्णित विधियों का उपयोग कर मापा गया १.१, ५.१ और ७.२. अल्फला अंकुरित सतह निष्फल और अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ पानी में एक दिन के लिए अंकुरित थे । संलग्न बीज कोट के साथ चार अंकुरित पानी की 5 मिलीलीटर युक्त बाँझ प्लास्टिक के बर्तन में रखा गया था । Luria शोरबा में उगाया बैक्टीरिया लगभग 5 x 10 मिलीलीटर प्रति3 की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया । inoculated अंकुर 3 दिनों के लिए अंधेरे में 25 डिग्री सेल्सियस पर मशीन थे । अंकुरित एक शीशी में जोरदार उलटा और homogenized धोने बफर में एक मोटर चालित Teflon ग्लास homogenizer का उपयोग करके 5 मिलीलीटर बाँझ पानी में दो बार धोया गया । पिछले एक प्लाज्मिड GFP जीन ले जाने के साथ चिह्नित बैक्टीरिया का उपयोग प्रयोगों कोई आंतरिक बैक्टीरिया दिखाया, हालांकि सतह बैक्टीरिया आसानी से मनाया गया । परिणाम तालिका 1में दिखाए जाते हैं । ई. कोलाई O157 के दो उपभेदों: H7 की जांच की गई । दोनों उपभेदों में पाली-β-1, 6-ग्लुकुरोनिक एसिड (पीजीए) के उत्पादन रोगजनक ई. कोलाई के लिए संयंत्र सतहों के बंधन में सबसे बड़ा योगदान करने के लिए दिखाई दिया । बृहदांत्र एसिड भी बाध्यकारी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई । जबकि फाइबर में बाध्यकारी में कमी-ऋण म्यूटेंट महत्वपूर्ण यह है कि अंय दो polysaccharides के लिए के रूप में के रूप में बड़ी नहीं थी ।

ई. कोलाई O157 के बंधन पर Exopolysaccharide उत्पादन जीन में उत्परिवर्तन के प्रभाव: H7 अंकुरित और खुले बीज कोट करने के लिए
बैक्टीरियल तनाव उत्परिवर्तन या जीनोटाइप (प्रासंगिक phenotype) अंकुरित या बीज कोट प्रति बंधे बैक्टीरिया की10 संख्या लॉग इन करें
अल्फला स्प्राउट्सबी खुले बीज कोट
86-24 कोई नहीं (जंगली प्रकार) ४.७ ± ०.६ ५.६ ± ०.२
8624N yhjN (फाइबर-शूंय) २.९ ± ०.७c ३.५ ± ०.६c
8624C wcaD (आंतों अम्ल-ऋण) १.८ ± ०.७c २.४ ± ०.५c
8624P pgaC (पीजीए-ऋण) < 1.0c १.० ± १.०c
DEC4A कोई नहीं (जंगली प्रकार) ५.६ ± ०.२ ६.१ ± ०.३
DEC4AN yhjN (फाइबर-शूंय) ४.८ ± ०.८डी ४.१ ± ०.८डी
DEC4AC wcaD (आंतों अम्ल-ऋण) ३.९ ± ०.५c ४.८ ± ०.८डी
DEC4AP pgaC (पीजीए-ऋण) < 1.0c १.२ ± ०.७c
3 दिनों के बाद बंधे बैक्टीरिया की संख्या (लॉग10) के एक ंयूनतम तीन माप का एक मानक विचलन मतलब है ।
माप से पहले बी अंकुर धुल गए ।
सी जंगली प्रकार से काफी अलग: P < 0.01 ।
घ काफी जंगली प्रकार से अलग: P < 0.05 ।
इस तालिका को Matthysse, देवड़ा, मिश्रा, और Torres10से संशोधित किया गया है ।

तालिका 1: exopolysaccharide उत्पादन जीन में उत्परिवर्तनों के बंधन पर प्रभाव ई. कोलाई O157: अंकुरित करने के लिए H7। आदेश में रोगजनक ई. कोलाई O157 के बंधन में विभिंन exopolysaccharides और lipopolysaccharide की भूमिका निर्धारित करने के लिए: अल्फला अंकुरित करने के लिए H7 उपभेदों, अंकुरित करने के लिए म्यूटेंट के एक सेट के बंधन और खुले बीज कोट तरीकों का उपयोग कर जांच की थी चरण 6 में वर्णित है । परिणामों से पता चला कि पाली-ß-1, 6-N-एसिटाइल-D-glucosamine (पीजीए) अंकुरित करने के लिए बाध्यकारी के लिए आवश्यक प्रतीत होता है और है कि दोनों फाइबर और colanic एसिड ई. कोलाई O157 के अधिकतम बंधन के लिए आवश्यक हैं । इस तालिका को Matthysse, देवड़ा, मिश्रा, और Torres10से संशोधित किया गया है ।

आदेश में यह निर्धारित करने के लिए अगर पीजीए के उत्पादन के लिए जीवाणु बाध्यकारी सतहों के कारण पर्याप्त है, एक प्लाज्मिड (pMM11) क्लोन ऑपरोन पीजीए उत्पादन के लिए आवश्यक जीन एंकोडिंग ले दो अलग बैक्टीरिया जो नहीं होगा में पेश किया गया था साधारणतः टमाटर की जड़ों को बाँध कर10. ए tumefaciens A1045 जंगली प्रकार तनाव C58 जो चक्रीय बनाने के लिए विफल रहता है-β-1, 2 glucan और भी संयंत्र के लिए बांध करने में विफल रहता है की एक उत्परिवर्ती है29सतहों । Sinorhizobium meliloti १०२१ जो अल्फला पर रूट पिंड रूपों गैर करने के लिए बाइंड करने के लिए विफल रहता है,12टमाटर सहित फलियां । चरणों में वर्णित तकनीकों १.१, ५.१, ६.३, और ७.१ के लिए यदि पीजीए बनाने की क्षमता आम तौर पर जड़ सतहों के लिए बाध्यकारी बैक्टीरिया को बढ़ा दिया गया था । टमाटर के बीज सतह निष्फल और बाँझ पानी में अंकुरित थे । जड़ें खंडों में काट रहे थे 1 लंबाई में सेमी और बाँझ पानी में रखा और बैक्टीरिया inoculated थे. के रूप में बैक्टीरिया की इन दो प्रजातियों के विभिंन दरों पर बढ़ने, बाध्यकारी अलग समय पर मापा गया था बैक्टीरियल विकास के मोटे तौर पर बराबर मात्रा के लिए अनुमति देते हैं । प्लाज्मिड pMM11 की उपस्थिति दोनों प्रजातियों (तालिका 2)10के बाउंड बैक्टीरिया की संख्या में एक समान महत्वपूर्ण वृद्धि हुई । बाध्यकारी में एक महत्वपूर्ण वृद्धि भी प्रकाश माइक्रोस्कोप में देखा गया था, लेकिन बाध्यकारी दो प्रजातियों (चित्रा 3) के लिए बहुत अलग था । A. tumefaciens A1045 रूट सतह के लिए व्यक्तिगत बैक्टीरिया के रूप में बंधे । एस meliloti बड़े क्लस्टर्स में बाउंड है जिसमें केवल कुछ बैक्टीरिया सीधे रूट से जुड़े थे और अधिकांश बैक्टीरिया अन्य बैक्टीरिया से जुड़े थे । इस उदाहरण से पता चलता है कि केवल सूक्ष्म टिप्पणियों सहित बिना बंधे बैक्टीरिया की संख्या का विश्लेषण एक प्रयोग के परिणामों की एक भ्रामक छाप दे सकता है । हालांकि दोनों तरीकों (व्यवहार्य कोशिका गिनती और सूक्ष्म टिप्पणियों) बताते है कि pMM11 टमाटर की जड़ों को बढ़ा बैक्टीरिया का बंधन, पीजीए के उत्पादन की वजह से बाध्यकारी के प्रकार दो जीवाणु प्रजातियों के लिए अलग था10

टमाटर की जड़ों को जीवाणुओं के बंधन पर प्लाज्मिड pMM11 का प्रभाव
बैक्टीरियल तनाव प्लाज्मिड प्रति mm रूट लंबाई बंधे बैक्टीरिया की संख्या
a. tumefaciens A1045a कोई ०.२५ x 103 ± ०.२५ x 103
pBBR1mcs (वेक्टर) ०.२५ x 103 ± ०.२५ x 103
pMM11 (पीजीए संश्लेषण) 10 x 103 ± ०.२५ x 103
बि. स. meliloti १०२१ कोई कोई नहीं पाया गया
pBBR1mcs (वेक्टर) कोई नहीं पाया गया
pMM11 (पीजीए संश्लेषण) ५० x 103 ± 5 x 103
एक जीवाणु बाध्यकारी 2 घंटे के बाद मापा गया था
बी बैक्टीरियल बाइंडिंग 18 घंटे के बाद उपाय था
इस तालिका को Matthysse, देवड़ा, मिश्रा, और Torres10से संशोधित किया गया है ।

