Det här protokollet beskriver en plattform för att fabricera själv monterade vävnad ringar i varierande storlekar med hjälp av ett anpassat 3D-tryckt plast mögel. PDMS negativ botas i 3D-tryckta formen; sedan gjuts agaros i härdade PDMS negativ. Celler är seedade i resulterande agaros brunnar där de samlade i vävnad ringar.
Bakåtkompilerade vävnader används kliniskt för vävnad reparation och utbyte, och utvecklas som verktyg för drogkontroll och mänskliga sjukdomar modellering. Själv monterade vävnader erbjuder fördelar över byggnadsställning-baserade vävnadsteknik, såsom förbättrad matrix nedfall, styrka och funktion. Men finns det några tillgängliga metoderna för att fabricera 3D vävnader utan sådd celler eller inom en stödjande byggnadsställning. Tidigare har utvecklat vi ett system för fabricera själv monterade vävnad ringar av sådd celler i icke-häftande agaros brunnar. Ett Polydimetylsiloxan (PDMS) negativa kastades först i en bearbetad polykarbonat mögel och sedan agaros var geléartad i den negativa PDMS att skapa ringformade cell sådd brunnar. Mångsidigheten hos denna strategi var dock begränsat resolution av verktyg som finns för bearbetning polykarbonat mögel. Här visar vi att 3D-tryckt plast kan användas som ett alternativ till maskinbearbetade polykarbonat för fabricera PDMS negativ. Den 3D-tryckta formen och reviderade mögel design är enklare att använda, billig att producera och kräver betydligt mindre agaros och PDMS per cell sådd väl. Vi har visat att de resulterande agaros brunnarna kan användas att skapa själv monterade vävnad ringar med anpassade diametrar från en mängd olika celltyper. Ringar kan sedan användas för mekaniska, funktionella och histologisk analys, eller för att tillverka större och mer komplexa tubulär vävnader.
Cellulära självmontering strategier för att fabricera vävnadstekniska blodkärl är ett alternativ till byggnadsställning-baserade metoder. Själv monterade, byggnadsställning-fri vävnader kan ha större cell densiteten, förbättrad matrix nedfall och styrka och förbättrad biologisk funktion jämfört med byggnadsställning-baserade vävnader1,2,3,4 . Bilda 3D vävnader utan användning av EXOGEN byggnadsställning stöd med specifika storlekar och former är dock fortfarande en utmaning. Vissa metoder smälter samman lager av cell ark att bilda tjockare konstruktioner, även om denna process kan vara tidskrävande och labor intensiv5. Alternativt, celler kan seedade i icke-häftande formar och tillåtet till samlade in spheroids, ringar och andra vävnad former6,7,8.
Själv monterade vävnad ringar kräver färre celler, kortare kultur tider och mindre reagenser än större tubulär konstruerad vävnader, men kan fortfarande vara mekaniskt testade, undersöktes histologiskt eller används för kontraktilitet och andra funktionella tester7 , 9 , 10 , 11. eftersom de kan snabbt fabricerade och enkelt testas, vävnad ringar är idealiska för screening stort antal kultur parametrar, och har potential för användning som sjukdom modeller11 eller verktyg för drug screening12. Dessutom ringar kan vara smält till komplexare vävnad strukturer som blodkärl eller luftstrupen7,13, och ringar kan säkring mer fullständigt än andra former såsom spheroids14,15.
Agaros används allmänt som ett mögel material för fabricera själv monterade vävnader på grund av dess biokompatibilitet, permeabilitet och icke-cell vidhäftningsegenskaper. Exempelvis fabricerade Norotte et al. agaros formar från strängpressad stång, vilket möjliggjorde begränsad kontroll över mögel form och krävs specialutrustning15. Tan et al. deponeras alginat droppar som byggnadsenheter för att fabricera anpassade hydrogel formar i olika former (pyramid, square)16. Den stora diametern av de alginat spheroids (300 µm) resulterade dock i funktioner med låg upplösning. Sådan låg upplösning kan resultera i ojämn mögel ytor som kan inverka negativt på cell aggregering konsistens. Alternativt, agaros kan gjutas in polymer negativ att skapa icke-häftande formar med smidig funktioner och specifika dimensioner6,7,17.
Tidigare rapporterade vi ett system för att fabricera anpassade ringformig agaros cell-sådd brunnar från en PDMS negativa rösterna i ett slipat polykarbonat mögel7,18. Agaros var hälls i PDMS negationen och tillåtet att sätta7,18. Cellerna var sedan seedad i agaros brunnar, där de samman för att bilda själv samlat, byggnadsställning-fri vävnad ringar på mindre än 24 h7,18. PDMS negativ är autoklaverbart, kan återanvändas många gånger och är mjuka och flexibla, vilket gör det enkelt att ta bort stelnad agaros brunnarna. När detta system rapporterades först i Gwyther o.a. 7, PDMS negativ kastades från slipat polykarbonat formar (figur 1A). Efter agaros gjutning, var cell sådd brunnarna individuellt klipp ut och placeras i brunnar i en 12-väl plattan7,18. Designen ändrades nyligen att en enda agaros mögel producerar 5 ringar och passar i en väl 6-well platta, vilket eliminerar behovet av att klippa ut enskilda brunnar och minska mängden PDMS och agaros som krävs för att producera varje ring (figur 1B). En mindre cell sådd tråg bredd användes för att minska antalet seedade celler krävs för att uppnå ring bildas. Trots dessa förändringar, upplösning och anpassning av formar begränsades till tillgängliga standard pinnfräs dimensioner och micromilling kan vara oöverkomligt kostsamma. Dessutom dator numerisk styrning (CNC) bearbetning kan vara tidskrävande och besvärligt på grund av behovet av att reservera tid på utnyttjad hårt anpassad utrustning, ytterligare datorstödd tillverkning (CAM) programvara för att konvertera den datorstödd design ( CAD) filen till en programmerbar verktygsväg och pålitlig fixturering å polykarbonat under bearbetning.
I den aktuella studien undersökte vi användningen av 3D-utskrifter som ett alternativ till CNC-bearbetning. 3D-printing används ofta för engineering anpassade implantat, fabricera byggnadsställning material, och för direktutskrift av celler och vävnad spheroids15,19,20. Vi använde en högupplöst 3D-skrivare, och specialiserade 3D utskrift material som möjligt för oss att skriva ut en styv mögel med en slät, glansig ytbehandling (se Tabell för material). Vår teknik möjliggör tillverkning av mycket anpassningsbar, högupplösta plastformar som kan användas för gjutning PDMS negativ och agaros brunnar. Design iterationer sammanfattas i figur 1. Den mögel designen ändrades ytterligare i den 3D-tryckt mögel versionen att inkludera avsmalnande ytterväggarna och ett centrumhål för att underlätta borttagning av både PDMS negativen från 3D-tryckt formar och agaros brunnarna från PDMS negativ. Dessa koniska funktioner kan inte uppnås med standard bearbetningsprocesser. Avståndet från botten av brunnarna till botten av formen ökades i denna iteration, vilket resulterar i en tjockare agaros bas nedan inlägg att minska risken för inlägg bryter under agaros väl borttagning. Mögel och ring fabrication förfarandet visas schematiskt i figur 2.
Här har vi presenterat en mångsidig metod för snabb tillverkning av själv monterade vävnad ringar med enkelt anpassade dimensioner med hjälp av 3D-utskrifter. Vår metod är liknande som rapporterats i Svoronos et al. 6 , där 3D-tryckt honeycomb och hund-ben formade vax mögel användes att kasta PDMS negativ. Formarna har dock ändrats för att innehålla flera unika designfunktioner. Ett snäpp (figur 4A(1)) ger orientering av mögel så att varje ring märkt och övervakas individuellt. Hål i mitten (figur 4A(2)) hjälper till att förbättra spridningen av medium i brunnar. CAD filnummer är tryckta direkt på mögel; Därför PDMS negativ är varje märkta med versionsnummer och bokför diameter (figur 4A3). Avsmalnande ytterväggarna (figur 3(1), 5 °), på toppen av väl dalar (figur 3(2), 45 °) och centrala hål (figur 3(3), 5 °) gör det lättare att ta bort PDMS negativ från 3D-tryckt formarna , och agaros brunnar är lättare att ta bort från PDMS negativen (figur 4A(2), A(4)).
Vi har visat detta system mångsidighet genom att tillverka själv monterade ringformade vävnader i olika diametrar och celltyper, inklusive primära mänskliga muskulatur celler (SMCs)18,22, råtta aorta SMCs7 , 23, humana mesenkymala stamceller (hMSCs)13och SMCs härrör från inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)11 (tabell 1). I pågående arbete, vi utvärderar bildandet av ringar från ytterligare celltyper som endotelceller, och fusing brosk ringar i olika storlekar för potentiella tillämpningar i luftrör ersättare. Förutom helt cell-derived konstruktioner, har vi också använt detta system för att tillverka ringar med inbyggda tvärbunden gelatin mikrosfärer13,22. Mikrosfärer kan införlivas inom vävnad ringar under självmontering för att ge ytterligare mekanisk styrka, eller för lokaliserade leverans av tillväxtfaktorer13,22.
När fabricera vävnad ringar, kan optimering av cell nummer krävas för olika celltyper. Minsta cell nummer kan variera baserat på storlek och typ av celler. Till exempel hSMCs som härrör från iPSCs är seedade 600 000 celler/ring11, hMSCs och primära hSMCs är seedade på 400 000 celler/ring13,22, och råtta aorta SMCs är seedade 500 000 celler/ring18. Tråg dimensioner påverka ring bildning och det minsta antalet celler krävs för ring bildandet24. För studier med mänskliga celler och 3D-tryckt formar användes en tråg bredd 2 mm. Ursprungliga polykarbonat formarna hade tråg bredden 3,75 mm, som krävt 750 000 hSMCs att bilda en 2 mm cell ring18. Med minskad tråg bredd kunde vi minska antalet celler nödvändiga för ring bildas med 46% till 400 000 celler per ring25. Mängder av celler seedade per ring sammanfattas i tabell 1.
När du väljer ett 3D-tryckt material, behöver många faktorer beaktas. Eftersom PDMS härdas vanligen vid 60 ° C, 3D-tryckt material måste ha en tillräckligt hög smälttemperatur att undvika skador under PDMS härdning. Smälttemperaturen för det material som används i denna studie (ett patentskyddat material, se Tabell för material) finns inte. När bakat vid 60 ° C för 1 h, konstaterade vi dock att materialet började producera en lukt. Därför beslöt vi att sänka bota temperatur till 50 ° C och öka härdningstiden för att baka PDMS utan att skada det 3D-tryckt materialet. Justeringar i härdningstid kan vara nödvändigt om formar ändras till form större PDMS negativ. En ytterligare härdning period vid 60 ° C efter PDMS avlägsnande från 3D-tryckt formarna förhindrar den slutliga PDMS negativa återstående tacky, samtidigt begränsa temperaturen 3D-tryckt mögel är utsatt för. Observera att vissa material hämma härdning av PDMS, så se till att det valda materialet är kompatibel med PDMS. Slutligen måste också mögel material toxicitet beaktas. Även 3D-tryckt mögel inte kommer vara i direkt kontakt med celler, är det möjligt att några rester från mögel kan överföras till det negativa under förfarandet för härdning PDMS. Vi fann att mycket grundlig tvätt med rengöringsmedel var tillräcklig för att ta bort eventuella rester från den negativa PDMS. Dock har vi tidigare observerade att otillräcklig tvättning ledde till dålig ring bildande i agaros brunnar för första några användningsområden för den negativa PDMS. Användning av PDMS rösterna från andra 3D-tryckt material kan kräva ytterligare utredning för att verifiera att tvättmedel räcker att ta bort mögel restprodukter, inbegripet eventuella potentiella lakvatten. Periodisk provning kan också vara nödvändigt, eftersom det möjligt att upprepade värme cykler (även till 50 ° C) kan skada mögel över tid, och leda till ökningar i rester efter upprepad användning. Hittills har vi använt en enda 3D-tryckt mögel för att producera mer än 30 PDMS negativ som har använts för att framgångsrikt skapa vävnad ringar.
Övergripande, 3D utskrift gör större mångsidighet för tillverkning av agaros formar än bearbetning av polykarbonat. Det ger en högre upplösning än vad som är möjligt med verktyg och mögel design begränsas inte av dimensionerna av de tillgängliga verktygen. Detta möjliggör för större anpassning, och tillägg av funktioner såsom nedtrappning som eventuellt inte med bearbetning. Detta system kan tillämpas på fabricera själv monterade vävnader i andra former också, förutom ringar6,17. Använder metoden ring fabrication har vi utvecklat vävnad ringar från en mängd olika celltyper och storlekar för potentiella tillämpningar i luftrör tissue engineering13, konstruerade blodkärl7och modellering vaskulära sjukdomar11.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänna tacksamt Dr Erica Stults (akademisk forskning & ansökan vetenskapsman, WPI informationstekniktjänster) för hennes hjälp med 3D utskrift, Amanda Zoë Reidinger, Ph.D., Chris Nycz och Karen Levi, M.E., för deras insatser på mögel design, Kathy Suqui och Jennifer Mann för deras hjälp testning mögel design och Michael O’Keefe för hans hjälp med filmning. Detta arbete stöds av NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, har), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), NSF GRO EEC0754996 (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, har) och NIH R15 HL137197 (MWR, har).
SeaKem LE Agarose | Lonza | 50040 | |
PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
VeroWhite | StrataSys | RGD835 | |
3D printer | StrataSys | Objet 260 Connex | |
DMEM | Corning Cellgro | 15-017-CV | |
FBS | Thermo Fisher | 16000069 | |
L-glutamine | Corning Cellgro | 25-015-CI | |
Non-essential amino acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
Sodium pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
Pen-strep | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
Trypsin | Corning Cellgro | 25-053-CI | |
Trypan blue | Corning Cellgro | 25-900-CI | |
PBS | Lonza | 17-516F | |
6-well plate | Corning | 353046 | |
WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells | Provided by T. Wight [ref 21] | N/A |