Summary
ここでは、分離と培養ラット心室心筋細胞 (ARVC) のためのプロトコルを提案する.分離 ARVC は、短期および長期の栽培に使用できます。分離と ARVC の栽培は、心疾患の新しい治療法の開発に重要な役割を再生できます。
Abstract
そのままの心で隣接するセル大人の心筋細胞に影響を与えます。分離法と成人の心筋細胞の培養は、特定の治療法や環境下でこれらの細胞の動作の正確な調査が可能です。この原稿は、ラットの心室心筋細胞 (ARVC) の培養と分離を成功させるためのプロトコルを示します。
頚部転位深麻酔下でラットが犠牲に。中心部を抽出し、大動脈がカバーされていません。その後、蛍光灌流システム カルシウム枯渇とコラゲナーゼ処理の灌流が実行されます。その後、心室の組織を取得しますみじん切り、再循環、フィルター、CaCl2の段階的な追加で 3 つの遠心分離手順に続いて生理カルシウム濃度に到達するまで。ARVC 細胞培養皿にメッキパーツを多数。細胞培養液を更新した後 ARVC できます栽培される 6 日間の血清を含む培養液を変更せず。ARVC の分離は、カルシウム敏感なプロセスです。細胞内カルシウム濃度のわずかな変化は、質と隔離されたセルの実行可能性の減少を引き起こします。
新鮮な分離 ARVC は棒状のものです。栽培の最初の日以内に、彼らは、棒状形態とフォーム偽足のような構造 (拡散) を失います。この形態の形成の間に ARVC は当初改革アクチン繊維の応力およびde novo sarcomerogenesis によって続いて収縮要素を低下します。栽培の 1 週間後は、ほとんど ARVC は明確に検出可能な十字紋と広範な外観を表示します。このプロセスは細胞内カルシウム濃度に敏感イオノマイシンによる治療は拡散減衰です。Β-ミオシン重鎖 (β-MHC)、オンコスタチン M (OSM) swiprosin 1 (EFHD2)、このプロセスでのデ- と再-differentiation キー マーカー。最近の研究はことを心臓改造中に見られる生体機能模倣心臓再脱 differentiation 発生培養条件下で示唆しています。したがって、ARVC の分離と培養心筋細胞の生物学を理解する上で重要な役割を再生します。
Introduction
生体内で大人の心筋細胞間の細胞間接触に基づく電気シンシチウムとして働きます。さらに、心臓線維芽細胞、内皮細胞、神経細胞、炎症細胞1のような隣接する細胞に影響を与えています。心筋細胞の細胞内組織を適応能力を研究するために心臓肥大、心不全、分離ラット心室の栽培が主要な最初のステップみたように負荷条件を変更心筋 (ARVC) は必要な2,3,4です。歴史的には、心筋細胞最初から分離された鶏胚心5,6.数年後、終末分化した心筋細胞の最初の分離は、カルシウム枯渇7を使用して記述されていた。ただし、これらの大人の心筋細胞はカルシウム耐性をなかったし、したがって、機能アッセイには使用できませんでした。最後に、1976 年に新しいプロトコルと有効にパウエル ツイスト生理的条件8下大人の心室心筋細胞を調査します。最初のステップとして彼らは低カルシウム濃度とステップワイズ法で生理学的濃度 ca がその後増加の下で成人の心筋細胞を分離しました。今日、分離と大人の心筋細胞の培養のためのほとんどのプロトコルはこのカルシウム プロトコルで動作し、高密度細胞接触1の酵素の消化力のコラゲナーゼを使用します。
育成に成功した、牛胎児血清 (FCS) またはオンコスタチン M (OSM) が必要です。ARVC 実行、デ- と再-differentiation 筋分解と改革9,10、11,12を含む広汎な構造変更をします。このプロセスは再発現胎児型遺伝子、β-ミオシン重鎖 (β-MHC) のような伴われる拡散4,11、とも呼ばれる、偽足のような構造体の形成と肥大から知られています。13。 さらに、swiprosin-1 (EFHD2)、新たに同定されたタンパク質は栽培 ARVC11の再分化の過程で大きな役割を果たしています。その結果、文化 ARVC 文化2,4,14の 2 〜 3 週間後の収縮を自発的に表示する、広範囲にわたる多セルに変換します。
最近の発見は、心臓再脱 differentiation 模倣文化の条件下で発生すると機能を生体内で見られる心臓改造10,15時に明らかにしました。心筋リモデリングは、心疾患16の間にキーのプロセスです。心疾患は、工業化社会で死の主な原因で、まだ、大人の心筋細胞の生物学の理解を深めることが重要です (人; 2015)。ARVC の分離と培養は新たな戦略と心臓疾患の治療のための薬を開発することができます。この原稿分離 ARVC の耕作のためのプロトコルが提供されます。さらに、このメソッドのいくつかの重要な部分は、ディスカッション セクションでハイライトされます。
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Protocol
ケアと、米国国立衛生研究所 (NIH 文書番号 85-23、1996 の改正) によって公開された実験動物の使用の調査ガイドによると。一般に、雄 wistar ラット 3 〜 4 ヶ月の熟成、250-350 g の平均重量はこのプロトコルに使用されます。1 つのラット心は 20 の培養皿には十分 (皿あたり 1 mL; 内径: 35 mm) おおよそセル密度が 1.5 倍の 10 4 セル/1000 mm 2
。1 です。 メディアの準備および試薬
- クレアチン、カルニチン、タウリン培地 (CCT 中)
注: CCT 媒体中 199 クレアチン、カルニチン、タウリンの添加に基づく複雑な媒体であります。- 準備 1 L 中 199: 3.6 g Hepes と 1 h のミックスを追加します。655.5 mg クレアチン (5 mM)、395.4 mg カルニチン (2 mM)、および 625.5 mg タウリン (5 mM) を追加します。カルニチン、タウリンを変更する pH < 7。汚染細胞、例えば 血管内皮細胞や線維芽細胞の増殖を抑制する、するために培地に 10 μ M シトシン β-D-アラビノを追加します。7.4 と滅菌フィルター媒体に (2 mM) を NaOH で pH を調整します。4 CCT 媒体を保存 ° C
- パウエル媒体
- 1 L パウエル中で溶解する 6.43 g 塩化ナトリウム (110 mM) 0.19 g KCl (2.5 mM)、0.16 g KH 2 PO 4 (1.2 mM)、0.3 g MgSO 4 7 H 2 O (1.2 mM)、5.96 g Hepes (25 mM) と 1.98 g D (+)-アクア滅菌でグルコース一水和物 (10 mM)。7.4 と滅菌フィルター媒体 (2 M) を NaOH で pH を調整します。ストア パウエル培地で 4 ° C
- 塩化カルシウム (CaCl 2)
- 100 mM CaCl 2 ソリューション (50 mL) を準備し、500 μ L CaCl 2 を含む因数を準備します。-20 で因数を凍結 ° C
- 培地の準備
- 準備 3 細胞培養媒体: 中古めっき中、めっき中、洗濯中。すべての 3 つの媒体 (表 1) のための基礎として使用 CCT 媒体。CCT 培地 1 ml の培養皿あたりを計算します。したがって、20 の文化料理 20 mL CCT メディアの準備 (内部の直径: 35 mm).
- 細胞培養プレート: コートの各細胞培養プレート (内径: 35 mm) 前播種培地 1 ml。使用する前にコーティング プレート 37 ° C 一晩、少なくとも 2 時間を格納します 。
2。大人の心筋細胞の単離
- 蛍光準備灌流システム
- 熱メッキ媒体と洗濯中 37 ° C Defreeze 500 μ L CaCl 2 の管およびコラゲナーゼの 25 mg で重量を量る 。
- フラッシュ滅菌は、アクアと蛍光灌流システムその後 5 分間システムを循環するパウエル媒体を聞かせてください。
- いずれかの空気泡とガス 95% 酸素媒体なし 80 ml パウエル中蛍光灌流システムを入力します 。
- 40 ml パウエル中管 (50 mL) を準備、37 ° C に熱するし、95% の酸素とガスします 。
- カニューレに削除された心を取り付けるための長さ約 25 cm のスレッドを準備します 。
- は、アルコール (70% ボリューム) にかみそりの刃を脱脂してチョッパーに固定します。チョッパーにプラスチック製のディスクをクランプします 。
- 心の抽出
- と 4 ~ 5% イソフルレン雄 wistar ラットを麻酔し、頚部転位と犠牲します。腹部断肋骨アーチの後ろに腹部を開くし、開く胸腔内横隔膜を切ってはさみのペアは同じと 。
- は、胸腔内に高度頭蓋胸腺上切断して心臓、肺、胸腺を削除します。すぐに冷たい食塩水に材料を転送します 。
- 解剖はさみ (大) と心臓から肺、胸腺を削除し、カプセル鉗子で材料を遠ざけているか、によっては新しい食塩に後者転送します 。
- 分離
- カプセル鉗子と解剖はさみ (大小) を使用して心から胸腺、気管、脂肪と結合組織の残基のような余分な組織を削除します。大動脈を明らかにし、第 1 および第 2 鰓建築間解剖はさみ (大小) と断絶
- 蛍光灌流システムの滴下を開始します。蛍光灌流システムのカニューレに中心を置き、ワニ クランプと後で準備されたスレッドに最初じっと見つめます。それは血の自由まで心をすすぎします 。
- 5-6 mL 暖かいパウエル中 25 mg コラゲナーゼを溶かし、12.5 μ L CaCl 2 (30 μ M) を追加しています 。
- は滴下心を蛍光灌流システムに接続されているガラス漏斗を移動することによって循環を閉じて解決コラゲナーゼを灌流システムに追加します。毎秒 1 滴のドロップ速度と 25 分間灌流を開始
。 注: 灌、心が膨らむし、蝋のような外観を取得します 。
- は 25 分後に灌流を停止し、中心部を蛍光灌流システムから取り外します。心臓から大動脈、アトリア、および結合組織を削除し、右と左の心室を開きます 。
- 90 ° の角度に 2 回心臓を切る (切断幅: 0.7 mm; 速度: 0.15 cm/s)。10 の 2 つのメスを使って手動でこのプロセスを繰り返す s 両側 。
- は、新しいチューブ (50 mL) に灌流中の 12 mL を転送します。37 で別の 5 分間この媒体およびダイジェストのセルにセル スラリーを注ぐ ° c. ミックス ソリューション毎分 。
- 新しいチューブ (50 mL) にナイロン メッシュ (200 μ m) を通して消化の心臓を持つソリューションにフィルターを適用します 。
- は、上清 29 x g で 3 分間破棄でフィルタ リング ソリューションを遠心し、12.5 μ L CaCl 2 (250 μ M) 細胞ペレットを含む 6 mL 暖かいパウエル培地を追加します。滑らかな揺れ動きを通じてペレットを再懸濁します。再び 2 分破棄上清の 29 x g で遠心し、6 mL 暖かいパウエル媒体 25 μ L CaCl 2 (500 μ M) で置換を追加します。穏やかな揺れ動きを通じて細胞ペレットを溶解し、12 mL 暖かいパウエル媒体含む 120 μ L CaCl 2 (1 mM) を追加します。3 回目 16 × g で 1 分間遠心します。再度、上清を削除します 。
- 細胞ペレットを混ぜてあらかじめ加温めっき中です 。
- は、培養皿からプレめっき媒体を削除します。メッキ各培養プレートに、分離心筋細胞を含む培地 1 mL を転送します。インキュベート, 37 ° C で新鮮な分離心筋
- は、培養皿からメッキ媒体を削除します。洗浄媒体各培養皿に 1 mL を追加し、媒体を変更することがなく 6 日に 37 ° C でプレートを蓄える 。
- の異なった化学薬品と ARVC 治療の影響を調査するためまず洗浄媒体と、その後別の化学物質を追加することによってメッキ媒体を更新します
。 注: 光学顕微鏡レベルで評価: 各セルの準備と 150 に 300 心筋細胞が光顕で一日監視必要があります。外見によるとグループにすべてカウント心筋細胞を分割 (例えば、 " 棒状 "、" ダウン ラウンド "、" 拡散 " と " 異常な外観 ")。カテゴリ " 拡散 " 偽足のような構造を持つすべての心筋細胞が含まれています。" 異常な外観 " 不規則な表面を持つすべて ARVC しない検出のまま細胞膜が含まれています 。
3。例実験
- 共焦点レーザー顕微鏡による培養中に ARVC の分析の形態と構造変換を 大人の心筋細胞の免疫蛍光/蛍光染色 をします。ファロイジン TRITC を使用して F-アクチンの構造を調査する " ロッド形 "、" ダウン ラウンド " と " 拡散 " ARVC。メーカーによると染色を実行 ' s プロトコル。ファロイジン TRITC 染色のための例は参照 ا ら に指定します。 11. 蛍光/蛍光染色と違い実験的治療 (例えば の間培われた大人の心筋収縮装置のデ- と再 differentiation でSwiprosin-1、イオノマイシン) 調べることができます 。
- リアルタイム定量的 RT-PCR (qRT PCR)
- 異なる遺伝子の mRNA 発現の変化を調査する qRT PCR を行う (例えば、 OSM Swiprosin 1, β-MHC) ARVC の栽培中。拡大培養皿を使用して十分なサンプル サイズ (内径: 60 mm) 2 mL の量。ARVC 5 培養皿の 1 つのサンプルが得られます。MRNA の単離と製造元によると cDNA の変換 ' s プロトコル 。
- イムノブロット法
- ARVC の培養中に (例えば Swiprosin 1) 蛋白質発現の変化を調査するため西部のしみを実行します。サンプルあたり 1 つの培養皿 (1 mL) を使用します 。
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Representative Results
アダルト文化における心筋細胞:図 1は、最後の洗浄後、新鮮単離アダルト心筋 2 h の概要を示します。すべての心筋細胞の約 75% は、棒状の形態を持っていた。残りの 25% は、円形の形態とない検出そのまま細胞膜 (図 1) 異常な外観を示した。まで栽培 (6 日目) の最後にすべての心筋細胞の 15% を示した広がり、約 10% 偽足のような構造を持たない丸い形態に残ったし、75% すべての心筋細胞の異常な外観を提示は、不規則な表面とすることがなく、検出可能なそのまま細胞膜 (データは示されていない)。
図 1: 新鮮単離ラット心筋細胞の概要。棒状の形態を示した新鮮単離の心筋細胞の割合は平均 cardiomyocytes の 75% に達した。細胞の残りの 25% は、不規則な表面、ない検出のまま細胞膜が異常な外観を掲載しました。記録をたて分離心筋細胞を洗浄後光顕 2 h で行った。光顕微鏡 2 倍の倍率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
光学顕微鏡検査、新鮮単離 ARVC 登場棒状のものと 100 μ m 前後のサイズ (図 2 a)。新鮮な分離した自発的に契約 ARVC はカルシウム耐性ではなかった。ラウンドと検出のまま細胞膜なしのすべてのセルが破損して実用的でない (図 2 aB)。次の日には、棒状の ARVC のほとんどはこの形態を失った。細胞を得た検出そのまま細胞膜に丸められます。これら ARVC は実行可能だった。開始 3 日目で後者のセルと、偽足のような構造が形成されます。これら ARVC のいくつかは (図 2 b) を展開中に、丸みを帯びた外観を保持しました。他はフラット、換算ポリモーフィック ARVC (図 2 b)。
図 2: ラット心筋細胞を分離します。(A)たて分離 ARVC いた通常棒状。(B) 6 日間培養後偽足のような構造 (拡散) ほとんど今丸みを帯びた ARVC 明確に検出されなかった。いくつか ARVC は完全に広範な形態に変更。ARVC 異常な外観とは、不規則な表面およびない検出のまま細胞膜に表示されます。光顕微鏡 10 倍の倍率。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
新鮮な分離 ARVC だった通常はっきりと見える十字紋 (図 30 日) に棒状のものです。細胞形態の変化は文化で次の日の間に観察されました。まず、ARVC を失ったすべての収縮要素 (図 3日 1、2)。これはde novo sarcomerogenesis 十三、宗教改革によって続いた。宗教改革は、偽足のような構造 (拡散、図 3、6 日 3) の形成が先行しました。De novo sarcomerogenesis はアクチン繊維の応力 (図 3日 3) の外観を開始しました。さらに、おもに登場し、新しく形成されたアクチン線維束はサルコメア (図 34 日、5) に集まった。後者は (図 3, 6 日) が周囲に前もって形成されたアクチンストレスファイバーに沿って育った。栽培期間 (日 6 a) の終わりに、普及に新しく組み立てたサルコメアから典型的なクロス紋 ARVC 観察されました。
図 3: 蛍光染色します。デ- と再-differentiation ARVC の 20% の FCS と文化でが表示されます。新鮮な分離 ARVC の典型的な棒状 (0 日) には、文化 (日 1) の最初の日の間にサルコメアを低下させることで丸くなった。彼らはすべての収縮要素 (日 2) (拡散; 偽足のような構造の形成に続いて失った3 ~ 5 日) およびde novo sarcomerogenesis (6 日) を示す収縮要素の後続の改革。日 6 文化で、十字紋が再び明確に検出 (日 6 a)。製造元のプロトコルによると TRITC ファロイジンで染色「矢印」: 偽足のような構造 (例);*: アクチン線維束核地域の (模範的な表示)。この図の部分で公開されて11 。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4は、栽培中拡散過程の速度論的表示します。検査のたびに偽足のような構造を示す ARVC の割合は、% (図 4) の広がりとして与えられます。拡散 3 日目の周りを開始し、栽培の時間の間に絶えず増加しました。すべてのカウント ARVC の 14.7% ± 1.39% は、栽培で 6 日後に偽足のような構造を示した。
図 4: 栽培時間の 6 日間 (% で広がっている) すべてのカウントが設定された心筋細胞に正規化拡散偽足のような構造を持つ心筋運動の増加 (n = 33 セル準備).データを提示する ± SEM. の手段としてこの図は、11で公開されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ARVC の拡散に及ぼすイオノマイシン:分離と ARVC の栽培はカルシウム敏感なプロセス1,8です。イオノマイシン (1 μ M)、細胞内カルシウム濃度を増加させる, ARVC の治療は、コントロール (図 5) に比べて偽足のような構造の形成に有意に (p ≤0.01) 減少を引き起こされます。直接比較すると、すべてカウント ARVC の 17.19% ± 2.45% 示した制御条件の下で広がっているが、すべてカウント ARVC の唯一の 9.87% ± 2.77% イオノマイシン (栽培の 6 日) 存在下で偽足のような構造を形成しました。したがって、イオノマイシン 42.58% 拡散を削減しました。
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図 5: イオノマイシン治療論を広がっている。日 0 イオノマイシン (1 μ M) による治療には、拡散セル コントロールと比較して有意に高い削減が原因発生します。データを提示する ± SEM; の手段としてn = 4 のセル準備;マン ・ ホイットニーの U 検定-試験;* p 0.05;* * p ≤0.01この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
また、イオノマイシンは制御状態 (図 6) と比較して異常な外観と ARVC の割合を増加させた。日 6、71.11% ± 4.65% すべてのカウント ARVC イオノマイシン異常な外観を示した症例です。ただし、制御条件の下で、ARVC の唯一 51.35% ± 3.55% がこのグループに分類されました。
図 6: 不健康な外観を持つ ARVC 。イオノマイシン (1 μ M) と 0 日での治療は、異常な外観を示した ARVC の数で大幅な増加を引き起こした。6 日でコントロールと ARVC イオノマイシン処理の違いが大きかった。データを提示する ± SEM; の手段としてn = 4 のセル準備;マン ・ ホイットニーの U 検定-試験;* p 0.05この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
栽培イオノマイシン、治療の 3 日目 qRT PCR (図 7 aとC) ARVC の解消の分化の明確な役割を再生する β-MHC (p ≤0.01) と OSM の mRNA 発現減少を明らかにしました。Swiprosin-1 ARVC の再分化のマーカー大幅、ダウンレギュ レートもあった (図 7 b)。
図 7: デ- と再-differentiation 栽培 ARVC イオノマイシンで治療中の
(1 μ M) オンコスタチン M (OSM) の減らされた mRNA を引き起こされる 0 日式で β-MHC、両方は解消大人の心筋細胞分化に重要な役割を再生します。さらに、Swiprosin 1、大人の心筋細胞の再分化におけるキープレーヤーの mRNA の発現はイオノマイシン治療によっても減少しました。栽培の日 3データを提示する ± SEM; の手段としてn = グループあたり 30 細胞培養皿マン ・ ホイットニーの U 検定-試験;* p 0.05;* * p ≤0.01この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プレめっき中 |
| 20 mL CCT 媒体 |
| 2 %vol. ペニシリン/ストレプトマイシン (400 μ L) |
| Vol. 4 %fcs (800 μ L) |
| めっき中 |
| 20 mL CCT 媒体 |
| 2 %vol. ペニシリン/ストレプトマイシン (400 μ L) |
| 洗濯中 |
| 20 mL CCT 媒体 |
| 2 %vol. ペニシリン/ストレプトマイシン (400 μ L) |
| 注: プレめっき中 4 %vol. の FCS は、1 Vol.-% ラミニン (0.5 μ g/cm2) で置き換えることができます。また、数日間心筋細胞を育成のためには、洗濯中に 20 Vol.-% FCS を追加します。までを使用して洗浄、めっき中中小 4-8 ° c を格納します。 |
心筋細胞の分離で使用される表 1: 文化メディア
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Discussion
大人の心筋細胞生体内での挙動は他の細胞 (例えば、神経細胞、内皮細胞、線維芽細胞、炎症細胞) と電気シンシチウム彼らを形作る多くの相互作用を受けます1。したがって、分離と培養 ARVC の専ら大人の心筋細胞のストレス適応の勉強が必要です。隔離・培養 ARVC の主な効果は、: 1) 細胞外マトリックスと細胞間の連絡先から切断します。2) 収縮刺激から切断します。3) 三次元組織から二次元の環境に適応するための強制。これらの条件の下で ARVC 起動デ再 differentiation 前述し実行心臓改造生体内で(β-アドレナリン受容体脱感作、サルコメア等の再構築) 中にも見られる複数の適応4します。 したがって、成人の心筋細胞の分離はこれらの細胞とさまざまな治療法への対応を検討する有効なメソッドを表します。これらの洞察は、不必要な実験を回避し、試験動物の数を減らすを助けるだろうが生体内で実験のためその後使用できます。確かに、いくつか示唆体外が発生しない生体内で(例えば偽足のような構造の形成)。電気シンシチウム内の既存のセルのセル連絡先は生理的条件17の下で過度の成長を阻害します。それにもかかわらず、分離および栽培 ARVC は大人の心筋細胞の挙動を調査する使用できます。さらに、ヒトの心疾患に対する新たな治療戦略の最初の試験は ARVC を実施できます。
分離と大人の心筋細胞の培養法説明にはには、いくつかの重要なポイントが含まれています。成功した結果を得るためには、次の項目は考慮されなければなりません。
1 カルシウム耐性: 歴史的に、成人の心筋細胞のカルシウム耐性だった大人の心筋細胞1,7,の培養と分離を成功させるにつながる最も重要な要因の一つ。8. 栽培生理学的カルシウム条件1,3を確保するためのプロトコルを確立する今日では。この原稿は、分離 ARVC の品質に変更された細胞内カルシウム濃度の影響を示しています。イオノマイシンは、細胞内のカルシウム濃度が増えると、異常な外観と心筋細胞数の広がりの重要な減少と大幅な増加の原因。さらに、それはキー マーカーの心臓デ- と再-differentiation のダウンレギュレーションを引き起こした: β-MHC、OSM と Swiprosin 1。したがって、培養中に細胞内カルシウム濃度を変更する新しい環境に適応する ARVC の機能を妨げます。いくつか ARVC 普及し、適応することができたが (9.87% ± 2.77% は、すべてカウント ARVC;図 5) これらの条件の下で ARVC の正確な調査は不可能です。したがって、正確な分離と ARVC の栽培に確立されたカルシウム プロトコルを使用する必要があります。さらに、調査の処置のどれもが ARVC のカルシウム止血を妨げることが確保されなければなりません。
2。 コラゲナーゼ: コラゲナーゼの別のバッチがあります。各バッチは、品質と効果1の違いを示しています。したがって、著者らは順序と異なるバッチのサンプル テストをお勧めします。また、各の新しいバッチのコラゲナーゼの消化の時間は個別に評価するニーズを使用しました。したがって、濃度および記述されているプロトコルでの消化時間が他のプロトコルに若干異なることができます。
3. 心の灌流までの時間: ARVC の高品質を確保するため心を体と蛍光システムによる血液灌流の開始から抽出までの時間はできるだけ短くする必要があります。長時間は中心部に損傷を引き起こすし、非実行可能 ARVC の数の増加の結果します。
さらに、血流と組織をまな板が良い結果を降伏に不可欠である後 5 分消化中に灌流液を温暖化。生体組織の不必要な損傷を避けるためには、これはすべての時間の点で慎重に処理しなければなりません。さらに、OSM による治療を指摘する必要があります。 または FCS の低濃度はまた de 再 differentiate4,10,18,19ARVC を有効にします。しかし、これら栄養治療法がなければ、ARVC のいくつか日2に縮退。
結論としては、分離と ARVC の栽培は、様々 な専用大人の心筋細胞の挙動を調査するための可能性を提供しています敏感な方法です。
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Disclosures
表示される結果は、フランツィスカ ا の博士論文の一部です。
Acknowledgments
著者ありがとうナディン Woitasky とピーター ・ ボルクのテクニカル サポート。さらに、著者は原稿を準備する彼女の助けの夫人クラウディア ローレンツ (医療ライター、ACCEDIS) をありがとうございます。この原稿は DFG (Schlu 324/7-1) によって財政上支えられます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Langendorff perfusion system | inhouse construction | double-walled with a water based heating system |
|
| Tissue chopper Mc Ilwain | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Aortic Cannula, OD 1,8 mm | inhouse construction | ||
| Abdominal shears | Aeskulap | BC772R | |
| Capsule forceps | Eickemeyer | 171307 | |
| Dissecting scissor large | Aeskulap | BC562R | |
| Dissecting scissor small | Aeskulap | BC163R | |
| Mash with Polyamid | Neolab | 4-1413 | mash size 200 μm |
| plastic disc | Cavey Laboratory Engeneering Co. Ltd. | ||
| Collagenase Typ II | Worthington | LS004177 |
References
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