Denne artikkelen beskriver eksperimentelle protokoller for å studere ex vivo sammentrekninger av menneskelig myometrium og deres anvendelse i stoffet funnet. Denne teknikken brukes til å forbedre forståelsen av myometrial fysiologi og patofysiologi samt å validere farmakologiske data fra romanen forskning sonder eller narkotika kundeemner.
Funn og karakterisering av romanen farmasøytiske forbindelser eller biokjemiske sonder bruker robust og fysiologisk relevante analysen systemer. Vi beskriver metoder for å måle ex vivo myometrium contractility. Denne analysen kan brukes til å undersøke faktorer og molekyler involvert i modulering i myometrial sammentrekning og bestemme deres eksitatoriske eller hemmende handlinger, og dermed deres terapeutiske potensielle i vivo. Biopsier hentes fra kvinner under keisersnitt levering med samtykke. Fine strimler av myometrium er dissekert, klippet og knyttet til en force svinger i 1 mL orgel bad superfused med fysiologisk saltløsning på 37 ° C. Strimler utvikle spontan sammentrekninger innen 2-3 timer under Angi spenning og forbli stabil i mange timer (> 6 h). Strimler kan også stimulere kontrakt som av endogene hormoner, oxytocin og vasopressin, som forårsake konsentrasjon-avhengige modulering av sammentrekning frekvens, kraft og varighet, mer ligner sammentrekninger i arbeid. Dermed kan effekten av kjente og romanen narkotika kundeemner testes på spontan og agonist-indusert sammentrekninger.
Denne protokollen detaljer spesielt hvordan denne analysen kan brukes til å bestemme styrken på kjent og romanen agenter ved å måle deres effekter på ulike parametere av menneskelig myometrial sammentrekning. Vi bruker oxytocin- og V1a reseptor antagonister, atosiban og SR49059 som eksempler på kjente forbindelser som hemmer oxytocin og vasopressin-indusert sammentrekninger, og viser hvordan denne metoden kan brukes til å utfylle og validere farmakologiske data fra cellen-basert analyser å hjelpe narkotika utvikling. Effekten av romanen agonister sammenlignet oxytocin og vasopressin kan også være preget. Mens vi bruker eksempel på oksytosin / vasopressin systemet, denne metoden kan også brukes til å studere andre reseptorer og ionekanaler som spiller en rolle i livmor Sammentrekningen og avslappingen å fremme forståelsen av menneskelige livmor fysiologi og patofysiologi.
Målet med medisiner er roman, potent, og svært selektive ligander som genererer et terapeutisk svar ved å hemme mobilnettet signalveier. Dette krever en passende analysen systemet i å teste bly forbindelser med pålitelig, solid og relevante resultater1. Farmakologiske teknikker som ligand-reseptor bindende og funksjonelle analyser ansette ofte heterologous celle-baserte systemer, utviklet til overexpress reseptorer som ellers ikke ville være tilstede2. Mens disse teknikkene gi verdifull innsikt for reseptor farmakologi og tidlig narkotika utvikling, kan dataene innhentet ikke gjenspeile et sant i vivo scenario. Det er derfor viktig at farmakologiske data fra cellen-basert analyser også valideres i fysiologisk relevante modeller.
Livmor glatt muskel (myometrium) utgjør muskel laget av livmoren som er ansvarlig for sammentrekninger under arbeid som utslette dilate livmorhalsen og leverer fosteret3. Sammentrekning av myometrium er spontan; det krever ikke hormonelle eller nervøs innspill til kontrakt4. Sammentrekninger er forårsaket av spontan depolarization i cellemembranen myometrial som fører til åpningen av spenning-opererte Ca2 +-kanaler (L-Type kanaler) og tilstrømningen av Ca2 + i cellen5. Kalsium komplekser med calmodulin og aktiverer myosin lys kjeden kinase som igjen phosphorylates myosin muliggjør kryss broen syklus formasjon med utgangen og sammentrekning. Avslapning er vanligvis formidlet av de fosforylering myosin av myosin fosfatase og en reduksjon i konsentrasjonen av Ca2 + via sin ekstrudering fra cellen og/eller fått inn sarcoplasmic retikulum (SR)5,6 ,7.