तालिका 2: एक प्लाज्मिड के बंधन पर पीजीए के संश्लेषण के लिए जीन ले जाने के प्रभाव A. tumefaciens A1045 and S. meliloti १०२१ टमाटर रूट खंडों को। पाली-अ ß य-1 की क्षमता की जांच के क्रम में, 6-N-एसिटाइल-D-glucosamine (पीजीए) संयंत्र जड़ों के लिए बैक्टीरिया की बाध्यकारी को बढ़ावा देने के लिए, एक प्लाज्मिड के प्रभाव के लिए संयंत्र के दो उपभेदों के बंधन पर पीजीए (pMM11) बनाने की क्षमता से जुड़े बैक्टीरिया को टमाटर की जड़ों की जांच की गई । जीवाणुओं का न तो तनाव प्लाज्मिड के अभाव में या प्लाज्मिड की उपस्थिति में जीन के बिना की जड़ों के लिए महत्वपूर्ण बाध्यकारी पता चलता है (pBBR1mcs) । पीजीए संश्लेषण ले जाने प्लाज्मिड के अलावा बैक्टीरिया के दोनों प्रकार के द्वारा बाध्यकारी वृद्धि हुई जीन । क्योंकि a. tumefaciens तेजी से बढ़ता है एस meliloti बंधन के बाद 2 tumefaciens के लिए गर्मी और एस melilotiके लिए 18 के बाद एच मापा गया था । तकनीक का इस्तेमाल किया उन चरण 7 में वर्णित हैं । इस तालिका को Matthysse, देवड़ा, मिश्रा, और Torres10से संशोधित किया गया है ।

Figure 3
चित्रा 3 : प्लाज्मिड pMM11 के प्रभाव के लिए एक. tumefaciens A1045 और एस meliloti १०२१ के बंधन पर पीजीए के लिए टमाटर की जड़ बाल ले जीन । टमाटर की जड़ बालों के लिए बाध्यकारी a) a. tumefaciens A1045, B) a. tumefaciens A1045 pMM11, C) s. meliloti १०२१, and D) s. meliloti १०२१ pMM11. हालांकि दो जीवाणु प्रजातियों के बंधन में वृद्धि मोटे तौर पर समान प्रकाश माइक्रोस्कोप में देखा के रूप में बाध्यकारी का ब्यौरा काफी अलग हैं । तकनीक का इस्तेमाल किया उन चरण 6 में वर्णित हैं । Matthysse, देवड़ा, मिश्र, और Torres10से यह आंकड़ा संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

यह कभी-कभार गैर-जैविक सतहों के लिए बाध्यकारी का उपयोग करने के लिए बैक्टीरिया और संयंत्र के एक विशिष्ट संपर्क में योगदान के भेद में सहायता करने के लिए संभव है । ए. tumefaciens के एकध्रुवीय polysaccharide (UPP) को जैविक और गैर-जैविक सतहों दोनों की एक किस्म के जीवाणु बाध्यकारी मध्यस्थता करने में सक्षम होने के लिए दिखाया गया है30. कैल्शियम UPP28द्वारा मध्यस्थता सतहों संयंत्र के लिए एक. tumefaciens के बंधन को बाधित करने के लिए मनाया गया था । आदेश में यह निर्धारित करने के लिए कि जीवाणुओं के लिए बाध्यकारी बैक्टीरिया की कैल्शियम आयनों द्वारा निषेध जीवाणु पर या संयंत्र की सतह पर एक प्रभाव के कारण होता है, नायलॉन धागे को बैक्टीरिया के बंधन की जांच की गई । तकनीकों का वर्णन करता है चरण ८.२ में उपयोग किए गए । टमाटर के बीज सतह निष्फल और चरण 1 में वर्णित के रूप में पानी में अंकुरित थे । जीवाणु सुक्रोज के साथ ंयूनतम माध्यम में बड़े हो गए थे और टमाटर की जड़ों या नायलॉन धागे में जोड़ा लगभग 105/mL के रूप में चरण ५.१ में वर्णित की एक अंतिम एकाग्रता में । टमाटर जड़ों और नायलॉन धागे को बैक्टीरियल बाध्यकारी पर जोड़ा CaCl2 के प्रभाव माइक्रोस्कोप में जांच की थी । चित्रा 4 या तो सतह का उपयोग कैल्शियम द्वारा बाध्यकारी की एक समान निषेध से पता चलता है सुझाव है कि कैल्शियम का प्रभाव मुख्य रूप से10बैक्टीरिया पर है ।

Figure 4
चित्र 4 : टमाटर जड़ बाल और नायलॉन धागे के लिए ए tumefaciens के बंधन पर कैल्शियम का प्रभाव । ए tumefaciens टमाटर जड़ों (ए और बी) या नायलॉन धागे (सी और डी) के लिए 24 एच के लिए एमएस साल्ट के एक 1:10 कमजोर पड़ने में और अटल बिहारी ंयूनतम मध्यम के 1:20 कमजोर पड़ने के साथ मशीन था, ०.४% सुक्रोज (एक और सी) या एमएस साल्ट और अटल बिहारी मिनिमल मीडियम के 1:20 कमजोर पड़ने के 1:10 कमजोर पड़ने में , ०.४% सुक्रोज युक्त ६० मिमी CaCl2 (बी और डी)31. जोड़ा CaCl2 दोनों जड़ों और नायलॉन का सुझाव है कि निषेध मुख्य रूप से बैक्टीरिया पर प्रभाव के बजाय संयंत्र की सतह पर कारण था धागे के लिए बाध्यकारी बैक्टीरियल बाधित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

इस प्रयोग के दौरान बैक्टीरिया का पालन करने के लिए सभी सतहों के बारे में पता होना जरूरी है । इस प्रकार बैक्टीरिया जो कांच के बंधन में सक्षम है अगर व्यवहार्य कोशिका गिनती कांच ट्यूबों और पिपेट का उपयोग किया जाता है आंका जा सकता है । यदि आगर या मिट्टी में पौधे उगाए जाते हैं और आगर या मिट्टी के कुछ पौधे पौधों पर बने रहते हैं तो जीवाणु पौधों के बजाय पालन सामग्री को बाँध सकते हैं. दूसरी ओर, विशेष रूप से जड़ों के मामले में संयंत्र की सतह, धोने, ऐसे श्लेष्म के रूप में प्राकृतिक सतह कोटिंग्स हटा सकते है और इस तरह पालन परीक्षण के परिणामों को बदल ।

यह निश्चित है कि बैक्टीरिया की मशीन मिश्रण में जोड़ा जाना जरूरी है प्रयोग के दौरान जीवित रहते हैं । इस प्रकार व्यवहार्य सेल की गिनती के रूप में अच्छी तरह से मुक्त के रूप में संलग्न बैक्टीरिया नियमित रूप से किया जाना चाहिए । कुछ उपचार या जीवाणु उत्परिवर्तनों बैक्टीरियल विकास दर को कम करने या वास्तव में बैक्टीरियल आबादी का एक अंश की मौत का कारण हो सकता है । जीवित और मृत जीवाणु माइक्रोस्कोप में भेद नहीं किया जा सकता है जब तक विशेष दाग का उपयोग किया जाता है । जीवित जीवाणुओं से रंजक के अपवर्जन पर निर्भर करता है जो जीवित/मृत बैक्टीरिया के लिए एक उपयोगी दाग किट है । हालांकि, अगर बैक्टीरियल प्रजातियों की एक मिश्रित जनसंख्या मौजूद है तो व्यवहार्य सेल ब्याज की प्रजातियों की गिनती के लिए आसान तरीका है कि क्या मशीन जीवाणु मौत के परिणामस्वरूप है निर्धारित करने की संभावना है ।

मध्यम संरचना जीवाणु अस्तित्व और विकास को प्रभावित करेगा । जड़ रिसाव और घाव और कटौती साइटों से जारी सामग्री सब्सट्रेट मामूली जीवाणु विकास का समर्थन करने के लिए प्रदान करेगा । फॉस्फेट, नाइट्रोजन, और लोहे के लिए इन परिस्थितियों में सीमित हो जाते हैं । Divalent cations जैसे कैल्शियम और मैग्नीशियम आसंजन को प्रभावित कर सकते हैं । कुछ मामलों में कार्बन स्रोत आसंजन को प्रभावित कर सकते हैं । पीएच भी मायने रखता है । सामांय में rhizosphere के पीएच ५.५ और ६.५ के बीच है ।

यह एंटीबायोटिक प्रतिरोध के साथ चिह्नित बैक्टीरिया का उपयोग करने में सावधान रहना आवश्यक है । एंटीबायोटिक अक्सर इस्तेमाल किया रिफैंपिसिन और nalidixic एसिड कर रहे हैं । इन एंटीबायोटिक दवाओं के लिए प्रतिरोध आम तौर पर गुणसूत्र जीन में उत्परिवर्तनों के कारण है (आरएनए पोलीमरेज़ और कर्णक, क्रमशः) और इस तरह आसानी से एक और तनाव के लिए स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है मशीन के दौरान । इस प्रकार के प्रतिरोध के परिणामस्वरूप एंटीबायोटिक का क्षरण या संशोधन भी नहीं होता । एक प्लाज्मिड जनित जीन मार्कर के साथ बैक्टीरिया अंकन की सिफारिश की जब तक प्लाज्मिड किसी भी अंय जीवाणुओं को हस्तांतरित नहीं किया जा सकता है नहीं है । एंटीबायोटिक प्रतिरोध गिरावट या एंटीबायोटिक संवेदनशील बैक्टीरिया के रूप में एंटीबायोटिक के रासायनिक संशोधन के कारण नहीं होना चाहिए तो एंटीबायोटिक प्लेटों पर विकसित करने में सक्षम हो जाएगा अगर वे प्रतिरोधी बैक्टीरिया के करीब स्थित हैं ।

इस पत्र में वर्णित तरीके छोटे नमूना आकार और/या प्रयोग के लिए उपयोगी होते है जहां नमूनों को समाहित करने की आवश्यकता है (उदाहरण के लिए, प्रयोग मानव रोगजनकों को शामिल) । बड़े नमूना आकार के लिए (ऊपर सामग्री के १०० g या अधिक से अधिक ५० पौधों) अन्य विधियों या इन विधियों की कठोर संशोधन की आवश्यकता होगी10,19,३२,19,३३, ३४ , ३५ , ३६. अध्ययन की जा रही प्रजातियों के अलावा अन्य सूक्ष्मजीवों की बड़ी संख्या की उपस्थिति भी महत्वपूर्ण समस्या खड़ी कर सकती है. संभव समाधान एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या एंटीबायोटिक प्रतिरोध के रूप में कदम 6.1.2 और ७.३ में वर्णित के साथ चिह्नित बैक्टीरिया का उपयोग शामिल हैं । हालांकि, जब ब्याज के जीवाणु अंय सूक्ष्मजीवों की एक बड़ी आबादी में दुर्लभ व्यक्तियों रहे है इन मार्करों बैक्टीरिया की संख्या का एक अस्पष्ट आकलन की अनुमति के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है अध्ययन किया जा रहा है ।

यहां वर्णित सभी विधियां प्रयोगशाला आधारित पद्धतियां हैं । मामूली संशोधनों ग्रीनहाउस अध्ययन के लिए आवश्यक होगा । अधिक प्रमुख संशोधनों के लिए क्षेत्र के अध्ययन के लिए आवश्यक होने की संभावना है जहां प्रोटोजोआ, कीट और अंय पशु predation और जलवायु परिवर्तन प्रयोगों के लिए निर्धारित शर्तों के प्रावधान जटिल । भविष्य में इन तरीकों को संयंत्र की सतह पर दो या अधिक सूक्ष्मजीवों की बातचीत को शामिल करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखक की घोषणा की है कि वह कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखक धंयवाद आंकड़ों की तैयारी के लिए Susan व्हाइटफील्ड और केमिली मार्टिन और हिलेरी Samagaio प्रयोगों में से कुछ के साथ सहायता के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
light microscope any N/A phase contrast or Nomarski optics are helpful, for studies using fluorescent markers a fluorescence microscope is required.
seeds any  N/A make a note of the seed lot number and the cultivar
bleach any N/A
bath sonicator any scientific supply company N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
nutrient agar  Difco  001-01-8
soytone Difco  24360
Sand sea sand Fisher Scientific S25
sand  Sigma-Aldrich S9887
conetainers Stuewe & Sons, Inc. Ray-Leach cone-tainers many different sizes are available to suit the type of plant you wish to grow
parafilm any scientific supply company N/A
MS salts Sigma-Aldrich M5524
parrafin any N/A
centrigfuge any scientific company N/A to pellet most bacteri only a small centrifuge with a max force of 10,000 XG is needed
vortex mixer any scientific company
micrometer ACCU-SCOPE Accessories A3145
Sedgwick-rafter counting cell Hauser Scientific HS3800
probe-clip press-seal incubatin chamber Sigma-Aldrich Z359483
rifampicin Sigma-Aldrich R3501
naladixic acid Sigma-Aldrich n8878
Live/dead stain In Vitrogen Molecular Bioprobes L7007

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References

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जीवाणुओं का पालन संयंत्र के लिए प्रयोगशाला में मापा सतहों
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Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (136), e56599, doi:10.3791/56599 (2018).More

Matthysse, A. G. Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory. J. Vis. Exp. (136), e56599, doi:10.3791/56599 (2018).

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