Summary
כאן, אנו מציגים עבור בידוד של טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC) פרוטוקול. ניתן להשתמש ARVC מבודד לטיפוח לטווח הקצר ולטווח הארוך. בידוד של טיפוח של ARVC יכול לשחק תפקיד מפתח בפיתוח משטרי הטיפול החדש למחלות לב.
Abstract
בלב שלם, תאים סמוכים להשפיע cardiomyocytes למבוגרים. השיטה של בידוד, טיפוח של cardiomyocytes למבוגרים, חקירה מדויקת של אופן הפעולה של תאים אלה תחת טיפולים ספציפיים וסביבות אפשרי. כתב יד זה מציג פרוטוקול הבידוד מוצלח, טיפוח של עכברים בוגרים חדרית cardiomyocytes (ARVC).
העכברוש מוקרבת על ידי נקע בצוואר הרחם תחת הרדמה עמוקה. לאחר מכן, מופק הלב, העורקים הוא חשף. לאחר מכן, מתבצע זלוף במערכת זלוף Langendorff עם סידן דלדול וטיפול collagenase. לאחר מכן, רקמות חדרית מקבל כתוש, שהופץ מחדש, מסוננים, ואחריו שלושה צעדים צנטריפוגה עם תוספת הדרגתית של CaCl2 עד הריכוז פיזיולוגי סידן. ARVC הם מצופה על מנות התרבות תאים. לאחר רענון המדיום התרבות תאים, ARVC יכול להיות מעובד עד שישה ימים מבלי לשנות את המדיום תרבות סרום המכיל. בידוד של ARVC הוא תהליך רגיש סידן. שינויים קטנים בריכוז הסידן תאיים לגרום לירידה האיכות ואת הכדאיות של תאים מבודדים.
טרי מבודד ARVC הם מוט בצורת. בתוך הימים הראשונים של טיפוח-תרגול הוא מפסיד את מוט בצורת טופס ומורפולוגיה pseudopodia מבנים דמויי (התפשטות). במהלך המשקע מורפולוגי ARVC לבזות בתחילה שלהם אלמנטים כויץ ואחריו של הרפורמציה דרך סיבי אקטין מתח, sarcomerogenesis de novo . אחרי שבוע אחד של טיפוח-תרגול, רוב ARVC הצג מראה נפוץ עם striation קרוס לזיהוי בבירור. תהליך זה הוא רגיש ריכוז הסידן תאיים, בזמן הטיפול עם ionomycin נחלש מתפשטת. סמני מפתח בתהליך של דה - ו מחדש - differentiation הם שרשרת כבדה β-צולבות הקישור חוטים שרירן (β-MHC), oncostatin M (OSM) ו- swiprosin-1 (EFHD2). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הלב differentiation re ביטול המתרחשים בתנאים תרבות מחקה תכונות ראית ויוו במהלך שיפוץ לב. לכן, בידוד, טיפוח של ARVC לשחק תפקיד מפתח להבנת הביולוגיה של cardiomyocytes.
Introduction
Cardiomyocytes למבוגרים ויוו לעבוד syncytium חשמלי המבוסס על תאים תאים מגעים בין נייטרלים. בנוסף, הם מושפעים תאים סמוכים כמו fibroblasts לב, תאי אנדותל, נוירונים תאים דלקתיים1. על מנת ללמוד את היכולת של cardiomyocytes להתאים לארגון תאיים שלהם ששונו תנאי עומס, כפי שניתן לראות במהלך היפרטרופיה, מה צעד ראשוני שמוביל אי ספיקת לב, בידוד, טיפוח של עכברוש חדרית למבוגרים cardiomyocytes (ARVC) הוא הכרחי2,3,4. מבחינה היסטורית, cardiomyocytes קודם הם בודדו אותנו מהמתרחש עובריים חומוס לבבות5,6. כמה שנים מאוחר יותר, הבידוד הראשון של cardiomyocytes סופני הבדיל תוארה על-ידי שימוש סידן דלדול7. אולם, cardiomyocytes למבוגרים אלה לא היו סידן סובלנית, ולכן לא ניתן להשתמש עבור מבחני פונקציונלי. לבסוף, בשנת 1976 פרוטוקול חדש זמין פאוול ולסובב לחקור cardiomyocytes חדרית מבוגר מתחת בתנאים פיזיולוגיים8. כצעד ראשון, הם בודדו cardiomyocytes מבוגר מתחת ריכוזי סידן נמוך וסידן מוגבר לאחר מכן פיזיולוגיים ריכוזי בשגרה stepwise. כיום, ברוב הפרוטוקולים עבור בידוד וטיפוח של cardiomyocytes למבוגרים לעבוד עם פרוטוקול זה סידן, להשתמש collagenase עיכול אנזימטי של אנשי קשר תא עבות-תא1.
לטיפוח מוצלחת, נדרש סרום עגל עוברית (FCS) או oncostatin מ' (OSM). ARVC לבצע של דה - ו מחדש - differentiation בשינויים מבניים מקיף כולל סרקומר פירוק ועל הרפורמציה9,10,11,12. תהליך זה מלווה ביטוי מחדש של גנים מסוג עוברית, כמו שרשרת כבדה β-צולבות הקישור חוטים שרירן (β-MHC), כפי הידוע מן היפרטרופיה, היווצרות של מבנים דמויי-pseudopodia, הנקרא גם מריחה4,11, 13. יתר על כן, swiprosin-1 (EFHD2), שזוהה חלבון, משחק תפקיד מרכזי בתהליך של בידול מחדש ARVC מעובדים11. כתוצאה מכך, ARVC בתרבות להפוך תאים נרחבת, רב שלבית, אשר באופן ספונטני להראות התכווצויות לאחר שבועיים עד שלושה שבועות תרבות2,4,14.
לאחרונה חשפו כי הלב differentiation re ביטול עם התרחשותה בתנאים תרבות מחקה כולל ראית ויוו במהלך לב שיפוצים10,15. שיפוץ לב הוא תהליך מפתח במהלך מחלות לב16. כמו מחלות לב הם עדיין הגורם העיקרי למוות בחברות תעשיתיות, הבנה טובה יותר של הביולוגיה של cardiomyocytes הבוגרים חשוב (מי; 2015). בידוד טיפוח של ARVC יוכלו לסייע לפתח אסטרטגיות חדשות, תרופות לטיפול במחלות לב. עם כתב היד הזה, מסופק עבור בידוד של טיפוח של ARVC פרוטוקול. יתר על כן, כמה חלקים קריטיים של שיטה זו מסומנים במקטע דיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
החקירה התנהלה על פי המדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה שפרסם את בנו המכון הלאומי לבריאות (NIH פרסום מס ' 85-23, תוקן 1996). באופן כללי, חולדות wistar גברים בגילאי 3-4 חודשים, במשקל ממוצע של 250-350 גר' משמשים עבור פרוטוקול זה. לב עכברוש אחד מספיקה עבור 20 מנות התרבות (1 מ"ל לכל מאכל; הקוטר הפנימי: 35 מ מ) עם צפיפות תאים משוער של 1.5 x 10 4 תאים/1000 מ מ 2-
1. הכנה של מדיה, ריאגנטים
- בינוני קריאטין-קרניטין-טאורין (CCT בינוני)
הערה: CCT בינוני הוא מדיום מורכבות בהתבסס על בינוני 199 עם התוספת של קריאטין, קרניטין, טאורין.- L להכין 1 בינוני 199: להוסיף 3.6 g Hepes ומיקס לשעה. לאחר מכן להוסיף מ"ג 655.5 קריאטין (5 מ מ), 395.4 mg קרניטין (2 מ מ) ו- 625.5 mg טאורין (5 מ מ). קרניטין טאורין שינוי ה-pH ל < 7. על מנת לעכב את הצמיחה של תאים מזהמים, למשל תאי אנדותל או fibroblasts, להוסיף 10 מיקרומטר ציטוזין β-D-arabinofuranoside המדיום. להתאים את ה-pH עם NaOH (2 מ מ) למסנן 7.4 וסטרילי המדיום. לאחסן המדיום CCT ב-4 מעלות צלזיוס
- פאוול בינוני
- בינוני 1 L פאוול, להמיס 6.43 g NaCl (110 מ"מ) עם 0.19 גרם אשלגן כלורי (2.5 מ מ), 0.16 g ח' 2 PO 4 (1.2 מ מ), 0.3 g MgSO 4 7 שעות 2 O (1.2 מ מ), 5.96 g Hepes (25 מ מ), ו- 1.98 g D (+ )-גלוקוז monohydrate (10 מ מ) ב- Aqua סטרילי. להתאים את ה-pH עם NaOH (ז 2) למסנן 7.4 וסטרילי המדיום. חנות בינונית פאוול ב-4 מעלות צלזיוס
- סידן כלורי (2 CaCl)
- להכין פתרון 100 מ מ CaCl 2 (50 מ"ל) ולהכין aliquots המכיל 500 µL CaCl 2. להקפיא aliquots ב-20 מעלות צלזיוס
- הכנה של תרבות בינוני
- להכין שלוש תא תרבות מדיומים: מראש ציפוי בינוני ציפוי בינוני, בינוני כביסה. השתמש CCT בינוני כבסיס עבור כל שלושה מדיומים (טבלה 1). לחשב CCT בינוני עם 1 מ"ל לכל מאכל תרבות. לכן, להתכונן 20 מ"ל CCT בינוני 20 מנות תרבות (הקוטר הפנימי: 35 מ מ)-
- תא תרבות צלחות: מעיל שהלוח התרבות התא (הקוטר הפנימי: 35 מ מ) עם 1 מ"ל מראש ציפוי בינוני. חנות את הלוחיות מצופה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה או כבר לפחות שעתיים לפני השימוש.
2. בידוד של Cardiomyocytes למבוגרים
- מערכת זלוף הכנה של Langendorff
- תרמי יופיצ בינונית, כביסה בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס Defreeze שפופרת של 500 µL CaCl 2, שוקלים 25 מ ג של collagenase.
- מיושרות מערכת זלוף Langendorff עם אקווה סטרילי, לאחר מכן תן בינוני פאוול הפיצו את המערכת עבור 5 דק.
- למלא את המערכת זלוף Langendorff 80 מ ל פאוול בינונית ללא כל האוויר בועות גז המדיום עם 95% חמצן.
- להכין צינור (50 מ"ל) עם 40 מ"ל פאוול בינונית מחממים אותו ל- 37 ° C, גז זה עם 95% חמצן.
- להתכונן חוט של בערך 25 ס מ אורך הצמדת בלב מוסרים הצינורית.
- Degrease סכין גילוח עם אלכוהול (70% לפי נפח) ותחברי אותו למסוק. מלחציים דיסק מפלסטיק לתוך המסוק.
- החילוץ של הלב
- עזים ומתנגד חולדה זכר wistar עם 4-5% איזופלוריין, להקריב אותו עם נקע בצוואר הרחם. לפתוח את הבטן מאחורי הקשת costal עם הטיה הבטן, עם אותו זוג מספריים, לחתוך דרך הסרעפת כדי לפתוח את חלל בית החזה.
- להסיר את הלב, יחד עם ריאות של בלוטת התימוס, על ידי חיתוך מעל בלוטת התימוס הגולגולת מאוד בחלל בית החזה. להעביר את החומר תמיסת כקרח מיד.
- להסיר את הריאות ואת בלוטת התימוס מהלב עם מספריים ויבתר (גדול) ולהעביר על ידי קיבעון החומר עם מלקחיים קפסולה, לאחרון פתרון מלוחים חדש.
- בידוד
- להסיר עודפי רקמת, כמו שאריות של בלוטת התימוס, קנה הנשימה, שומן, רקמת חיבור מהלב באמצעות מלקחיים קפסולה מספריים ויבתר (גדול או קטן). לחשוף את העורקים ולסיים עם מספריים ויבתר (גדול או קטן) בין אדריכל הראשון ואת השני branchial
- מתחיל טפטוף של מערכת זלוף Langendorff. מקום בלב-הצינורית של מערכת זלוף Langendorff, שמלמדות את זה קודם. עם מלחציים תנין ומאוחר יותר עם החוט מוכן. לשטוף את הלב עד שיתפנה דם.
- לפזר 25 מ ג Collagenase במדיום פאוול חמים 5-6 מ"ל ולהוסיף 12.5 µL CaCl 2 (30 מיקרומטר).
- לסגור את זרימת הדם על ידי הזזת משפך זכוכית, אשר מחובר עם מערכת זלוף Langendorff, על לבו טפטוף ולהוסיף collagenase פתור את המערכת זלוף. נתחיל את זלוף במשך 25 דקות מהירות ירידה של טיפה 1 לשניה.
הערה: במהלך זלוף, הלב להתנפח ולקבל מראה שעווה. - לעצור את זלוף לאחר 25 דקות ולהסיר את הלב מתוך מערכת זלוף Langendorff. הסר את העורקים אטריה, רקמת חיבור מהלב ולפתוח החדרים ימינה ושמאלה.
- חותך את הלב פעמיים בזווית של 90 מעלות (רוחב החיתוך: 0.7 מ"מ; מהירות: 0.15 ס"מ/s). חזור על תהליך זה באופן ידני עם אזמלים שני 10 s בכל צד.
- להעביר 12 מ של המדיום זלוף לתוך צינור חדש (50 מ"ל). שופכים את slurry תא לתוך תאים זה בינוני ותקציר לעוד 5 דקות ב 37 ° C. לערבב הפתרון בכל דקה.
- לסנן את הפתרון עם הלב מתעכל דרך רשת ניילון (200 מיקרומטר) לתוך צינור חדש (50 מ"ל).
- Centrifuge הפתרון המסוננות ב 29 g x עבור 3 מינימלית להשליך את תגובת שיקוע והוסף בינוני פאוול חמים 6 מ ל כולל 12.5 µL CaCl 2 (250 מיקרומטר) כדי בגדר התא. Resuspend בגדר באמצעות תנועות חזק חלקה. צנטריפוגה שוב ב 29 g x עבור 2 דק. להשליך תגובת שיקוע והוסף חמים 6 מ"ל פאוול בינוני שהוחלפו עם 25 µL CaCl 2 (500 מיקרומטר). להמיס בגדר תא דרך בתנועות עדינות חזק ומוסיפים 12 mL חמים פאוול בינונית הכוללת 120 µL CaCl 2 (1 מ"מ). צנטריפוגה בפעם השלישית ב 16 x g עבור 1 דקות. שוב, להסיר את תגובת שיקוע.
- לערבב בגדר תא עם המדיום ציפוי מראש ומחוממת.
- הסר בינוני ציפוי מראש צלחות תרבות. העברת 1 מ"ל ציפוי בינוני, כולל את cardiomyocytes מבודדים, כל צלחת תרבות. דגירה cardiomyocytes מבודד טריים ב 37 ° C עבור ה 1
- להסיר המדיום ציפוי לוחות תרבות. להוסיף 1 מ"ל שטיפה בינוניים עד שהלוח תרבות, לאחסן את הצלחות ב 37 ° C עד שישה ימים מבלי לשנות את המדיום.
- עבור חוקרים את השפעת כימיקלים שונים וטיפולים -ARVC, תחילה רענן בינוני ציפוי על-ידי שטיפת בינוני, לאחר מכן הוספת כימיקלים שונים.
הערה: הערכה עם מיקרוסקופ אור: עם כל הכנה תא, 150 ל-300 cardiomyocytes צריך לפקח ליום על ידי מיקרוסקופ אור. לסעף cardiomyocytes שנספר הכל לקבוצות על פי המראה שלהם (למשל, " מוט בצורת ", " סיבוב למטה ", " מתפשט ", ו " מראה יוצא דופן "). הקטגוריה " הפצת " כולל כל cardiomyocytes עם מבנים דמויי-pseudopodia. " מראה יוצא דופן " כולל כל ARVC עם משטח לא סדיר אין קרום התא שלם לזיהוי.
3. דוגמה ניסויים
- זריחה/Immunofluorescence כתמים cardiomyocytes למבוגרים
- ניתוח מורפולוגי ומבניים המרות של ARVC במהלך הטיפוח-תרגול על ידי מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. להשתמש Phalloidin-TRITC כדי לחקור מבנים F-אקטין " מוט בצורת ", " סיבוב למטה ", ו " הפצת " ARVC. לבצע צביעת לפי היצרן ' פרוטוקול s. דוגמא אישית Phalloidin-TRITC מכתים ניתנת בהפניה Nippert. et al. 11. עם זריחה/immunofluorescence מכתים, הבדלים ב דה - ו מחדש - differentiation של המנגנון כויץ ב cardiomyocytes למבוגרים מטופח בין ניסיוני טיפולים (למשל, עם Swiprosin-1, ionomycin) יכול ייחקרו.
- בזמן אמת כמותיים RT-PCR (לרביעיית-PCR)
- לבצע לרביעיית-PCR לחקור שינויים בביטוי ה-mRNA של גנים שונים (למשל, OSM, Swiprosin-1, β-MHC) במהלך הטיפוח-תרגול של ARVC. עבור גודל המדגם מספיק, השתמש מנות תרבות גדול (קוטר פנימי: 60 מ מ) עם 2 מ"ל נפח. ARVC של חמש מנות תרבות התשואות דוגמא אחת. לבצע בידוד של mRNA וטרנספורמציה של cDNA לפי היצרן ' פרוטוקול s.
- Immunoblot טכניקות
- לבצע לחומה המערבית לחקור שינויים בביטוי חלבונים (למשל, עבור Swiprosin-1) במהלך הטיפוח-תרגול של ARVC. השתמש צלחת תרבות אחת (1 מ"ל) עבור דגימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cardiomyocytes למבוגרים בתרבות: איור 1 מציג סקירה של טרי מבודד למבוגרים cardiomyocytes 2 h לאחר השטיפה האחרונה. כ- 75% של כל cardiomyocytes היה מורפולוגיה של מוט בצורת. 25% הנותרים הראה מראה יוצא דופן מורפולוגיה עגול, אין לזיהוי ללא פגע קרום התא (איור 1). בסוף הטיפוח (יום 6), עד 15% של כל cardiomyocytes הראה המריחה, כ 10% זנוחות מורפולוגיה עגולה ללא מבנים דמויי-pseudopodia, והציג 75% cardiomyocytes כל הופעה יוצאת דופן של השטח לא סדיר וללא לזיהוי ללא פגע קרום התא (נתונים לא מוצג).
איור 1: סקירה של עכברוש טרי מבודד cardiomyocytes. השבר של cardiomyocytes טרי מבודד אשר הראו מורפולוגיה של מוט בצורת הסתכם בכ-75% cardiomyocytes, בממוצע. 25% הנותרים של תאים הציגה מראה יוצא דופן עם משטח סדיר, אין קרום התא לזיהוי ללא פגע. הקלטה נערך על ידי מיקרוסקופ אור שעתיים לאחר נטילת cardiomyocytes טרי מבודד. מיקרוסקופ אור 2 X הגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
עם מיקרוסקופ אור, טרי מבודד ARVC הופיע מוט בצורת בסביבות 100 מיקרומטר בגודלם (איור 2 א). טרי מבודד ARVC החוזה באופן ספונטני היו לא סובלנית סידן. כל התאים שהיו סביב, ללא קרום התא שלם לזיהוי היו פגומים ולא בת קיימא (איור 2 א-ב). בימים שלאחר מכן, רוב המוט בצורת ARVC איבד את המורפולוגיה. תאים יש מעוגל עם קרום התא לזיהוי ללא פגע. אלה ARVC היו קיימא. החל מ- היום השלישי התאים האחרונים הקימו מבנים דמויי-pseudopodia. חלק ARVC אלה שמר מראה מעוגל שלהם במהלך הפצת (איור 2B). אחרים שהוסב לדירה, ARVC רב-צורתיות (איור 2B).
איור 2: מבודד cardiomyocytes עכברוש. (א) ARVC טרי מבודד היו בדרך כלל מוט בצורת. (B) לאחר שישה ימים בתרבות, מבנים דמויי-pseudopodia (הפצת) היו בבירור לזיהוי ב- ARVC מעוגל עכשיו. כמה ARVC השתנתה לחלוטין מורפולוגיה נרחבת. ARVC עם מראה יוצא דופן מוצג על משטח לא סדיר, אין קרום התא לזיהוי ללא פגע. מיקרוסקופ אור 10 X הגדלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טרי מבודד ARVC היו בדרך כלל מוט בצורת עם striation קרוס בבירור (איור 3, יום 0). שינויים תא מורפולוגיה נצפו במהלך הימים הבאים בתרבות. ראשית, ARVC איבד כל הרכיבים כויץ שלהם (איור 3, בימים 1 ו- 2). זאת בעקבות של הרפורמציה, שמערבות sarcomerogenesis de novo . הרפורמציה קדמו את היווצרות מבנים דמויי-pseudopodia (המריחה, איור 3ימים 3-6). Sarcomerogenesis דה נובו התחיל עם הופעתו של אקטין סיבי סטרס (איור 3, ביום השלישי). בנוסף, חבילות אקטין הופיעו באזור perinuclear ויצרו לאחרונה התאספו sarcomeres (איור 3, 4 ימים ו- 5). האחרון גדל לאורך סיבי אקטין preformed מתח אל הפריפריה (איור 3, יום 6). בסוף תקופת טיפוח (יום 6a), striation קרוס טיפוסי של sarcomeres שהורכב בכפולה ARVC נצפתה.
איור 3: זריחה מכתים. דה - ו מחדש - differentiation של ARVC בתרבות עם 20% FCS מוצג. טרי מבודד ARVC בצורת מוט אופייני שלהם (יום 0) הפך עגול על ידי משפילים sarcomeres במהלך הימים הראשונים של תרבות (יום 1). הם איבדו כל שלהם כויץ הרכיבים (יום 2) ואחריו היווצרות מבנים דמויי-pseudopodia (הפצת; ימים 3-5), הרפורמציה עוקבות של שלהם אלמנטים כויץ המציין sarcomerogenesis דה נובו (יום 6). היום השישי בתרבות, קרוס striation היה ברור לזיהוי שוב (יום 6a). צביעת עם Phalloidin-TRITC לפי הפרוטוקול של היצרן; "חיצים": מבנים דמויי-pseudopodia (למשל המוצג); *: אקטין חבילות באזור perinuclear (למופת המוצגים). חלקים של דמות זו יוצאים לאור11- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 מציג את קינטי של תהליך מתפשטת במהלך הטיפוח-תרגול. השבר של ARVC מציג מבנים דמויי-pseudopodia בכל מועד הבדיקה ניתנת כמו הפצת % (איור 4). הפצת התחיל סביב היום השלישי, גדל ללא הרף במהלך הטיפוח-תרגול. 14.7% ± 1.39% של כל ARVC שנספרו הראה pseudopodia-מבני לאחר שישה ימים בטיפוח-תרגול.
איור 4: התפשטות גידול קינטית cardiomyocytes עם pseudopodia-מבני מנורמל כדי כל cardiomyocytes שנספרו (הפצת %) במשך שישה ימים של זמן טיפוח (n = 33 תא ההכנות). הנתונים מוצגים כפי שאומר ± ב- SEM... איור זה מתפרסם ב-11. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
השפעת ionomycin על הפצת ARVC: בידוד של טיפוח של ARVC הוא סידן תהליך רגיש1,8. טיפול ARVC עם ionomycin (1 מיקרומטר), אשר מגביר ריכוז הסידן תאיים, נגרמת ירידה משמעותית (p ≤0.01) על היווצרות מבנים דמויי-pseudopodia לעומת שולט (איור 5). בהשוואה ישירות, ± 17.19% 2.45% של כל ARVC שנספרו הראה הפצת בתנאים שליטה אבל היחידה 9.87% ± 2.77% של כל ARVC שנספרו יצרו מבנים דמויי-pseudopodia בנוכחות ionomycin (יום 6 הטיפוח). לפיכך, ionomycin מופחת מתפשטת ב- 42.58%.
= "jove_content" fo:keep-together.within-דף = "1" >
איור 5: הפצת קינטיקה תחת טיפול עם ionomycin. הטיפול עם ionomycin (1 מיקרומטר) ביום 0 גרם לירידה משמעותית ביותר בתא הפצת לעומת שליטה. הנתונים מוצגים כפי שאומר ± SEM; n = 4 תא ההכנות; מבחן מאן-ויטני-U; * p ≤0.05; * * p ≤0.01 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
בנוסף, ionomycin גדל אחוז ARVC עם מראה יוצא דופן לעומת תנאי הבקרה (איור 6). יום 6, 71.11% ± 4.65% מכל נספרים ARVC שטופלו ionomycin הראה נוכחות יוצאת דופן. עם זאת, בתנאים שליטה, היחידה 51.35% ± 3.55% ARVC היו מסווגים בקבוצה זו.
איור 6: ARVC עם מראה לא בריא. הטיפול עם ionomycin (1 מיקרומטר) ביום 0 גרם לגידול משמעותי במספר ARVC, אשר הראו מראה יוצא דופן. יום 6, ההבדל בין שליטה ARVC שטופלו ionomycin היה משמעותי. הנתונים מוצגים כפי שאומר ± SEM; n = 4 תא ההכנות; מבחן מאן-ויטני-U; * p ≤0.05 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
יום 3 של טיפוח-תרגול, תחת הטיפול עם ionomycin, לרביעיית-PCR חשף ירידה בביטוי ה-mRNA של β-MHC (p ≤0.01) ו OSM, אשר שניהם לשחק תפקיד מובהק הבידול והתבקשתי של ARVC (איור 7 א ו ג). Swiprosin-1, סמן מחדש הבידול של ARVC באופן משמעותי downregulated, גם היה, (איור 7 ב).
איור 7: דה - ו מחדש - differentiation של ARVC מעובדות תחת טיפול עם ionomycin
(1 מיקרומטר) ב יום 0 גרם של mRNA ירידה בביטוי של oncostatin מ' (OSM) ו β-MHC, אשר הן לשחק בתפקידי מפתח הבידול והתבקשתי של cardiomyocytes למבוגרים. בנוסף, ביטוי mRNA של Swiprosin-1, שחקן מפתח הבידול מחדש של cardiomyocytes למבוגרים, היה גם ירד על ידי טיפול ionomycin. ביום השלישי של טיפוח-תרגול; הנתונים מוצגים כפי שאומר ± SEM; n = 30 צלחות התרבות תאים לכל קבוצה; מבחן מאן-ויטני-U; * p ≤0.05; * * p ≤0.01 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מראש ציפוי בינוני |
| 20 מ ל CCT בינוני |
| 2% כרך פניצילין/סטרפטומיצין (400 μL) |
| כרך 4% FCS (800 μL) |
| ציפוי בינוני |
| 20 מ ל CCT בינוני |
| 2% כרך פניצילין/סטרפטומיצין (400 μL) |
| כביסה בינוני |
| 20 מ ל CCT בינוני |
| 2% כרך פניצילין/סטרפטומיצין (400 μL) |
| הערה: FCS כרך 4% מראש ציפוי בינוני יכול להיות מוחלף על ידי Vol.-% 1 laminin (0.5 μg/cm2). בנוסף, לטפח את cardiomyocytes במשך מספר ימים להוסיף 20 Vol.-% FCS למדיום כביסה. לאחסן ציפוי בינוני בינוני כביסה מאת 4-8 ° C עד השימוש. |
טבלה 1: תרבות המדיה המשמש לבידוד cardiomyocyte
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההתנהגות של cardiomyocytes למבוגרים ויוו מושפע על ידי אינטראקציות רבות עם תאים אחרים (למשל, נוירונים, תאי אנדותל, fibroblasts, תאים דלקתיים), את syncytium חשמל אשר הם יוצרים1. לכן, לימוד מתח עיבוד של cardiomyocytes למבוגרים באופן בלעדי דורש את הבידוד טיפוח של ARVC. ההשפעות העיקריות של בידוד ושל טיפוח ARVC הן: 1) ניתוקם מן מטריצה חוץ-תאית ואנשי תא-תא; 2) ניתוקם מן גירויים כויץ; 3) מכריח אותם להסתגל מ טישו תלת מימדי הסביבה. בתנאים אלה ARVC differentiation דה מחדש כמתואר לעיל ומתחילים לבצע עיבודים מרובים, אשר נראים גם במהלך לב שיפוצים ויוו (β-adrenoceptor הקהיה, ההרכבה מחדש של sarcomeres, וכו ') 4. לפיכך, בידודו של cardiomyocytes למבוגרים מייצג שיטה חוקית לחקור תאים אלה והתגובה שלהם לטיפולים שונים. תובנות אלו יכול לשמש לאחר מכן לניסויים ויוו , אשר יסייע הימנעות ניסויים מיותרים והפחתת מספר מבעלי החיים. . כמובן, כמה ממצאים ראיתי במבחנה לא יתרחש ויוו (למשל, הקמת מבנים דמויי-pseudopodia). התא-התא-אנשי קשר קיימים בתוך syncytium חשמל ה"בלתי צמיחה מוגברת תחת התנאים הפיזיולוגיים17. ובכל זאת, מעובדים מבודדים ARVC יכול לשמש כדי לחקור את אופן הפעולה של cardiomyocytes למבוגרים. בנוסף, ניסויים הראשון של אסטרטגיות טיפול חדשות נגד מחלות לב אצל בני אדם יכול להתבצע עם ARVC.
השיטה המתוארת על בידוד ועל טיפוח של cardiomyocytes למבוגרים מכיל כמה נקודות קריטיות. כדי להשיג תוצאות מוצלחות, הפריטים הבאים צריך להיחשב.
1. סובלנות סידן: מבחינה היסטורית, רגישות סידן cardiomyocytes למבוגרים היה אחד הגורמים הקריטיים ביותר המוביל הבידוד מוצלח לגידול cardiomyocytes למבוגרים1,7, 8. כיום, פרוטוקולים הוקם כדי להבטיח טיפוח תחת סידן פיזיולוגיים תנאים1,3. כתב יד זה מראה את השפעת ריכוז הסידן תאיים שהשתנו על איכות ARVC מבודד. Ionomycin, אשר מגביר את ריכוזי סידן תאיים, נגרמת ירידה משמעותית בהפצת, עלייה משמעותית במספר cardiomyocytes עם מראה יוצא דופן. יתר על כן, זה גרם downregulation מפתח סמנים עבור הלב דה - ו מחדש - differentiation: β-MHC OSM, Swiprosin-1. לכן, שינוי ריכוז הסידן תאיים במהלך הטיפוח-תרגול הסלים את היכולת של ARVC להסתגל לסביבות חדשות. למרות כמה ARVC הצליחו להפיץ ולהתאים (9.87% ± 2.77% של כל ARVC שנספרו; איור 5), חקירה מדויקת של ARVC בתנאים אלה אינה אפשרית. כתוצאה מכך, בידוד מדויק, טיפוח של ARVC פרוטוקול סידן הוקמה אמור לשמש. בנוסף, כדאי להבטיח כי אף אחד הטיפולים ובדוקים להפריע hemostasis סידן של ARVC.
2-collagenase: יש קבוצות שונות של collagenase זמינים. כל אצווה מראה הבדלי האיכות והיעילות1. לכן, המחברים ממליצים להזמין בדיקות מדגמיות של קבוצות שונות. בנוסף, הזמן של מערכת העיכול ואת מידת collagenase של כל אצווה חדשה להשתמש לצרכים להערכה בנפרד. בהתאם לכך, הריכוז ואת הזמן של עיכול בפרוטוקול המתוארים יכולים להיות שונים במקצת על פרוטוקולים אחרים.
3- עד לב זלוף: כדי להבטיח רמה גבוהה של ARVC, הזמן בין חילוץ בלב את הגוף ואת תחילת זלוף עם מערכת Langendorff צריך להיות קצר ככל האפשר. זמן ממושך גורם נזק ללב ותוצאות מספר גבוה יותר של ARVC כלכלית.
בנוסף, התחממות כדור הארץ הפתרון זלוף במהלך זלוף, מערכת העיכול במשך 5 דקות לאחר קיצוץ הרקמה חיוני מניב תוצאה טובה. כדי למנוע פגיעה מיותרת של רקמה ביולוגית, זה צריך להיות מטופל בקפידה בנקודות בכל הזמנים. יתר על כן, זה צריך להבהיר את הטיפול עם OSM או ריכוז נמוך יותר של FCS גם לאפשר ARVC differentiate דה מחדש4,10,18,19. עם זאת, ללא הטיפולים התזונתי, ARVC מנוונת בתוך ימים מספר2.
לסיכום, בידוד של טיפוח של ARVC היא שיטה רגישה המציעה מגוון רחב של אפשרויות כדי לחקור את אופן הפעולה של cardiomyocytes למבוגרים באופן בלעדי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
התוצאות המוצגות הן חלק עבודת הדוקטורט של פרנציסקה Nippert.
Acknowledgments
המחברים תודה נדין Woitasky, פיטר וולק לקבלת סיוע טכני. בנוסף, המחברים מודים גב' קלאודיה לורנץ (הסופר רפואי, ACCEDIS) על עזרתה בהכנת כתב היד. כתב יד זה היה בתמיכתם מאת DFG (Schlu 324/7-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
- Schlüter, K. -D. Cardiomyocytes - Active Players in Cardiac Disease. , Springer International Publishing AG Switzerland. (2016).
- Piper, H. M., Probst, I., Schwartz, P., Hutter, F. J., Spieckermann, P. G. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Schlüter, K. -D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Protein Tyrosine Kinases: From Inhibitors to Useful Drugs. Fabbro, D., McCormick, F. 290, Humana Press Inc. Totowa, NJ. 305-314 (2005).
- Eppenberger, M. E., et al. Immunocytochemical analysis of the regeneration of myofibrils in long-term cultures of adult cardiomyocytes of the rat. Dev. Biol. 130 (1), 1-15 (1988).
- Burrows, M. T. The cultivation of tissues of the chick-embryo outside the body. JAMA. 55 (24), 2057-2058 (1910).
- Cavanaugh, M. W. Pulsation, migration and division in dissociated chick embryo heart cells in vitro. J Exp Zool A Eco Genet Physiol. 128 (3), 573-589 (1955).
- Muir, A. R. Further observation on the cellular structure of cardiac muscle. J. Anat. 99, 27-46 (1965).
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochem. Biophys. Res. Com. 72 (1), 327-333 (1976).
- Schwarzfeld, T. Isolation and development in cell culture of myocardial cells of the adult rat. J. Mol. Cell. Cardiol. 13 (6), 563-575 (1981).
- Kubin, T., et al. Oncostatin M is a major mediator of cardiomyocyte dedifferentiation and remodeling. Cell Stem Cell. 9 (5), 420-432 (2011).
- Nippert, F., Schreckenberg, R., Hess, A., Weber, M., Schlüter, K. -D. The effects of Swiprosin-1 on the formation of pseudopodia-like structures and β-adrenoceptor coupling in cultured adult rat ventricular cardiomyocytes. PLoS ONE. 11 (12), e0167655 (2016).
- Moses, R. L., Claycomb, W. C. Disorganization and reestablishment of cardiac muscle cell ultrastructure in cultured adult rat ventricular muscle cells. J. Ultrastruct. Res. 81 (3), 358-374 (1982).
- Eppenberger-Eberhardt, M., Flamme, I., Kurer, V., Eppenberger, H. M. Reexpression of α-smooth muscle actin isoform in cultured adult rat cardiomyocytes. Dev. Biol. 139 (2), 269-278 (1990).
- Fedak, P. W., Verma, S., Weisel, R. D., Skrtic, M., Li, R. K. Cardiac remodeling and failure: from molecules to man (Part III). Cardiovasc. Pathol. 14 (3), 109-119 (2005).
- Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P.
- Cohn, J. N., Ferrari, R., Sharpe, N. Cardiac remodeling-concepts and clinical implications: A consensus paper from an international forum on cardiac remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 35 (3), 569-582 (2000).
- Alberts, B., et al. Molecular biology of the cell. , Garland Science Taylor and Francis Group. New York, NY. (2015).
- Pöling, J., et al. The Janus face of OSM-mediated cardiomyocyte dedifferentiation during cardiac repair and disease. Cell Cycle. 11 (3), 439-445 (2014).
- Decker, M. L., Behnke-Barclay, M., Cook, M. G., Lesch, M., Decker, R. S. Morphometric evaluation of the contractile apparatus in primary cultures of rabbit cardiac myocytes. Circ. Res. 69 (1), 86-94 (1991).