Flere metoder har blitt utviklet for å studere myometrial funksjon og dysfunksjon, i vivo interne og eksterne tocography og intrauterine press katetre, til generasjon av transformert eller udødeliggjort celler myometrial opprinnelse8 ,9,10,11,12. Mens celle kultur systemer kan oppdage om et stoff som kan fungere på cellenivå, kan strimler av vev i orgel bad brukes som verktøy til å måle funksjonelle svar av hele vev å farmakologiske reagenser. Tradisjonelle orgel badekaret er vanligvis et stort oppvarmet glass kammer som kan holde mellom 5 og 50 mL av fysiologiske saline (PSS). Strimler i disse store kamre krever vanligvis lufting med oksygen og store mengder PSS. Strimler av vev er dissekert og suspendert i bading kammeret og knyttet til en force svinger som måler endringer i spenning, som under en sammentrekning. Strimler av myometrium fra både mennesker og dyr inkludert marsvin13, musen14, rotte15, kanin16og andre17,18, har vært brukt av en rekke forskningsgrupper undersøke mange spørsmål knyttet til myometrial fysiologi og patologi, inklusiv premature og dysfunksjonelle arbeide. For eksempel myometrial strimler har blitt brukt til å identifisere faktorene som regulerer og endre myogenic aktivitet19,20,21, bestemme organelle funksjon som SR-22, samt undersøker modulatorer av ion kanaler23,24,25,26, pumper og vekslere27 for å finne sin rolle i myometrial fysiologi.
Denne ex vivo teknikken tillater for vurdering av vev sammentrekning ytelse og den direkte effekten av forskjellige agenter på parametrene i sammentrekning skal måles inkludert, sammentrekning kraft (styrke), hyppighet og varighet, samt integrering av disse verdiene, generere et stikkordregister for det totale arbeidet gjort (mener integrert makt eller området under kurven, HiA). Som isolert vev stripe utarbeidelse utgjør en modell av mer enn én celle type, kan fysiologiske svaret av hele vev måles. Orgel badekaret og isolert vev stripen er derfor nyttig verktøy i å gi broen mellom celle kultur arbeid og hele dyr / ivivo . Derfor, i feltet i stoffet funnet, effekten av romanen agenter i deres eksitatoriske (dvs., stimulerende) eller hemmende (dvs., avslapning) potensielle i vivo kan bli mer nøye vurdert. Denne teknikken ble brukt i utviklingen av oxytocin- og V1a-reseptor (OTR og V1aR) antagonist atosiban som en tocolytic agent hemmer premature arbeidskraft sammentrekninger og forsinke tidlig fødsel. In vitro testing av atosiban på myometrial strimler funnet antagonist kunne redusere oksytosin (OT)-indusert sammentrekninger28,29,30. Viktigere disse studiene hjalp for å validere translasjonsforskning verdien av atosiban og generert proof-of-concept dataene nødvendig for å ta den frem til kliniske studier31,32,33,34 . Atosiban er nå mye brukt som legemiddel forsinke arbeid i Europa. Lignende proof-of-concept studier ble utført for oksytosin analoge carbetocin å vise sitt terapeutiske potensial i å forebygge post-partum blødning35,36,37. Andre bly forbindelser er under utvikling med denne analysen inkluderer retosiban (GSK221149A)38 og nolasiban (data upublisert). Disse metodene har også blitt brukt med hell å sammenligne mellom pasientorganisasjoner39,40,41,42,43,44, 45,46,47 og undersøke for intra-arter forskjeller.
Her beskriver vi bruk isolert ex vivo vev strimler fra gravid menneskelige myometrium i små (1 mL) skreddersydd orgel bad å illustrere hvordan denne metoden kan brukes til å utfylle og validere farmakologiske data fra cellen-basert analyser . Biopsier Hentet stort sett fra kvinner som gjennomgår pre Ap. valgfag keisersnitt (CS) levering som de planlagte kirurgi og dermed er lettere å planlegge biopsi samling, enkel tilgang til myometrium, og vev ikke ville ha vært utsatt for noen uterotonic stoffer eller lempelse før kirurgi. Imidlertid kan biopsies også fås fra kvinner under planlagte (beredskap) CS levering i arbeid gir er tilstrekkelig tid til fullt samtykke pasienten. De fleste biopsier hentes under operasjonen fra lavere livmor segmentet på stedet av kirurgiske snitt, men det er også mulig å få prøver fra øvre segmentet48,49. I noen tilfeller etter vaginal fødsel, har slag biopsier fra placental sengen også blitt innhentet50. Men dette er ikke de fleste konvensjonelle ruten og mengden myometrial vev Hentet er liten. Ikke-gravide myometrium kan fås fra pre- eller stolpe-menopausal kvinner gjennomgår hysterektomi godartet gynekologisk vilkår. En tykkhet biopsi er samplet etter patologi undersøkelse, fra lavere corpus fra livmorhalsen, og myometrium er tatt fra midten av livmor veggen unngå serosal og endometrial overflater.
Mens de fleste narkotika utvikling er ment for behandling av menneskelige lidelser, er primært mest grunnleggende forskning utført i dyr vev. Her beskriver vi metoder for å undersøke ex vivo sammentrekninger av menneskelig myometrium fra kirurgi som kan brukes til en rekke viktige spørsmål knyttet til livmor fysiologi og patologi, samt å validere funksjonelle svar til kjent og romanen farmakologiske agenter å hjelpe narkotika utvikling. Spesielt markere vi bruk av denne analysen å undersøke antagonistiske respons av en kjent OTR og V1aR konkurransedyktig antagonist, atosiban på OT-indusert gravid myometrial sammentrekninger, samt å finne svaret og reseptor selektivitet av en nyutviklet selektiv V1aR antagonist, [D-Arg8] INT. Vi viser at viktige farmakokinetiske parametere som EF50 og IC50 kan beregnes som justeres med datatypen cellebasert farmakologi.
Bruke flere strimler samtidig tillater direkte sammenligning av flere agent effekter, konkurranse eksperimenter med antagonister og riktig tid og bilen kontroller. Som strimler er ofte forberedt i grupper på 2, 4 eller 8, gir denne teknikken moderat gjennomstrømning, aktivere testing av 2-4 forbindelser i 6-8 (kumulative) konsentrasjoner (per biopsi). Denne metoden gir også sanntidsdata slik at effektene kan vurderes raskt og protokoller kan justeres. Dessuten, denne teknikken kan brukes til å teste alle sammensatte interesse og har vært brukt med hell av en rekke forskningsgrupper fokusert på myometrial fysiologi og i stoffet funnet. Foruten analysere ren forbindelser som beskrevet i dette dokumentet, livmor contractility modellen har også vært og kan brukes med hell til skjermen for romanen uterotonic forbindelser fra blandinger, som urtepreparater tradisjonell medisin7 , 55 , 56.
Selv om denne modellen er teknisk robust og viser god reproduserbarhet, den har noen begrensninger: disseksjon kan være vanskelig for dem ukjent med vev eller bruk disseksjon, derav nye brukere vil kreve litt tid å optimalisere vev forberedelse og protokoller. Det bør også bemerkes at menneskelige myometrium varierer betraktelig i utseende til andre modeller som rotte og mus. De fleste gnager uteri består av to rør-liknende livmor horn, hver med en eggstokk i den ene enden og sluttet på livmorhalsen. Hver horn har klart definert langsgående og sirkulære muskelgrupper lag, som lett kan deles ved disseksjon mens hvilke ulike fiber i menneskelig myometrium ofte henger sammen danner et “nett”. I tillegg er sammentrekning profiler av menneskelig myometrium veldig forskjellige gnagere. Mest spesielt, er sammentrekninger i menneskelig myometrium sjeldnere men lengre varighet. Eksperimentell tidsrammer for å arbeide med menneskelig myometrium er derfor ofte mye lengre enn gnager modeller. Forskjeller i reseptor uttrykk mellom artene kan også bidra til ganske store forskjeller i svar på agonister og dette skal bæres i bakhodet hvis ekstrapolere resultater på tvers av arter.
Det er også mange tiltak som må å maksimere produksjonen fra dette systemet. Kritisk trinnene omfatter bevaring av vev levedyktighet som omsorg ved håndtering av vev for å unngå unødvendig skade under disseksjon eller ved montering. Det kreves en dyktig øye å dissekere fine strimler av livmor muskler, retningen til muskelfibre er i lengderetningen og etter flyet av vev, så vel som unngå arr vev, decidua og små båter. For å hjelpe retning formål når prøven er i laboratoriet, er det mulig å legge til en kode (for eksempel små kirurgiske maske) ved samlingen til en side av biopsy å avgrense serosal kanten fra decidual kanten.
Vev bør holdes på en jevn 36-37 ° C i løpet av eksperimentering funksjon er underlagt temperatursvingninger. Dette kan oppnås med en robust klimaanlegg i laboratoriet. Konstant perfusjon av varmet PSS sikrer temperaturen vedlikeholdes og skylle ut avfallsstoffer fra sammentrekning. Temperaturen i orgel bad kan endres ved å endre infusjonshastigheten eller justere bad temperaturen direkte. Små bad størrelsen sammenlignet med tradisjonelle 5-50 mL bad sikrer en relativt rask omsetning av PSS og bleke reagenser. Miniatyriserte orgel badet reduserer som beskrevet her, også volumet av PSS og reagenser rundt nødvendig, således minimere kostnader og spare dyrebar, nyutviklet kjemikalier. I tillegg liten bad størrelsen og bruker en HEPES-baserte buffer, krever dette systemet ikke oksygenering f.eksav bobler PSS med carbogen. Standardisering av spenning på strimler er også viktig. Strimler av denne størrelsen (5 mm x 2 x 1 mm), bør dette være ca 2 mN (tilsvarer ~0.2 g). Alternative metoder omfatter anvendelse av en høyt kalium løsning å indusere maksimal sammentrekning og strekker seg til halvparten av denne maksimal sammentrekning. Det må bemerkes imidlertid at spenning anvendes i vivo kan variere.
Hovedutfordringene inkluderer å vev fra mennesker, men selv om beskatte, menneskelig vev tydelig representerer de fysiologisk relevante (og givende) modell for å studere livmor-kontraksjon i menneskelig sykdom og narkotika funnet. Isolert vevet strimler imidlertid ikke nødvendigvis likestille til vev i vivo som de er fritatt for eksempel av hormonelle og nervøs inngang som, selv om ikke avgjørende for sammentrekning, vil modulerer sammentrekninger i vivo. Denne analysen men gir mulighet til å analysere myometrial sammentrekninger på en kontrollert måte, atskilt fra slik påvirkning. Det kan også effekten av faktorer som hormonelle kontroll av sammentrekning (f.eksvia OT, VP, prostaglandiner, etc.) undersøkes, gir ledetråder til regulering av myometrial-funksjonen. Som vev er Hentet fra forskjellige kvinner, er det naturlig noe variasjon i spontan kontraktile profiler mellom eksemplarer. Derfor er det ofte nødvendig å utføre eksperimenter på mange (~ n = 10) å minimere variasjonen i noen datasett53. Dette er det viktigste når man sammenligner kontraktile aktivitet mellom ulike pasienten grupper. Normalisere svar agonister og motstanderne for å kontrollere aktivitet (dvs.uttrykke som en prosentandel av kontroll aktivitet eller høy K+) reduserer noen av denne varianten. Redusere mellom stripe variasjon, kan i tillegg dataene normaliseres for å fjerne kryss seksjon området ved å måle deres lengde og vekt innlegget eksperimentering41. Dette er spesielt nyttig når du sammenligner sammentrekning mønstre mellom ulike pasienten grupper.
Begrensninger av denne teknikken også tilgang til friskt vev som krever gode arbeidsforbindelser med Sykehusets personale, spesielt teater personalet og de som er involvert i godkjenningsprosessen. Etiske tillatelser fra det lokale forskning etikk og Institute eller sykehus gjennomgang styret må også være på plass. Samling av menneskelig myometrium er mest sannsynlig utføres under CS levering, når giveren gjennomgår kirurgi. Biopsy er tatt fra samme livmor snitt nettsted laget for levere babyen og derfor pasienten trenger ikke å gjennomgå noen ytterligere flere prosedyrer. Teater ansatte og kirurgen utfører biopsy må gjøres oppmerksom på påfølgende bruk av vev, og at de ikke skal plasseres i etappe, den stabiliserende løsninger slik som for sender til en patologi avdeling. Lenge eksperimentelle tidsrammen er en annen betraktning. Eksperimenter med menneskelig vev tar mange timer (vanligvis > 6 h) (i motsetning til 2-3 h for et lignende eksperiment i rotte eller mus livmor), på grunn av lavere frekvensen av sammentrekning og 2-3 h forsinkelse mellom vev montering og etablering av spontane sammentrekninger. Men som vi har vist, menneskelig vev sammentrekninger er robust, og når etablert kan kontrakt i mange timer uten betydelige tretthet40.
Dette systemet gjør også andre utfordringer i vivo arbeid overvinnes inkludert muligheten til å teste farmasøytiske reagenser på gravid vev. Denne teknikken kan være lett ekstrapoleres til andre arter inkludert musen der resultatene kan bekreftes før du fortsetter videre i hele dyrestudier. Kontrollert endringer i temperatur, sammensetning av superfusate (PSS) og pH kan gjøres enkelt å etterligne ulike scenarier i vivo og analysere effekten av disse endringene på sammensatte atferd. De grunnleggende prinsippene for måling isometrisk spenning i myometrial strimler kan også utvides til måle samtidige endringer i intracellulær kalsium konsentrasjon eller pH ved bruk av fluorescerende Ca eller pH (H+) indikatorer og utstyr for å oppdage og registrere fluorescens57,58,59,60.
Total, det menneskelige myometrium representerer en robust og fysiologisk relevante modell karakterisere og validere romanen terapeutiske forbindelser i stoffet funnet-både ren forbindelser og blandinger. Vi har gitt eksempler på bruk i stoffet funnet forhold til OT/VP systemet og fokusert på OTR og V1enR antagonister å vise hvordan denne modellen kan brukes til å fastslå sammensatte effekt og styrken på definerte mål og validere ligand selektivitet. Men skal det bæres i bakhodet at denne teknikken kan brukes til å studere noe mål av interesse eller sti fører til myometrial sammentrekning (eller avslapning), samt å hjelpe narkotika oppdagelsen av nye mål og stier, og fremme vår forståelse av myometrial fysiologi og patofysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen har blitt støttet av østerrikske Science Fund (FWF) gjennom prosjektet I3243 og europeiske Research Council (ERC) under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjonsprogram (gi avtalen uten 714366). CWG har blitt støttet av en australsk Research Council (ARC) fremtid fellesskap (FT140100730) og MM en bue Discovery tidlig karriere forsker (DECRA) fellesskapet (DE150100784). SA støttes av et Harris-velvære tidlig fødsel sentrum forskningsstipend administrert av velvære for kvinner, UK.
Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
HBSS | SIGMA | H9269 | |
Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
[Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |