Bu makalede insan myometrium ex vivo kasılmalar ve ilaç keşif. bunların uygulama çalışmaya deneysel protokoller Uyuşturucu adaylarını veya bu teknik myometrial fizyolojisi ve roman araştırma probları farmakolojik verileri doğrulamak için de patofizyolojisi anlayışı geliştirmek için kullanılır.
Keşif ve roman ilaç bileşikleri veya biyokimyasal probları karakterizasyonu sağlam ve fizyolojik olarak ilgili tahlil sistemlerde güveniyor. Ex vivo myometrium contractility ölçmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Bu tahlil faktörleri araştırmak için kullanılabilir ve söz konusu olursa molekülleri myometrial daralma ve onların eksitatör veya inhibitör eylemleri belirlemek için modülasyon ve dolayısıyla onların tedavi potansiyel içinde vivo. Biyopsi sezaryen teslimat ile aydınlatılmış onam geçiren kadınlar elde edilir. Myometrium ince şeritler disseke, kirpik ve 1 mL organ banyoları 37 ° C’de fizyolojik serum fizyolojik solüsyonu ile superfused içinde bir güç çevirici bağlı Şeritler set gerilim altında 2-3 saat içinde kendiliğinden kasılma geliştirmek ve saatlerce stabil (> 6 h). Şeritler de konsantrasyon bağımlı modülasyon kasılma sıklığı neden, oksitosin ve vazopressin, endojen hormonlar tarafından zorla ve süresi, daha yakından benzer emek kasılma gibi sözleşme için teşvik. Bu nedenle, bilinen ve yeni ilaç müşteri adayları etkisi spontan ve agonist indüklenen kasılmalar üzerinde test edilebilir.
Bu iletişim kuralı özellikle bu tahlil insan myometrial daralma çeşitli parametreler üzerindeki etkileri ölçerek bilinen ve yeni aracıları potens belirlemek için nasıl kullanılabileceğini ayrıntıları. Biz oksitosin ve V1a reseptör antagonistleri, atosiban ve SR49059 örnek olan oksitosin ve vazopressin indüklenen kasılmalar inhibe ve tamamlayıcı ve doğrulamak için bu yöntemi nasıl kullanılabileceğini gösteren bilinen bileşikler olarak kullanın farmakolojik verilerini deneyleri–dan hücre-esaslı ilaç geliştirme yardım etmek için. Oksitosin ve vazopressin göre roman agonistler etkileri de karakterize edilebilir. Oksitosin örneği kullandığımız iken / vazopressin sistem, bu yöntem de olabilir diğer reseptörleri ve rahim kasılma ve gevşeme insan rahim fizyolojisi ve patofizyolojisi anlayışı ilerletmek için bir rol oynamaktadır iyon kanalları çalışırdım.
İlaç keşif amacı roman, güçlü ve etkinleştirme veya hücresel sinyal yolları inhibe bir terapötik yanıt üretmek çok seçici ligandlar üretmektir. Bu hangi kurşun bileşikleri ile güvenilir, sağlam ve ilgili sonuçlar1test etmek bir uygun tahlil sistemi gerektirir. Ligand-reseptör bağlama ve fonksiyonel deneyleri gibi farmakolojik teknikleri kez kapaklı hücre tabanlı sistemleri, hangi başka türlü-mevcut2olmaz overexpress reseptörleri için tasarlanmış kullanır. Bu teknikler değerli bilgiler sağlamak için reseptör Farmakoloji ve erken ilaç geliştirme iken, elde edilen veriler doğru vivo senaryo yansıtmıyor olabilir. Bu nedenle hücre tabanlı deneyleri farmakolojik veri aynı zamanda fizyolojik ilgili modellerinde doğrulanır önemlidir.
Rahim düz kas (myometrium) efface ve dilate serviks ve fetüsün3sağlayan emek sırasında kasılmalar için sorumlu olan rahim kas tabakası kabul ettiğiniz anlamına gelir. Myometrium spontan oluşturulmuştur; 4sözleşme için hormonal veya gergin giriş gerektirmez. Kasılmalar getirdi tarafından kendiliğinden depolarizasyon myometrial hücre zarının açılması gerilim ile çalışan Ca2 +yol açar-kanalları (L-tipi kanal) ve akını Ca2 + 5hücre içine. Kalsiyum kompleksleri ile calmodulin ve hangi sırayla çapraz köprü döngüsü oluşumu aktin ve daralma ile etkinleştirme myosin phosphorylates myosin hafif zincir kinaz etkinleştirir. Gevşeme genellikle myosin myosin fosfataz ve Ca2 + yolu ile onun ekstrüzyon hücre ve/veya (SR)5,6 sarcoplasmic retikulum iyon konsantrasyonu bir azalma de-fosforilasyon tarafından aracılık ettiği ,7.
Myometrial işlevi ve myometrial kökenli8 dönüştürülmüş veya ölümsüzleştirdi hücre üretimi için in vivo iç ve dış tocography ve intrauterin basınç Kateterler, fonksiyon bozukluğu eğitim için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir ,9,10,11,12. Hücre kültür sistemleri bir madde hücresel düzeyde hareket edebilir olup olmadığını algılayabilir iken şeritler organ banyosu içinde dokuların farmakolojik reaktifler bütün dokuların fonksiyonel yanıtlarını ölçmek için araç olarak kullanılabilir. Geleneksel organ Banyosu genellikle Holding arasında 5 ve 50 mL fizyolojik serum (PSS) yeteneğine sahip olan bir büyük ısıtmalı cam dolu bir yer. Bu büyük Odaları içinde şeritler genellikle oksijen ve PSS geniş hacimli havalandırma gerekir. Şeritler doku disseke ve Banyo odası içinde askıya ve ölçen gerginlik, değişimler gibi bir kasılma sırasında bir güç çevirici bağlı. 17,18şeritler, myometrium insanlar ve hayvanlar dahil olmak üzere, eskiden şiling şimdi domuz13, fare14, sıçan15, tavşan16ve diğerleri, bir araştırma gruplarının sayısını incelemek için kullanılan myometrial fizyolojisi ve patoloji, preterm ve işlevsel olmayan uğraşları da dahil olmak üzere ilgili birçok soru. Örneğin, myometrial şeritler düzenleyen ve myogenic etkinliği19,20,21değiştirmek, organel işlevi SR22gibi faktörler tanımlamak için kullanılan yanı sıra İyon modülatörler soruşturma myometrial Fizyoloji rolünü belirlemek için23,24,25,26, pompalar ve değiştiriciler27 kanalları.
Bu ex vivo teknik doku daralma performans değerlendirilmesi ve farklı ajanlar doğrudan etkisi daralma parametrelere ölçülecek sağlar dahil olmak üzere, kasılma gücü (gücü), sıklığı ve süresi, hem de entegrasyon toplam çalışma yapılan (ortalama ayrılmaz kuvvet ya da AUC eğri altındaki alan) bir dizin oluşturmak için bu değerleri. İzole doku şeridi hazırlama birden fazla hücre tipi bir model teşkil eder gibi bütün doku fizyolojik tepki ölçülebilir. Organ banyosu ve izole doku şerit bu nedenle hücre kültür iş ve tüm hayvan arasında köprü sağlayan yararlı bir araç vardır /vivo içinde çalışma. Bu nedenle, ilaç bulma, onların eksitatör açısından yeni ajanların etkileri alanında (Yani, uyarıcı) veya inhibitör (Yani, gevşeme) potansiyel vivo içinde daha yakından değerlendirildi. Bu teknik oksitosin ve V1agelişiminde başarıyla kullanıldı-(OTR ve V1aR) reseptör antagonisti atosiban preterm doğum kasılmaları inhibe ve erken doğum gecikme için bir tocolytic ajan olarak. Atosiban üzerinde myometrial şeritler in vitro test bulundu antagonisti oksitosin (OT) önemli ölçüde azaltmak mümkün-indüklenen kasılmalar28,29,30. Önemlisi bu çalışmalar atosiban translasyonel değerini doğrulamak için yardımcı oldu ve prototip, veri almak için klinik çalışmalarda31,32,33‘ e,34 ileterek oluşturulan . Atosiban, Avrupa’nın emek geciktirmek için Şimdi seçim uyuşturucu olarak yaygın olarak kullanılır. Benzer kanıtı-of-concept çalışmalar sonrası kanaması35,36,37önlemede tedavi potansiyel göstermek oksitosin analog carbetocin için yapılmıştır. Bu tahlil ile şu anda geliştiriliyor diğer kurşun bileşikleri retosiban (GSK221149A)38 ve nolasiban (yayınlanmamış veri) içerir. Bu yöntemler aynı zamanda başarılı bir şekilde hasta grupları39,40,41,42,43,44arasında, karşılaştırmak için kullanılmıştır 45,46,47 ve içi-türler farklılıklar için inceleyin.
Burada izole ex vivo doku şeritler hamile insan myometrium tamamlayıcı ve farmakolojik veri–dan hücre-esaslı deneyleri elde doğrulamak için bu yöntemi nasıl kullanılacağını göstermek için küçük (1 mL) özel yapım organ banyosu içinde nasıl kullanılacağını açıklar . Biyopsi büyük ölçüde önceden işçi seçmeli sezaryen (CS) teslim olarak planlanan cerrahi vardır ve bu nedenle biyopsi toplamayı zamanlar, myometrium kolay erişimi kolay ve dokularda herhangi birine maruz kalmış değil geçiren kadınlardan elde edilmiştir uterotonic uyarıcı ya da ameliyat öncesi gevşetici. Ancak, biyopsi de plansız (Acil) CS teslim tamamen hasta kabul için yeterli zaman sağlayan emek geçiren kadınlardan elde edilebilir. Örnekleri üst segment48,49edinmek mümkündür ancak çoğu biyopsi cerrahi kesi yerinde rahim alt segmentten ameliyat sırasında elde edilir. Vajinal doğumu takiben birkaç durumda punch biyopsi plasental yatağı da50elde edilmiştir. Ancak, bu en geleneksel rota değildir ve myometrial doku alındı küçük miktarıdır. Sigara hamile myometrium benign jinekolojik koşulları için histerektomi ameliyatı öncesi ya da sonrası menopoz kadın elde edilebilir. Tam kalınlıkta biyopsi örneklenen sonrası patoloji muayene, serviks, uzak alt gövde üzerinden ve myometrium seröz ve endometrium yüzeyler kaçınarak rahim duvarı ortasından alınır.
Çoğu ilaç geliştirme insan bozuklukları tedavisi için tasarlanmıştır iken, en temel araştırma öncelikle hayvansal dokularda gerçekleştirilir. Burada, biz birkaç önemli sorular rahim ile ilgili fizyolojisi ve patoloji adrese gibi fonksiyonel yanıt-e doğru doğrulamak için kullanılabilecek cerrahiden elde edilen insan myometrium ex vivo kasılmalar araştırmak için yöntemleri tarif ilaç geliştirme yardım etmek için bilinen ve yeni farmakolojik ajanlar için. Özellikle, biz yanıt ve reseptör belirlemek için bir bilinen OTR ve V1aR rekabetçi antagonisti, atosiban hamile myometrial OT indüklenen kasılmalar, de üzerinde antagonistik yanıt araştırmak için bu tahlil kullanımı vurgulayın bir yeni geliştirilen seçmeli V1aR antagonisti, [D-Arg8] Int. seçicilik Biz hangi ile de Farmakoloji hücre tabanlı verileri hizalama EC50 ve IC50 gibi önemli farmakokinetik parametreleri hesaplanabilir göstermek.
Aynı anda birden çok şeritler kullanarak birden çok aracı etkileri, rekabet deneyler antagonistleri ve uygun zaman ve araç kontrolleri ile doğrudan karşılaştırma sağlar. Şeritler, 2, 4 veya 8 grup halinde kez hazırlanırken bu teknik orta çıktı, 2 – 4 bileşikler (biyopsi) başına 6 – 8 (kümülatif) konsantrasyonlarda test etkinleştirme sağlar. Bu yöntem aynı zamanda etkileri hızlı bir şekilde tespit edilebilir ve iletişim kuralları ayarlanabilir böylece gerçek zamanlı veri sağlar. Buna ek olarak, bu teknik herhangi bir bileşik faiz sınamak için kullanılan ve myometrial Fizyoloji ilaç keşif odaklı Araştırma gruplarının sayısını tarafından başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu yazıda açıklandığı gibi saf bileşikleri analiz, yanı sıra rahim contractility modeli da olmuştur ve başarıyla gibi karışımları, roman uterotonic bileşikleri için ekran için kullanılması gereken geleneksel tıp7 bitkisel preparatlar , 55 , 56.
Bu model teknik olarak güçlü ve iyi tekrarlanabilirlik gösterir rağmen bazı kısıtlamalar bulunmaktadır: diseksiyon bu doku ile yabancı zor olabilir veya diseksiyonu donanımları kullanarak, bu nedenle yeni kullanıcılar doku optimize etmek için biraz zaman gerektirir Hazırlık ve iletişim kuralları. Ayrıca o insan myometrium önemli ölçüde görünüm olarak fare ve fare gibi diğer modeller farklı dikkat edilmelidir. Çoğu kemirgen uteri iki tüp benzeri rahim boynuzları oluşur, her bir ucunda bir yumurtalık ile tamamlamak ve serviks katıldı. Her boynuzun açıkça insan myometrium farklı fiber türlerinde kez bir ‘Ağ’ oluşturan iç içe geçmiş bulunmaktadır ederken hangi diseksiyon kolayca ayrılabilen boyuna ve dairesel kas tabakaları tanımlamıştır. Buna ek olarak, insan myometrium daralma profilleri kemirgenler çok farklıdır. En önemlisi insan myometrium kasılma süresi daha uzun daha az sık. Deneysel zaman dilimlerini insan myometrium ile çalışmak için çoğu zaman bu nedenle çok kemirgen modelleri daha uzun. Reseptör ifade türler arasında farklılıklar da agonistler yanıt oldukça belirgin farklılıklar katkıda bulunabilir ve bu türler arasında sonuçları extrapolating Eğer kaynaklı.
Orada da dikkate çıktı bu sistemi en üst düzeye çıkarmak için gereken adımları sayısı. Kritik adımlar diseksiyon sırasında gereksiz herhangi bir zarar görmemesi için dokuları ele alırken veya ne zaman montaj bakımı gibi doku canlılığı korunması içerir. Yetenekli bir göz ince şeritler rahim kas, kas lifleri yönünü boyuna yön ve uçak doku takip, yanı sıra skar doku, decidua ve küçük gemiler kaçınarak sağlanması incelemek için gereklidir. Numune laboratuvarda olduğunda yönlendirme amaçlı yardımcı olmak için seröz kenarına decidual kenarından betimlemek için biyopsi bir yana toplanması sırasında (örneğin, küçük cerrahi dikiş) bir etiket eklemek mümkündür.
Doku fonksiyon sıcaklık derecesi fluctuations tabi olduğu gibi dokuların sürekli bir 36-37 ° C’de deneme sırasında tutulmalıdır. Bu laboratuvar içinde sağlam klima ünitesi ile elde edilebilir. Isıtılan PSS sürekli perfüzyon daralma atık ürünleri dışarı kızarma yanı sıra sıcaklık muhafaza sağlar. Sıcaklık organ banyosu içinde akış hızını değiştirme veya su banyo sıcaklığı doğrudan değiştirerek değiştirilebilir. Geleneksel 5-50 mL hamama karşılaştırıldığında küçük banyo boyutu PSS nispeten hızlı bir ciro ve reaktifler Silinerek geçiş sağlar. Kırılan organ Banyosu burada açıklandığı gibi aynı zamanda PSS hacmi ve böylece maliyeti en aza indirmek ve değerli tutumlu, yeni geliştirilmiş kimyasal gerekli, ilgi Kimyasalları azaltır. Buna ek olarak, küçük banyo boyutu ve HEPES tabanlı bir arabellek kullanarak sayesinde, bu sistem örneğinoksijenlenme, PSS carbogen ile köpüren tarafından gerektirmez. Şeritler için uygulanan gerilim standardizasyon da önemlidir. İçin şeritler (5 x 2 x 1 mm) bu büyüklükte, bu yaklaşık 2 mN (~0.2 g için eşdeğer) olmalıdır. Alternatif yöntemler uygulama yüksek potasyum çözümün maksimal kasılma ve en fazla bu daralma yarısı germe ikna etmek için içerir. Ancak belirtmek gerekir, o uygulanan gerilim vivo içinde farklı olabilir.
Ana zorluklar insan denekler dokular elde içerir, ancak her ne kadar vergi, insan doku açıkça en fizyolojik insan hastalık ve ilaç keşif rahim kasılması çalışmak için ilgili (ve tatmin edici) modeli temsil. Şeritler ancak, mutlaka doku içinde vivo için örneğin, hormonal muaf oldukları ve gergin, giriş olarak daralma için gerekli değil, ancak eşit değil izole doku kasılmalar içinde vivomodüle. Bu tahlil ancak myometrial kasılmalar böyle etkilerden ayrılmış kontrollü bir şekilde analiz etmek için fırsat sağlar. Ayrıca hormonal kontrolü daralma (örneğin, yolu ile OT, VP, Prostaglandinler, vb) gibi faktörlerin etkisi için araştırılması için myometrial işlevi düzenlenmesi için ipuçları sağlamak sağlar. Dokuları farklı kadın elde edilir gibi doğal olarak bazı varyasyon spontan contractile profilleri örnekler arasında olduğunu. Bu nedenle genellikle çok sayıda üzerinde deneyler yapmak gereklidir (~ n = 10) örneklerinin bazı veri kümeleri53varyasyon en aza indirmek için. En önemli farklı hasta grupları arasında contractile aktivite karşılaştırırken bu. Yanıt agonistleri ve antagonistleri etkinliği denetlemek için normalize (Yani, denetim faaliyeti veya yüksek K+yüzdesi olarak ifade) bazı bu varyasyon azaltır. Buna ek olarak, arası şerit varyasyon azaltmak için veri kendi uzunluk ve ağırlık yazı deneme41ölçerek çapraz kesit alanı şerit için normalleştirilmiş. Bu daralma desenleri farklı hasta grupları arasında karşılaştırma özellikle yararlıdır.
Bu teknik sınırlamaları da hastane personeli, özellikle tiyatro personel ile iyi çalışma ilişkileri gerektiren erişim taze dokulara içerir ve bu izni sürece dahil. Yerel araştırma Etik Kurulu ve Enstitü ya da hastane inceleme kurulu etik izinleri de eklenmiş olması gerekir. İnsan myometrium donör cerrahisi uygulanan zaman CS teslim sırasında gerçekleştirilen en olası koleksiyonudur. Aynı rahim kesi siteden bebek teslim etmek için yapılan biyopsi alınır ve bu nedenle hasta herhangi bir daha fazla ek yordamları geçmesi gerekmez. Tiyatro personel ve biyopsi performans cerrah gerekir dokuları sonraki kullanımını öğrenmesini ve bunların sabitleştirici çözümlerinizle böyle bir patoloji bölüm için gönderme gelince değil yerleştirilecek. Deneysel uzun süre başka bir noktadır. İnsan doku ile deneyler birçok saat sürer (genellikle > 6 h) (karşı benzer bir deney faresi veya fare rahim içinde 2-3 h), kasılma ve doku montaj ve spontan kurulması arasında 2-3 h lag zaman daha yavaş sıklığını sayesinde Kasılmalar. Ancak, insan dokusu kasılmalar biz gösterdiği gibi sağlam, ve sözleşme önemli yorgunluk40olmadan birçok saat için kuruldu.
Bu sistem aynı zamanda ilaç Kimyasalları hamile doku üzerinde test etmek yeteneği dahil aşılması gereken diğer sorunlar vivo içinde çalışma sağlar. Bu teknik kolayca sayede ilk sonuçları teyit devam etmeden önce fare dahil olmak üzere diğer türler için yaygınlaştırılması bütün hayvan çalışmaları daha. Sıcaklık kontrollü değişiklikleri, superfusate (PSS) ve pH kompozisyon kolayca farklı senaryolar içinde vivo taklit ve bu değişikliklerin etkisi bileşik davranışı çözümlemek için yapılabilir. Myometrial şeritler izometrik gerginlik ölçme temel ilkeleri de hücre içi kalsiyum konsantrasyonu veya pH eşzamanlı değişiklikleri ölçmek için Ca’nın floresan veya pH (H+) göstergeleri ve donanımları algılamak için kullandığı Genişletilebilir ve kayıt Floresans57,58,59,60.
Genel olarak, insan myometrium karakterize ve ilaç keşif roman terapötik bileşiklerin doğrulamak için sağlam ve fizyolojik olarak ilgili modelini gösteren — saf bileşikler ve karışımlar. Biz örnek kullanımı uyuşturucu keşif OT/VP sistemi ile ilgili olarak sağlanan ve bileşik etkinlik ve kudret tanımlanmış hedefte belirlemek ve ligand seçicilik doğrulamak için bu model nasıl kullanılacağını göstermek için OTR ve V1birR antagonistleri üzerinde duruldu. Ancak, o bu teknik faiz veya myometrial kasılma (ya da gevşeme) önde gelen yolu herhangi bir hedef çalışmaya gibi ilaç keşfi yeni hedefler ve yollar yardımcı olmak için kullanılabilir ve myometrial bizim anlayışı ilerletmek kaynaklı Fizyoloji ve patofizyolojisi.
The authors have nothing to disclose.
Bu araştırma projesi I3243 yoluyla Avusturyalı Bilim Fonu (FWF) ve Avrupa Birliği’nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (hibe sözleşmesi No 714366) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) tarafından desteklenmiştir. CWG bir Avustralya Araştırma Konseyi (ARC) gelecek arkadaş grubu (FT140100730) ve MM bir ark keşif erken kariyer araştırmacı (DECRA) Arkadaş grubu (DE150100784) tarafından desteklenmiştir. SA bir Harris-refah Preterm doğum Araştırma Merkezi refah, kadınlar, UK tarafından yönetilen Grant tarafından desteklenmektedir.
Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
HBSS | SIGMA | H9269 | |
Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
[Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |