Denna artikel beskriver experimentella protokoll för att studera ex vivo sammandragningar av mänskliga myometrium och deras tillämpning i läkemedelsutveckling. Denna teknik används för att förbättra förståelsen av myometrium fysiologi och patofysiologi samt att verifiera farmakologiska data från romanen forskning sonder eller drug leads.
Identifiering och karakterisering av nya läkemedelssubstanser eller biokemiska sonder lita på robust och fysiologiskt relevant analys system. Vi beskriva metoder för att mäta ex vivo myometriet kontraktilitet. Denna analys kan användas för att undersöka faktorer och molekyler inblandade i moduleringen av myometrium kontraktion och att fastställa deras retande eller hämmande åtgärder, och därmed deras terapeutiska potential i vivo. Biopsier erhålls från kvinnor som genomgår kejsarsnitt leverans med informerat samtycke. Fina strimlor av myometriet dissekeras, klipps och bifogas en kraftgivare inom 1 mL orgel bad superfused med fysiologisk koksaltlösning lösning vid 37 ° C. Strips utveckla spontana sammandragningar inom 2 – 3 h under inställd spänning och förblir stabila i många timmar (> 6 h). Remsorna kan också stimuleras för att kontrakt som av endogena hormoner, oxytocin och vasopressin, som orsakar koncentrationsberoende modulering av kontraktion frekvens, styrka och varaktighet, att mer likna sammandragningar i arbete. Effekten av kända och nya läkemedel leder kan därför testas på spontana och agonist-inducerad sammandragningar.
Detta protokoll Detaljer speciellt hur denna analys kan användas för att bestämma styrkan av kända och nya agenter genom att mäta deras effekter på olika parametrar för mänskliga myometrium kontraktion. Vi använder oxytocin- och V1a -receptorantagonister, atosiban och SR49059 som exempel på substanser som hämmar oxytocin och vasopressin-inducerad sammandragningar, och visar hur denna metod kan användas för att komplettera och verifiera farmakologiska data som erhållits från cell-baserat analyser till stöd läkemedelsutveckling. Effekterna av romanen agonister jämfört med oxytocin och vasopressin kan också betecknas. Medan vi använder exemplet med Oxytocinet / vasopressin systemet, denna metod kan också användas för att studera andra receptorer och jonkanaler som spelar en roll i livmoderns sammandragning och avslappning för att främja förståelsen av människans livmoder fysiologi och patofysiologi.
Målet med läkemedelsutveckling är att producera roman, potenta, och mycket selektiv ligander som genererar ett terapeutiskt svar genom att aktivera eller hämma cellulära signalvägar. Detta kräver en lämplig analys där att testa blyföreningar med tillförlitlig, robust och relevanta resultat1. Farmakologiska tekniker såsom ligand-receptorbindning och funktionella analyser använder ofta heterologa cell-baserat system, konstruerad till overexpress receptorer som annars inte skulle vara närvarande2. Medan dessa tekniker ger värdefulla insikter för receptorn farmakologi och tidig läkemedelsutveckling, kan uppgifterna återspeglar inte en sann i vivo -scenario. Det är därför viktigt att farmakologiska data från cell-baserat analyser valideras även i fysiologiskt relevanta modeller.
Glatt muskulatur i livmodern (myometrium) utgör den muskulösa lagret av livmodern som är ansvarig för värkarna under förlossningen att utplåna och vidga livmoderhalsen och leverera det fostret3. Sammandragning av myometriet är spontan; Det kräver inte hormonell eller nervös indata till kontrakt4. Värkarna är följd av spontan depolarisation av myometrium cellmembranen vilket leder till öppnandet av spänning manövrerade Ca2 +-kanaler (L-typ kanaler) och tillströmningen av Ca2 + in i cellen5. Kalcium komplex med calmodulin och aktiverar myosin light chain kinase som i sin tur phosphorylates myosin möjliggör cross bridge cykel formation med aktin och kontraktion. Avkoppling är typiskt medierad av avinstallation fosforylering av myosin av myosin fosfatas och en minskning av koncentrationen av Ca2 + via dess extrudering från cellen eller binda till sarkoplasmatiska nätmagen (SR)5,6 ,7.
Flera metoder har utvecklats för att studera myometrium funktion och dysfunktion, från i vivo interna och externa tocography och intrauterina trycket katetrar, till generation av omvandlade eller förevigade celler av myometrium ursprung8 ,9,10,11,12. Samtidigt som kultur cellsystem kan upptäcka om ett ämne kan fungera på cellnivå, kan remsor av vävnader inom orgel bad användas som verktyg för att mäta funktionella Svaren av hela vävnader till farmakologiska reagenser. Traditionell orgel badet är vanligtvis ett stort uppvärmt glas kammare som kan hålla mellan 5 och 50 mL fysiologisk koksaltlösning (PSS). Remsor i dessa stora kammare kräver normalt luftning med syre och stora volymer av PSS. Remsor av vävnad är dissekeras och upphängd i badning kammaren och bifogas en kraftgivare som mäter förändringar i spänningar, såsom under en sammandragning. Remsor av myometriet från både människor och djur inklusive, marsvin13, mus14, råtta15, kanin16och andra17,18, har använts av ett antal forskargrupper för att undersöka många frågor om myometrium fysiologi och patologi, inklusive prematura och dysfunktionella mödor. Till exempel myometrium remsor har använts för att identifiera faktorer som reglerar och ändra myogenic aktivitet19,20,21, bestämma organell funktion såsom SR22, samt utreda modulatorer av Jonen kanaliserar23,24,25,26, pumpar och värmeväxlare27 för att fastställa deras roll i myometrium fysiologi.
Denna ex vivo -teknik möjliggör bedömning av vävnad kontraktion prestanda och den direkta effekten av olika agenter på parametrarna för kontraktion skall mätas inklusive, kontraktion kraft (styrka), frekvens och varaktighet, samt integration av dessa värden, att skapa ett index av totala arbete (integrerad medelkraft eller arean under kurvan, AUC). Som isolerade vävnad strip preparatet utgör en modell för mer än en celltyp, kan det fysiologiska svaret av hela vävnad mätas. Den orgel bad och isolerade vävnad strip är därför ett användbart verktyg för att ge bron mellan cell kulturarbete och hela djuret /i vivo arbete. Därav, inom läkemedelsutveckling, effekterna av romanen agenter när det gäller deras excitatoriska (dvs, stimulerande) eller hämmande (dvs, avkoppling) potentiella i vivo kan mer noggrant bedömas. Denna teknik användes framgångsrikt i utvecklingen av oxytocin- och V1a-receptorn (OTR och V1aR) antagonist atosiban som tokolytiskt medel hämmar prematura arbete sammandragningar och fördröja prematur förlossning. In vitro test av atosiban på myometrium remsor hittade antagonisten kan avsevärt minska oxytocin (OT)-inducerad sammandragningar28,29,30. Allt dessa studier bidragit till att validera translationell värdet av atosiban och genererade proof-of-concept data behövs för att ta den vidarebefordra till kliniska prövningar31,32,33,34 . Atosiban är nu allmänt används som drogen av primat fördröja arbetskraft i Europa. Liknande proof-of-concept studier utfördes för att oxytocin analoga karbetocin att visa sin terapeutiska potential att förebygga post-partum blödningar35,36,37. Andra blyföreningar för närvarande under utveckling med denna analys inkluderar retosiban (GSK221149A)38 och nolasiban (opublicerade data). Dessa metoder har också använts framgångsrikt att jämföra mellan patientgrupper39,40,41,42,43,44, 45,46,47 och undersöka inom arten skillnader.
Här beskriver vi användningen av isolerade ex vivo vävnad remsor från gravid mänskliga myometriet inom små (1 mL) skräddarsydda orgel bad för att illustrera hur denna metod kan användas för att komplettera och validera farmakologiska uppgifter som erhållits från cell-baserat analyser . Biopsier erhölls till stor del från kvinnor som genomgår före labor elektiva kejsarsnitt (CS) leverans eftersom de är planerad operation och därmed är lättare att schemalägga biopsi samling, har enkel tillgång till myometriet, och vävnader kommer inte utsatts för någon uterotona stimulantia eller muskelavslappnande medel före operation. Biopsier kan dock fås från kvinnor som genomgår oplanerade (akuta) CS leverans i arbete ger det finns tillräcklig tid att fullt samtycker patienten. De flesta biopsier erhålls under operation från lägre livmoder segment på platsen för kirurgiska snitt, men det är också möjligt att erhålla prover från de övre segment48,49. I några fall efter vaginal förlossning, har punch biopsier från placenta sängen också erhållits50. Men detta är inte den mest konventionella rutten och myometrium vävnad Hämtad är liten. Icke-gravida myometriet kan erhållas från före eller postmenopausala kvinnor som genomgår hysterektomi för godartade gynekologiska tillstånd. En full tjocklek biopsi är samplade efter patologi undersökning, från det lägre corpuset bort från livmoderhalsen, och livmoder tas från mitten av livmoderväggen undvika serös och livmodercancer ytorna.
Medan de flesta läkemedelsutveckling är avsett för behandling av mänskliga sjukdomar, sker mest grundläggande forskning främst i djurvävnader. Här, beskriver vi metoder för att undersöka ex vivo sammandragningar av mänskliga myometriet erhållits från kirurgi som kan användas för att ta itu med ett antal viktiga frågor relaterade till livmoderns fysiologi och patologi, samt för att validera funktionella Svaren till kända och nya farmakologiska agenter till stöd läkemedelsutveckling. I synnerhet belysa vi användningen av denna analys att undersöka antagonistiska svaret av en känd OTR och V1aR kompetitiv antagonist, atosiban på OT-inducerad gravid myometrium sammandragningar, samt att fastställa svar och receptor selektivitet av en nyutvecklad selektiv V1aR antagonist, [D-Arg8] INT. Vi visar att viktiga farmakokinetiska parametrar såsom EG50 och IC50 kan beräknas, vilket överensstämmer väl med cell-baserad farmakologi data.
Använda flera remsor samtidigt möjliggör direkt jämförelse av flera agent effekter, konkurrens experiment med antagonister och lämplig tid och fordonet kontroller. Remsor är ofta beredda i grupper om 2, 4 eller 8, ger denna teknik måttlig genomströmning, möjliggör testning av 2 – 4 föreningar vid 6 – 8 (kumulativa) koncentrationer (per biopsi). Denna metod ger också data i realtid så att effekterna kan bedömas snabbt och protokoll kan justeras. Dessutom, denna teknik kan användas för att testa någon förening av intresse och har använts framgångsrikt av ett antal forskargrupper fokuserade på myometrium fysiologi och i läkemedelsutveckling. Förutom att analysera rena föreningar som beskrivs i denna uppsats, livmoderns kontraktilitet modellen har också och kan användas framgångsrikt för att skärmen för romanen uterotona föreningar från blandningar, såsom naturläkemedel från traditionell medicin7 , 55 , 56.
Även denna modell är tekniskt robust och visar bra reproducerbarhet, det har vissa begränsningar: dissektion kan vara svårt för dem obekanta med vävnaden eller använder dissektion utrustning, därav nya användare kommer att kräva tid att optimera vävnad förberedelser och protokoll. Det bör också noteras att mänskliga myometriet skiljer sig avsevärt i utseende till andra modeller såsom råtta och mus. De flesta gnagare livmödrar består av två tub-liknande livmoderns horn, var komplett med en äggstock i ena änden och gick på livmoderhalsen. Varje horn har klart definierade längsgående och cirkulära muskellager, som lätt kan avskiljas vid dissektion medan de olika fiber typerna i mänskliga myometriet är ofta sammanflätade bildar en ”mesh”. Dessutom är kontraktion profiler av mänskliga myometriet mycket olika till gnagare. Mest noterbart är är sammandragningar i mänskliga myometriet färre men längre varaktighet. Experimentell tidsramar för att arbeta med människors myometriet är därför ofta mycket längre än gnagare modeller. Skillnader i receptoruttryck mellan arter kan också bidra till ganska markanta skillnader i Svaren till agonister och detta bör erinras om extrapolera resultat mellan arter.
Det finns också antal steg som måste beaktas att maximera utdata från detta system. Kritiska steg omfattar bevarande av vävnad livskraft såsom ta hand vid hantering av vävnader för att undvika onödig skada under dissektion eller vid montering. En skicklig ögat krävs att dissekera fina strimlor av livmoderns muskler, garanterar orienteringen av muskelfibrer i den longitudinal riktningen och efter planet av vävnad, samt undvika ärrvävnad, decidua och små fartyg. För att underlätta orientering ändamål när preparatet är i laboratoriet, är det möjligt att lägga till en etikett (till exempel små kirurgiska stitch) vid tidpunkten för insamling till ena sidan av biopsin att avgränsa serös kanten från decidual kant.
Vävnader bör hållas vid en stadig 36 – 37 ° C under experiment som vävnad funktion är föremål för temperaturförändringar. Detta kan uppnås med en robust luftkonditionering enhet inom laboratoriet. Konstant genomblödning av värmde PSS säkerställer temperaturen bibehålls samt genomspolning av restprodukter från kontraktion. Temperaturen inom orgel badet kan ändras genom att ändra flödet eller justera vattentemperaturen bad direkt. Små badkar storlek jämfört med traditionella 5-50 mL bad säkerställer en relativt snabb omsättning av PSS och blekt av reagenser. Miniatyriserade orgel badet minskar som beskrivs här, också mängden PSS och reagenser av intresse behövs, vilket minimerar kostnaderna och skona värdefulla, nyutvecklade kemikalier. Dessutom, på grund av små badkar storlek och använder en HEPES-baserad buffert, kräver detta system inte syresättningen t.ex., av bubblande PSS med carbogen. Standardisering av spänning appliceras till remsorna är också viktigt. För remsor av denna storlek (5 x 2 x 1 mm), bör detta vara cirka 2 mN (motsvarar ~0.2 g). Alternativa metoder inkluderar tillämpningen av en hög kalium lösning att framkalla maximal kontraktion och stretching till hälften av detta maximal kontraktion. Det måste dock noteras, att spänning appliceras i vivo skilja.
Utmaningar inkluderar att få vävnader från försökspersoner, men även om beskattning, mänskliga vävnader tydligt representerar de mest fysiologiskt relevanta (och givande) modell för att studera livmoderns sammandragning i mänskliga sjukdomar och drug discovery. Den isolerade vävnad remsor dock inte nödvändigtvis likställer till vävnad i vivo som de är undantagna exempelvis av hormonella och nervös ingång som, även om inte nödvändigt för kontraktion, kommer att modulera sammandragningar i vivo. Denna analys men ger möjlighet att analysera myometrium sammandragningar på ett kontrollerat sätt, åtskilda från sådana influenser. Det tillåter också för effekten av faktorer såsom hormonella kontroll av kontraktion (t.ex., via VP, prostaglandiner, OT, etc.) för att undersökas, som ger ledtrådar till regleringen av myometrium funktion. Som vävnader erhålls från olika kvinnor, finns det naturligtvis viss variation i spontana kontraktila profiler mellan exemplar. Därför är det ofta nödvändigt att utföra experiment på ett stort antal (~ n = 10) av prover att minimera variationen i vissa datamängder53. Detta är viktigast när man jämför kontraktila aktivitet mellan olika patientgrupper. Normalisera agonister och antagonister att styra aktiviteten svar (dvs.att uttrycka som en procentandel av kontroll aktivitet eller hög K+) minskar vissa av denna variation. För att minska mellan strip variationen kan dessutom data normaliseras för att band cross sectional område genom att mäta deras längd och vikt post experimenterande41. Detta är särskilt användbart när du jämför kontraktion mönster mellan olika patientgrupper.
Begränsningar av denna teknik har även tillgång till färska vävnader som kräver goda arbetsrelationer med sjukhuspersonal, särskilt teater personalen och de inblandade i processen samtycke. Etiska behörigheter från den lokala forskningsetisk kommitté och institutet eller sjukhus Granskningsnämnden måste också vara på plats. Samling av mänskliga myometriet sannolikt utförs under CS leverans, när givaren genomgår kirurgi. Biopsin tas från samma livmoder snitt plats gjord för att leverera barnet och patienten behöver därför inte genomgå någon ytterligare förfaranden. Teater personalen och kirurgen utför biopsi behöver göras medvetna om senare användning av vävnader och att de inte ska placeras i fixativ lösningar sådant som för skicka till en patologiavdelningen. Länge experimentell tidsramen är en annan faktor. Experiment med mänskliga vävnader ta många timmar (normalt > 6 h) (i motsats till 2 – 3 h för ett liknande experiment i råtta eller mus livmoder), på grund av långsammare frekvensen av sammandragning och den 2 – 3 h fördröjning mellan vävnad montering och inrättandet av spontana sammandragningar. Men som vi har visat, mänsklig vävnad sammandragningar är robust, och när etablerade kan kontraktet för många timmar utan betydande trötthet40.
Detta system tillåter också andra utmaningar i vivo arbete att övervinna inklusive möjligheten att testa farmaceutiska reagens på gravid vävnad. Denna teknik kan lätt extrapoleras till andra arter, inklusive mus whereby första resultaten kan bekräftas innan du fortsätter ytterligare i hela djurstudier. Kontrollerad förändringar i temperatur, sammansättning av superfusate (PSS) och pH kan göras lätt att härma olika scenarier i vivo och analysera effekten av dessa förändringar på sammansatta beteende. De grundläggande principerna för mäta isometrisk spänning i myometrium remsor kan också utökas till mäta samtidiga ändringar i intracellulära kalciumkoncentration eller pH med hjälp av fluorescerande Ca eller pH (H+) indikatorer och utrustning för att upptäcka och spela in fluorescens57,58,59,60.
Sammantaget mänskliga myometriet representerar en robust och fysiologiskt relevant modell att karakterisera och validera nya terapeutiska föreningar i läkemedelsutveckling — både rena föreningar och blandningar. Vi har exempel på dess användning i läkemedelsutveckling med avseende på det OT/VP-systemet och fokuserade på OTR och V1enR antagonister att visa hur denna modell kan användas för att bestämma sammansatta effekt och styrka på definierade mål och validera ligand selektivitet. Dock bör påpekas att denna teknik kan användas för att studera alla mål av intresse eller väg som leder till myometrium kontraktion (eller avkoppling), samt till stöd drog upptäckten av nya mål och vägar, och avancera vår förståelse av myometrium fysiologi och patofysiologi.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har stötts av den österrikiska Science fond (FWF) genom projektet I3243 och den Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horisont 2020 för forskning och innovation (bidragsöverenskommelse nr 714366). CWG har understötts av en australiensisk forskning Council (ARC) framtid Fellowship (FT140100730) och MM ett ARC Discovery tidiga karriär forskare (DECRA)-stipendium (DE150100784). SA stöds av Harris-välbefinnande prematura födseln centrala forskningsbidrag administreras av välbefinnande för kvinnor, UK.
Origin software | Origin Lab | 2015 version | |
Labscribe Software | WPI | Formally Datatrax | |
GraphPad Prism graphical software | GraphPad Prism | PRISM 5 | |
LabTrax 4-Channel Data Acquisition | WPI | LAB-TRAX-4 | |
Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | |
Force-displacement Transducer | WPI | FORT10g | 10 g |
BNC to BNC Cable | WPI | 500184 | |
Magnetic Clamp stand | WPI | M10 | |
Micrometer | Reconditioned from microscopes | ||
Peristaltic pump | Gilson | MINIPULS3 | R4 Standard pump head |
Suction pumps | Various | AP2 air pump | |
Circulating Water bath | Grant Instruments | TC120 | 5L |
Perspex Tissue Bath | Custom made | ||
Water reservoir container | the reallyusefulbox | 7L | |
Tissue Hooks (fixed) | Hand made in house | ||
Peristaltic tubing | Gilson | F117948 | PVC 2.79 mm internal diameter |
Tygon Tubing | Fisher Scientific | various diameters | R-3603 |
Aluminium clips | Laser services, USA | custom made | |
Stereo Zoom binocular microscope | WPI | PZMIV | |
Microscope Fiber-optic Light Source | WPI | PHOTONIC PL 2000 | |
Dissecting Dishes | Handmade with Sylgard | ||
Sylgard Silicone Elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 170 Kit | |
Vannas Scissors | WPI | 50086 | 8.5 cm, straight edge |
Iris Forceps | WPI | 15914 | 10 cm, straight edge (serrated) |
Dissecting scissors | WPI | 14393 | 10 cm, straight |
Dissecting pins | SIGMA | Z192341 | B-D precision guide syringe needle 30G |
HBSS | SIGMA | H9269 | |
Physiological Salt Solution | SIGMA | various | PSS |
Oxytocin acetate salt | SIGMA | O6379 | |
[Arg8]-vasopressin acetate salt | SIGMA | V9879 |