Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D

Published: April 2, 2018 doi: 10.3791/56618
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2, 1
1Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Gladstone Institute for Cardiovascular Disease

Summary

פרוטוקול זה מתאר פלטפורמה בדיית רקמות עצמית שהורכב טבעות בגדלים משתנים באמצעות תבנית מותאמת אישית פלסטיק מודפס 3D. PDMS התשלילים נרפאים ב כייר מודפס 3D; אז agarose הוא ליהק את התשלילים PDMS נרפא. התאים הם נזרע לתוך בארות agarose וכתוצאה מכך היכן הם מצטברים לטבעות רקמות.

Abstract

רקמות מהונדסים נמצאים בשימוש קליני עבור החלפה ותיקון של רקמות, מפותחים כמו כלים והתרופות הקרנה של מחלות אנושיות דוגמנות. רקמות עצמית שהורכב מציעים יתרונות הנדסת רקמות מבוסס לגרדום, כגון מטריקס משופרת התצהיר, כוח, הפונקציה. עם זאת, ישנם כמה שיטות זמינות בדיית רקמות 3D ללא זריעת תאים על או בתוך לפיגום התומכים. בעבר, פיתחנו מערכת עבור בדיית טבעות רקמות עצמית שהורכב על ידי זריעה תאים לתוך בארות agarose ללא דבק. Polydimethylsiloxane (PDMS) שלילי הושלך לראשונה בתבנית פוליקרבונט במכונה ולאחר מכן agarose היה gelled את PDMS שלילי ליצירת תא בצורת טבעת זריעה בארות. עם זאת, צדדיות של גישה זו היה מוגבל על ידי הרזולוציה של הכלים הזמינים עבור עיבוד שבבי כייר פוליקרבונט. . הנה, נדגים כי פלסטיק מודפס 3D יכול לשמש כחלופה פוליקרבונט במכונה בדיית PDMS שליליות. עובש מודפס 3D ועובש המתוקן עיצוב הוא פשוט יותר להשתמש, זול לייצר, דורש משמעותית פחות agarose ו PDMS בכל תא זריעה היטב. הראו כי הבארות agarose וכתוצאה מכך יכול לשמש ליצירת רקמות עצמית שהורכב טבעות עם קטרים מותאם אישית מתוך מגוון של סוגי תאים שונים. טבעות יכול לשמש לאחר מכן לניתוח מכניים פונקציונלי, היסטולוגית, או עבור בדיית רקמות צינורי גדולים יותר ומורכבים יותר.

Introduction

הסלולר הרכבה עצמית גישות בדיית רקמות מהונדסים כלי הדם הם אלטרנטיבה גישות לגרדום. רקמות עצמית התאספו, לגרדום ללא שיש צפיפות תא גדול, מטריקס משופרת התצהיר כוח, ואת פונקציה ביולוגית משופרת לעומת רקמות מבוסס לגרדום1,2,3,4 . עם זאת, יצירת רקמות 3D ללא שימוש בפיגומים אקסוגני תמיכה עם הצורות והגדלים ספציפי נשאר אתגר. כמה שיטות מתמזגים שכבות של יריעות תא להקים מבנים עבה יותר, למרות תהליך זה יכול להיות זמן רב של עבודה אינטנסיבית5. לחלופין, התאים ניתן נזרע לתוך תבניות ללא דבק, מותר להפעיל עליה פונקציית צבירה לתוך spheroids, טבעות, אחרים רקמות צורות6,7,8.

טבעות רקמות עצמית שהורכב דורשים פחות תאים, זמנים קצרים יותר תרבות, פחות ריאגנטים יותר גדול צינורי מהונדסים רקמות, אבל שניתן עדיין מכנית נבדק, בחן בהיסטולוגיה או השתמשו contractility, בדיקה פונקציונלית אחרים7 , 9 , 10 , 11. כי הם יכולים להיות מפוברק במהירות ונבדק בקלות, רקמות טבעות הינם אידיאליים עבור הקרנת מספר רב של פרמטרים תרבות, ויש פוטנציאל לשימוש כמו מחלת מודלים11 או כלים להעברת סמים הקרנת12. בנוסף, טבעות יכול להיות מותך לתוך מבנים מורכבים יותר רקמות כגון כלי דם או קנה הנשימה7,13, טבעות ייתכן נתיך לחלוטין. יותר מאשר צורות אחרות כגון14,spheroids15.

Agarose משמש כחומר עובש בדיית רקמות עצמית שהורכב בשל הביו שלה, חדירות, מאפייני התא הלא דביק. לדוגמה, Norotte. ואח מפוברק agarose בתבניות של מוטות מעוקם, שאיפשר שליטה מוגבלת על הצורה עובש, נדרש ציוד מיוחד15. . השיזוף ואח להפקיד alginate טיפות כמו בניית יחידות כדי לבדות הידרוג מותאם אישית בתבניות שונות צורות (פירמידה, כיכר)16. עם זאת, קוטר גדול spheroids קילוף פלסטיצידיות (300 מיקרומטר) הביא תכונות עם רזולוציה נמוכה. החלטה כזו נמוכה עלולה לגרום משטחים עובש לא אחיד יכול להשפיע לרעה על התא צבירת עקביות. לחלופין, ניתן לצקת agarose לשליליים פולימרי ליצירת תבניות ללא דבק עם ממדים ספציפיים6,7,17ותכונות החלקה.

בעבר דיווחנו מערכת עבור בדיית בארות זורעות תא agarose טבעתי מותאם אישית של PDMS גבס שלילי פוליקרבונט וטוחנים כייר7,18. Agarose היה נשפך לתוך השלילי PDMS, מותר לקבוע7,18. התאים היו אז נזרע לתוך agarose וולס, איפה הם מצטברים לצורה עצמית מורכבים, רקמות לגרדום ללא טבעות בתוך פחות מ- 24 שעות7,18. התשלילים PDMS autoclavable, יכול לעשות שימוש חוזר פעמים רבות, והם רך וגמיש, ולכן קל להסיר את הבארות agarose הקרושה. כאשר מערכת זו בתחילה דווח. Gwyther et al. 7, PDMS שליליות היו יצוק פיקנטיים תבניות פוליקרבונט (איור 1 א'). לאחר agarose השלכת, הבארות זריעה תא בנפרד לגזור, להציב לתוך בארות7,12-ובכן צלחת18. העיצוב השתנה לאחרונה כך תבנית יחיד agarose מייצרת 5 צלצולים, משתלב טוב של צלחת 6-ובכן, ומבטל את הצורך לגזור בארות בודדים, להפחית את כמות PDMS ו- agarose הנדרש כדי לייצר כל טבעת (איור 1B). תא קטן זריעה שוקת רוחב שימש כדי להפחית את מספר התאים הזריעה הדרוש להשגת היווצרות טבעת. למרות שינויים אלה, הרזולוציה ואת התאמה אישית של תבניות היו מוגבלים למימדים endmill סטנדרטיים זמינים, micromilling וניתן לחדשו. בנוסף, עיבוד שבבי (CNC), בקרת נומרית המחשב יכול להיות זמן רב ולא בכבדות מסורבלת עקב הצורך שמורת הזמן מנוצל ציוד מותאם אישית, תוכנת ייצור ממוחשב נוספים (CAM) כדי להמיר את (תכנון בעזרת מחשב קובץ ה-CAD) נתיב של הכלי ניתן לתכנות, ו fixturing אמין של החלק פוליקרבונט במהלך עיבוד שבבי.

במחקר הנוכחי, בדקנו את השימוש הדפסת תלת-ממד כחלופה עיבוד שבבי CNC. הדפסה תלת-ממדית נעשה שימוש נרחב עבור הנדסה השתלים מותאם אישית, בדיית חומרים לגרדום, ועבור הדפסה ישירה של תאים, רקמות spheroids15,19,20. השתמשנו מדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה, וסיום 3D מיוחדים הדפסת חומר זה אפשרו לנו להדפיס תבנית נוקשה עם חלקה, משטח מבריק (ראה טבלה של חומרים). הטכניקה שלנו מאפשר ייצור של תבניות פלסטיק להתאמה אישית, רזולוציה גבוהה יכול לשמש ליציקת התשלילים PDMS ו- agarose וולס. עיצוב איטראציות מסוכמות באיור1. העיצוב עובש היה לשינוי נוסף בגירסה עובש מודפס 3D כדי לכלול מחודדות הקירות החיצוניים לבין חור במרכז כדי להקל על הסרת שני החסרונות PDMS של הדפסת תלת-ממד בתבניות הבארות agarose מן PDMS שליליות. תכונות אלה מחודדות אינה יכולה להיות מושגת עם תקן עיבוד שבבי תהליכים. המרחק מהחלק התחתון של הבארות לתחתית התבנית הוגדל ב איטרציה זו, וכתוצאה מכך הבסיס מתחת ההודעות כדי להפחית את הסיכון של ההודעות שבירת במהלך ההסרה טוב agarose עבה agarose. ההליך פבריקציה נוספת עובש וטבעת מוצג סכמטי באיור2.

Protocol

1. מכינים את התבנית מודפס 3D

  1. להכין ציור התבנית את הממדים הרצויים CAD.
  2. לשלוח את הקובץ CAD במדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה. בחר המתאים פלסטיק להדפסת החומר, עם גימור מבריק.
  3. לאחר ההדפסה, יש לשטוף ביסודיות את התבנית עם חומרי ניקוי ומים.

2. הליהוק PDMS שליליות

  1. למדוד את הכמות הרצויה של PDMS הבסיס על איזון. עבור תבנית עם 60 מ"מ בקוטר 2 מ מ. ובכן ועמדות, השתמש 25 גרם.
  2. להוסיף ריפוי סוכן 1:10 (w/w) יחס לבסיס PDMS.
  3. ומערבבים נמרצות עד שני מרכיביה משולבים ביסודיות. ערבוב לא מספיק עלול לגרום ריפוי לא שלם של PDMS, וכתוצאה מכך משטח "דביק".
  4. המקום חתיכה של נייר דבק מעבדה סביב הגבול של הדפסת תלת-ממד בתבניות, כדי לאפשר היווצרות שכבת הבסיס PDMS מעל הבארות המודפס.
  5. שופכים את התערובת PDMS לתבנית ומניחים את התבנית לתוך תא ואקום גז דה-עד כל הבועות משתחררים.
  6. לרפא את PDMS ב 50 מעלות צלזיוס למשך 2-4 שעות, או עד פני השטח למוצק מספיק כדי להסיר.
  7. הוצא את הקלטת למעבדה ולחלץ בקפידה את השלילי PDMS.
  8. דגירה של PDMS ב 60 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 נוסף (לאחר הסרת מן העיפוש הדפסת תלת-ממד) כדי להבטיח שעובש נרפאה לחלוטין.
  9. לשטוף את PDMS ביסודיות עם חומר ניקוי ומים כדי להסיר שאריות. כביסה לא מספיק עלול לגרום במבנה הטבעת המסכן למטרה הראשונה של השלילי PDMS.

3. בדיית Agarose וולס

  1. להכין agarose בארות עד יום אחד לפני זריעה תאים.
  2. להפוך את פתרון agarose 2% (w/v) DMEM, תא לחץ.
  3. Pipet 4 מ"ל agarose מותכת לתוך PDMS בלוק שלילי. אז pipet agarose ישירות לתוך ההודעות של PDMS נגטיב. הסר כל בועות האוויר עם טיפ pipet, כמו בועות עלול לגרום inhomogeneities בממדים היטב.
  4. הערה: יש אל תמלא יותר מדי תבניות; המשטח העליון של agarose חייב להיות שטוח, כך agarose בארות תהיה רמה על הוצאתם אל מחוץ PDMS והשמה לוחות 6-ובכן תרבות. שאריות agarose ייתכן re בלוקי ומשמש שוב, למרות לא יותר מפעם אחת.
  5. לאחר agarose מתקררת (כ 10 דקות על 4 מ"ל agarose; בתבניות גדולות יותר עשוי להזדקק פעמים כבר הקירור), להפריד את בארות agarose התשלילים PDMS באמצעות מלקחיים בוטה ובזהירות להעביר לתוך טוב של צלחת 6-. טוב.
  6. להטביע את בארות agarose במדיום תרבות שלמה, equilibrate בין לילה ב- 37 מעלות צלזיוס חממה לכהן להשתמש.

4. זריעת רקמות טבעות

  1. תרבות עכברוש שריר חלק מאבי העורקים תאי21 (RaSMCs) DMEM המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS), 1%-גלוטמין, חומצות אמינו שאינן הכרחיות 1%, 1% נתרן פירובט ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין עד שיגיעו למפגש 70%.
    הערה: תאים צריך להיות מחונן ב- 5% CO2 ו- 37 מעלות צלזיוס ב 15 ס מ תרביות רקמה צלחות
  2. לאחר בתבניות הן equilibrated (סעיף 3), להכין RaSMCs זריעה.
  3. לשטוף צלחות פעמיים עם 5 מ לכל צלחת של פוספט buffered תמיסת מלח (PBS).
  4. להוסיף 3 מ"ל טריפסין 0.25% לכל 15 ס מ פטרי. להעביר את הצלחות חממה 37 º C למשך 2-3 דקות, או עד תאים לקחתם רלוונטי.
  5. לנטרל טריפסין עם אמצעי אחסון שווה (3 מ"ל לכל צלחת) של מדיום תרבות שלמה. Resuspend את התאים ביסודיות כדי לשבור את הגושים.
  6. לדלל עם aliquot של השעיה תא 1:1 עם צבע trypan blue, לספור את התאים עם hemocytometer.
  7. Centrifuge הנפח הכולל של התא השעיה במשך 5 דקות ב- 200 g x כדי הצניפה תאים.
  8. Resuspend תאים על ריכוז של 10 מיליון תאים לכל מ; זה יגרום בתאים 500,000 לכל 50 µL.
    הערה: סוגי תאים שונים עשויים לדרוש ריכוזים תאים שונים.
  9. האחות האמצעי כל העובש agarose. להיות זהירים כדי להסיר כל מדיום מבארות בודדים, אך לא ידקור את תחתיות הבארות.
  10. Pipet 50 µL של השעיה כל טוב.
  11. להוסיף בזהירות 2 מיליליטר בינוני טריים סביב החלק החיצוני של העובש agarose. יש להיזהר לא מכניסים גלישה בינונית הבארות של agarose. מניחים צלחות בחממה ללילה (כ ח 16).
  12. לאחר דגירה לילה, תשאף האמצעי מחוץ התבניות, ולהוסיף בינוני טריים 4.5 מ"ל כל טוב של צלחת 6-ובכן כך תבניות וטבעות לחלוטין טובע. שינוי בינוני מדי יום.

Representative Results

מערכת זו מאפשרת התם, ייצור מותאם אישית של תא agarose זריעה בארות המאפשרת תא הרכבה עצמית של 3D בצורת טבעת מהונדסים רקמות. הדפסה תלת-ממדית מאפשר רזולוציה טובה יותר גמישות רבה יותר בעיצוב עובש מאשר עיבוד שבבי פוליקרבונט, איפה מידות מוגבלות על ידי גודל כלי זמין. עם מדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה, ניתן להדפיס חומות רזה כמו 0.254 מ מ, מידות שוקת מוגבלים רק על ידי הרזולוציה של המדפסת (15.2 מיקרומטר רזולוציה עבור מחקרים אלה). בדרך כלל, CNC endmills פחות מ- 0.3 מ מ אינם זמינים מסחרית, כך שאין אפשרות ליצור שקתות ברוחב קטן יותר. מיקרו-כרסום יכול לייצר תכונות קטן יותר, למרות הציוד הנדרש עשוי להיות יקר מדי או בלתי נגישה למעבדות המחקר הביו-רפואי רבים. מידות שוקת, עקמומיות מוגבלים גם על ידי צורת קצה endmill. בנוסף, תכונות כגון בזווית או קירות ישרים אינן אפשריות, תכונות קטנות עשוי לשבור במהלך תהליך עיבוד שבבי.

שרטוטי CAD ניתן לשנות בקלות לייצר תבניות מודפס 3D, PDMS התשלילים של ממדים הניתנים להתאמה אישית. איור 3 מתאר את ממדי שלנו הנוכחי 2 מ מ פוסט מודפס 3D בתבניות, לעומת חזרות העיצוב הקודם. התהליך היא זולה; 2 מ מ 5-טבעת מודפס 3D עובש עלות USD 44.67 הדפסה תלת-ממד, כל חלק יכול לשמש ליצירת במילות שלילה PDMS מרובות. עד כה, יצרנו התשלילים PDMS יותר מ- 30 מתוך תבנית תלת-ממד מודפס יחיד. שלילי לכל דורש 25 גר' PDMS-0.11 דולר ארה ב כל g (2.75 USD PDMS שלילי). כל שלילי PDMS יכול להיות לנקות עם חומרי ניקוי, בלוק, ושימש מחדש עד כמה שנים, תלוי בתדירות השימוש. לעומת העיצוב המקורי18, כייר קומפקטי מודפס 3D משתמש במידה ניכרת פחות PDMS, agarose לכל טבעת רקמה 2 מ מ (איור 1E).

תאים נזרע בבארות equilibrated agarose צבירה טופס טבעות רקמות בתוך פחות מ- 24h. הטבעת מידות תלויים הממדים של הבארות agarose. כאן, להדגים כי יכול להיות מפוברק עכברוש עצמית שהורכב שריר חלק תא טבעות בבארות עם 2, 4 או הודעות בקוטר 12 מ מ (איור 4). בעוד טבעות במחקר זה היו רק תרבותי במשך 3 ימים, לנו יש בעבר תרבותי hSMC טבעות עד 2 שבועות22, טבעות סחוס hMSC במשך שבועות עד 313. כפי שדווח בעבר, טבעות יכול לתפקד כמו מודלים 3D במבחנה של רקמות עבור הערכה כמותית של רקמות לתפקד11 ו-13,חוזק מכני22, ואת יכולה גם לשמש בתור יחידות מודולרי הבניין ליצור רקמה דמוי צינור בונה7,13. תא תנאים זריעה, תכונות פונקציונלי של רקמות טבעות המהונדס מסוגי התאים מסוכמות בטבלה 1.

Figure 1
איור 1: פוליקרבונט עובש עיצובים- בתחילה, בתבניות 15-ובכן היו במכונה בפוליקרבונט (A). גירסאות מאוחרות יותר בהשתתפות בעיצוב קומפקטי יותר (B), עם 5 בארות מיועד להתאים בתבנית פוליקרבונט יחיד, ובתוך אחד טוב של צלחת 6-. טוב. כאן, לשנות עיצוב זה להשתמש פלסטיק מודפסים-תלת-ממד כחלופה יותר להתאמה אישית במכונה פוליקרבונט (C). (ד) מוצגות agarose וולס המציא הראשונית עיצוב18 (משמאל) לעומת העיצוב הקומפקטי הנוכחי (מימין), אשר דורש באופן משמעותי פחות agarose, והוא אינו מחייב הפרדה ידנית של בארות. כמויות של PDMS ו- agarose הנדרש בכל איטראציה עיצוב מוצגים (E). מרכז ההודעות הם 2 מ מ קוטר. עובש (A) הוא 6 ס מ x 12 ס מ, (B) קוטרו 5 ס מ, (ג) יש קוטר 6 ס"מ. סרגל קנה מידה (D) = 3 ס"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ייצור של רקמות עצמית שהורכב טבעות. תבנית מודפס 3D משמש להטיל שלילי PDMS, בו הוא משתמש כדי להטיל את בארות agarose (א). התאים הם אז נזרע ישירות לתוך הבארות agarose, שבו הם מצטברים בתוך פחות מ 24 שעות הטופס רקמות טבעות (B). קווים מקווקווים (B) להציג את קווי המתאר טוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תצוגת חתך הרוחב של ציור עובש מודפס 3D CAD. מידות רוחב שוקת (A), גובה שוקת (B), מרכז החור (C), הכולל קוטר (D), השפה החיצונית (E) של גובה החומה החיצונית (F) מוצגים. הקירות החיצוניים (1), החלק העליון של וולס (2), וכן מרכז החור (3) הם צמצום (בזווית של 5 ° עבור 1 ו-3, 45 ° 2) לשיפור קלות להסרת השליליות PDMS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: ציורי CAD עם התשלילים PDMS המקביל וטבעות SMC שהורכב עצמית עם 2 (א), 4 (B) ו- 12 (ג) מ"מ פוסט קטרים. (א), (1) מציין שלב מתן אוריינטציה (2) מציין חור מרכזי לשיפור זלוף, (3) מספר קבצים, אשר, דפוסים ישירות על גבי התשלילים PDMS, (4) מראה החיצוני קיר, אשר הוא צמצום כדי להקל על הסרת שלילי PDMS. גודל ברים בבארות agarose = 1 ס מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

סוג התא תאים נזרע לפי הטבעת קוטר טבעת משך זמן תרבות אנליזה פונקציונלית שבוצעה
עכברוש SMC 0.5, 1 או 3 x 106 2, 4 או 12 מ מ 3 ימים המחקר הנוכחי; N/A
iPSC נגזר SMC 11 0.6 x 106 2 מ מ 17 ימים Contractility בדיקה, בדיקת מתיחה uniaxial, ניתוח היסטולוגית
התקן SMC אנושי 22 0.4 x 106 2 מ מ 2, 7, או 14 ימים Uniaxial בדיקת מתיחה, ניתוח היסטולוגית
MSC אנושי 14 0.4 x 106 2 מ מ 21 ימים Uniaxial בדיקת מתיחה, ניתוח היסטולוגית, טבעת פיוז'ן ודחיסת צינור בדיקות, בידול לתוך רקמת סחוס

טבלה 1: מספרי הטלפון הנייד הדרוש עבור טבעת פבריקציה נוספת בין סוגי תאים שונים.

Discussion

כאן אנחנו הציגו שיטה רב-תכליתי הזיוף מהירה של רקמות עצמית שהורכב טבעות עם ממדים להתאמה אישית באמצעות הדפסת תלת-ממד. השיטה שלנו היא דומה לזה דיווחו Svoronos ואח. 6 , שבו מודפס 3D honeycomb ועצם בצורת שעווה בתבניות שימשו להטיל PDMS שליליות. עם זאת, התבניות שונו כדי להכיל מספר תכונות עיצוב ייחודי. שפר (איור 4A(1)) מספק אוריינטציה התבנית כדי לאפשר כל טבעת הנקרא ולהיות מנוטרים באופן אינדיבידואלי. החור המרכזי (איור 4A(2)) מסייע בשיפור דיפוזיית בינוני לתוך הבארות. במספרי קובץ CAD מודפסים ישירות על העובש; לכן, PDMS התשלילים מסומנות כל אחד עם מספר הגירסה ורשום קוטר (איור 4A3). מחודדות קירותיו החיצוניים (איור 3(1), 5 °), בחלק העליון של שקתות טוב (איור 3(2), 45 °), וכן חור במרכז (איור 3(3), 5 °) להקל על הסר PDMS התשלילים של התבניות מודפס 3D , בארות agarose הם יותר קל להסיר את התשלילים PDMS (איור 4A(2), A(4)).

הראו צדדיות של מערכת זו על-ידי בדיית רקמות עצמית שהורכב בצורת טבעת מגוון רחב של קטרים, סוגי תאים, כולל ראשי השריר החלק האנושי תאים (SMCs)18,22, עכברוש אבי העורקים SMCs7 , 23בני אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSCs)13, SMCs נגזר pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs)11 (טבלה 1). אנו הערכת היווצרות של טבעות מכל סוגי תאים נוספים כגון תאי אנדותל בפעילות השוטפת,, פיוזינג טבעות סחוס בגדלים שונים עבור יישומים פוטנציאליים החלפת בקנה הנשימה. בנוסף לחלוטין נגזר תא בונה, גם השתמשנו במערכת זו ליצור טבעות עם ג'לטין צולבים incorporated microspheres13,22. Microspheres ניתן לשלב בתוך רקמת טבעות במהלך הרכבה עצמית כדי לספק חוזק מכני נוסף, או עבור מקומי משלוח של גורמי גדילה13,22.

כאשר בדיית רקמות טבעות, אופטימיזציה של מספר הטלפון עשוי להידרש עבור סוגי תאים שונים. התאים המיזערי מספרים עשוי להשתנות בהתאם הגודל והסוג של תאים. לדוגמה, hSMCs נגזר iPSCs הם נזרע ב 600,000 תאים/הטבעת11, hMSCs, hSMCs העיקרי נזרע ב 400,000 תאים/טבעת13,22, ואת עכברוש SMCs אבי העורקים הם נזרע תאים/טבעת 500,00018. מידות שוקת עשוי להשפיע גם על היווצרות הטבעת ואת המספר המינימלי של התאים הדרושים עבור טבעת היווצרות24. ללימודים עם תאים אנושיים, בתבניות מודפס 3D, שימש שוקת ברוחב של 2 מ מ. תבניות פוליקרבונט המקורי היה ברוחב שוקת של 3.75 מ מ, אשר נדרש hSMCs 750,000 כדי ליצור טבעת תא 2 מ מ18. עם הרוחב שוקת מופחתת, הצלחנו להפחית את מספר התאים הדרושים עבור טבעת היווצרות על-ידי 46%, לתאים 400,000 לפי הטבעת25. כמויות של תאים נזרע לפי הטבעת מסוכמים בטבלה1.

בעת בחירת חומר מודפס 3D, גורמים רבים צריכים לקחת בחשבון. מאחר PDMS הוא נרפא בדרך כלל ב 60 מעלות צלזיוס, החומר מודפס 3D להיות גבוה מספיק נמס בטמפרטורה כדי למנוע נזק במהלך PDMS ריפוי. טמפרטורת ההיתוך של החומר המשמש במחקר זה (חומר קניינית, ראה טבלה של חומרים) אינה זמינה. עם זאת, כאשר אפוי ב 60 מעלות צלזיוס במשך 1 h, הבחנו כי החומר החלו לייצר ריח. לפיכך, החלטנו להוריד את הטמפרטורה ריפוי עד 50 מעלות צלזיוס, להאריך את זמן ריפוי כדי לאפות את PDMS ללא פגיעה בחומר מודפס 3D. התאמות בריפוי הזמן עשוי להיות הכרחי אם תבניות משתנים כדי טופס התשלילים PDMS גדולים יותר. בתקופה ריפוי נוספת ב 60 מעלות צלזיוס לאחר הסרת PDMS מתוך תבניות מודפס 3D מונע את PDMS הסופית שלילי נותרת חסרת טעם, תוך הגבלת הטמפרטורה שכייר מודפס 3D הוא חשוף. שימו לב כי כמה חומרים לעכב ריפוי של PDMS, אז להבטיח כי החומר שנבחר הוא תואם PDMS. לבסוף, רעילות חומרים עובש יש גם לקחת בחשבון. בעוד כייר מודפס 3D לא יהיה במגע ישיר עם תאי, זה אפשרי כי שאריות של העובש עשוי להיות מועבר את PDMS שלילי במהלך ההליך ריפוי. מצאנו כי מאוד שטיפה עם סבון היה מספיק להסיר שאריות PDMS שלילי. עם זאת, הבחנו בעבר כביסה לקוי הוביל טבעת המסכן היווצרות בבארות agarose הראשונה כמה שימושים PDMS שלילי. השימוש PDMS יצוקה מחומרים אחרים מודפס 3D עשויים לדרוש חקירה נוספת כדי לוודא כי חומרי ניקוי מספיקה להסיר שאריות עובש, כולל כל leachates פוטנציאליים. בדיקות תקופתיות עשוי גם להיות נחוץ, כפי שזה אפשרי. זה חזר על חימום מחזורים (אפילו עד 50 מעלות צלזיוס) נזק העובש לאורך זמן, וגם גורמות לעלייה שאריות לאחר שימוש חוזר. עד כה השתמשנו תבנית תלת-ממד מודפס יחיד כדי לייצר יותר מ- 30 התשלילים PDMS נעשה בהם שימוש ליצירת בהצלחה רקמות טבעות.

הדפסה תלת-ממדית הכוללת מאפשר רב-תכליתיות גדולה יותר עבור הזיוף בתבניות agarose מאשר עיבוד שבבי של פוליקרבונט. הוא מספק רזולוציה גבוהה יותר מזו המתאפשרת עם אבזור, שבלונה אינו מוגבל על-ידי הממדים של הכלים הזמינים. דבר זה מאפשר התאמה אישית גדול יותר, התוספת של תכונות כגון מתחדדת זה לא ייתכן שניתן עם עיבוד שבבי. מערכת זו ניתן להחיל כדי בודה רקמות עצמית שהורכב בצורות אחרות גם כן, בנוסף טבעות6,17. שימוש בשיטת ייצור טבעת, פיתחנו רקמות טבעות ממגוון רחב של סוגי תאים ומידות עבור יישומים פוטנציאליים הנדסת רקמות והכו אותי13, כלי הדם מהונדסים7ו- מחלות לב וכלי דם דוגמנות11.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו להכיר בהכרת תודה ד ר אריקה Stults (מחקר אקדמי & יישום מדען, שירותי טכנולוגיית מידע WPI) על הסיוע 3D הדפסה, אמנדה זואי Reidinger, Ph.d., כריס Nycz, קרן לוי, חוקר מקרי המוות, לקבל את התשומה שלהם על עיצוב כייר, קטי Suqui ג'ניפר מאן לסיוע שלהם בדיקות עובש עיצובים ו מייקל אוקיף לסיוע שלו עם הצילומים.  עבודה זו נתמכה על ידי ה-NSF IGERT DGE 1144804 (MWR, משמשת), NIH R15 HL097332 (MWR, TAH), EEC0754996 REU ה-NSF (BA), NIH 1R01 EB023907 (MWR, משמשת) ו- NIH R15 HL137197 (MWR, משמשת).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SeaKem LE Agarose Lonza 50040
PDMS Dow Corning Sylgard 184
DMEM Corning Cellgro 15-017-CV
VeroWhite StrataSys RGD835
3D printer StrataSys Objet 260 Connex
DMEM Corning Cellgro 15-017-CV
FBS Thermo Fisher 16000069
L-glutamine Corning Cellgro 25-015-CI
Non-essential amino acids Corning Cellgro 25-025-CI
Sodium pyruvate Corning Cellgro 25-000-CI
Pen-strep Corning Cellgro 30-002-CI
Trypsin Corning Cellgro 25-053-CI
Trypan blue Corning Cellgro 25-900-CI
PBS Lonza 17-516F
6-well plate Corning 353046
WKY 3M-22 rat aortic smooth muscle cells Provided by T. Wight [ref 21] N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. L'Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 12 (1), 47-56 (1998).
  2. Adebayo, O., Hookway, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. Self-assembled smooth muscle cell tissue rings exhibit greater tensile strength than cell-seeded fibrin or collagen gel rings. J Biomed Mater Res A. 101 (2), 428-437 (2013).
  3. Hayashi, K., Tabata, Y. Preparation of stem cell aggregates with gelatin microspheres to enhance biological functions. Acta Biomater. 7 (7), 2797-2803 (2011).
  4. Kelm, J. M., et al. A novel concept for scaffold-free vessel tissue engineering: self-assembly of microtissue building blocks. J Biotechnol. 148 (1), 46-55 (2010).
  5. McAllister, T. N., et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet. 373, 1440-1446 (2009).
  6. Svoronos, A. A., Tejavibulya, N., Schell, J. Y., Shenoy, V. B., Morgan, J. R. Micro-mold design controls the 3D morphological evolution of self-assembling multicellular microtissues. Tissue Eng Part A. 20 (7-8), 1134-1144 (2014).
  7. Gwyther, T. A., et al. Engineered vascular tissue fabricated from aggregated smooth muscle cells. Cells Tissues Organs. 194 (1), 13-24 (2011).
  8. Mehesz, A. N., et al. Scalable robotic biofabrication of tissue spheroids. Biofabrication. 3 (2), 025002 (2011).
  9. Laterreur, V., et al. Comparison of the direct burst pressure and the ring tensile test methods for mechanical characterization of tissue-engineered vascular substitutes. J Mech Behav Biomed Mater. 34, 253-263 (2014).
  10. L'Heureux, N., et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. Nat Med. 12 (3), 361-365 (2006).
  11. Dash, B. C., et al. Tissue-Engineered Vascular Rings from Human iPSC-Derived Smooth Muscle Cells. Stem Cell Reports. 7 (1), 19-28 (2016).
  12. Heureux, N., et al. A human tissue-engineered vascular media: a new model for pharmacological studies of contractile responses. FASEB J. 15, 515-524 (2001).
  13. Dikina, A. D., Strobel, H. A., Lai, B. P., Rolle, M. W., Alsberg, E. Engineered cartilaginous tubes for tracheal tissue replacement via self-assembly and fusion of human mesenchymal stem cell constructs. Biomaterials. 52, 452-462 (2015).
  14. Twal, W. O., et al. Cellularized microcarriers as adhesive building blocks for fabrication of tubular tissue constructs. Ann Biomed Eng. 42 (7), 1470-1481 (2014).
  15. Norotte, C., Marga, F. S., Niklason, L. E., Forgacs, G. Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials. 30 (30), 5910-5917 (2009).
  16. Tan, Y., et al. 3D printing facilitated scaffold-free tissue unit fabrication. Biofabrication. 6 (2), 1-11 (2014).
  17. Dean, D. M., Napolitano, A. P., Youssef, J., Morgan, J. R. Rods, tori, and honeycombs: the directed self-assembly of microtissues with prescribed microscale geometries. The FASEB Journal. 21 (14), 4005-4012 (2007).
  18. Gwyther, T. A., Hu, J. Z., Billiar, K. L., Rolle, M. W. Directed cellular self-assembly to fabricate cell-derived tissue rings for biomechanical analysis and tissue engineering. J Vis Exp. (57), e3366 (2011).
  19. Zhu, W., et al. 3D printing of functional biomaterials for tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 40, 103-112 (2016).
  20. Jakab, K., et al. Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells. Biofabrication. 2 (2), 022001 (2010).
  21. Lemire, J. M., Potter-Perigo, S., Hall, K. L., Wight, T. N., Schwartz, S. M. Distinct Rat Aortic Smooth Muscle Cells Differ in Versican/PG-M Expression. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 16 (6), 821-829 (1996).
  22. Strobel, H. A., et al. Cellular self-assembly with microsphere incorporation for growth factor delivery within engineered vascular tissue rings. Tissue Eng Part A. 23 (3-4), 143-155 (2017).
  23. Strobel, H. A., Calamari, E. L., Beliveau, A., Jain, A., Rolle, M. W. Fabrication and characterization of electrospun polycaprolactone and gelatin composite cuffs for tissue engineered blood vessels. JBMR Part B. , In Press (2017).
  24. Napolitano, A. P., Chai, P., Dean, D. M., Morgan, J. R. Dynamics of the self-assembly of complex cellular aggregates on micromolded nonadhesive hydrogels. Tissue Eng. 13 (8), 2087-2094 (2007).
  25. Gwyther, T. Engineered Vascular Tissue Generated by Cellular Self-Assembly. , Worcester Polytechnic Institute. (2012).

Tags

בביו-הנדסה בעיה 134 הדפסת תלת-ממד רקמות עצמית התאספו הנדסת רקמות עילאיים agarose עובש מותאם אישית הנדסת רקמות
ייצור של בארות Agarose מותאם אישית עבור תא זריעה וטבעת רקמות הרכבה עצמית תוך שימוש בתבניות מודפס 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Strobel, H. A., Calamari, E. L.,… More

Strobel, H. A., Calamari, E. L., Alphonse, B., Hookway, T. A., Rolle, M. W. Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds. J. Vis. Exp. (134), e56618, doi:10.3791/56618 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter